CN114657114B - 一种大肠杆菌感受态细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及微生物技术领域，具体公开了一种大肠杆菌感受态细胞及其制备方法。一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法包括以下步骤：大肠杆菌单菌落的基础培养；取培养物在25‑30℃，200rpm的条件下振荡培养至OD600值为0.55‑0.6，制得菌悬液；将所述菌悬液转移到预冷的无菌离心管中，冰浴后，离心弃上清，保留细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入浓度为0.5‑1.5mM预冷的氯化钙溶液和浓度为0.1‑0.5%的非离子有机硅表面活性剂，冰浴后，离心弃上清，即得感受态细胞。大肠杆菌感受态细胞的转化率在1.01×109 cfu/μg以上。
Description
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，更具体涉及一种大肠杆菌感受态细胞及其制备方法。
背景技术
感受态是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，经过一些特殊方法处理后，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点。
目前，制备感受态细胞主要有CaCl2法和Inoue法。CaCl2法的操作简便，但是感受态细胞的转化效率较低。利用Inoue法制得的感受态细胞具有较高的转化率，但是Inoue法的操作过程较为繁琐，对工艺条件要求也较为严格，此外，培养时间较长。
因此，需要一种操作简单且使感受态细胞具有较高转化率的方法。
发明内容
为了使感受态细胞具有较高的转化率，同时制备过程简单，本申请提供了一种大肠杆菌感受态细胞及其制备方法。
第一方面，本申请提供了一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1：大肠杆菌单菌落的基础培养；
S2：取步骤S1中的培养物振荡培养，制得菌悬液；
S3：将所述菌悬液转移到预冷的无菌离心管中，冰浴后，离心弃上清，保留细胞沉淀；
S4：向所述细胞沉淀中加入预冷的氯化钙溶液和非离子有机硅表面活性剂，冰浴后，离心弃上清，即得感受态细胞。
在本申请中，首先将购买的大肠杆菌进行复溶培养，在冷冻管中加入冻干大肠杆菌菌株和复溶液，轻轻振荡，使冻干大肠杆菌菌株溶解呈悬浮状；挑取单菌落加入培养基中进行基础培养，在25-30℃，200rpm的条件下振荡培养10-16h，制得基础培养物。将基础培养物加入到新的培养基中进行扩增培养，在25-30℃，200rpm的条件下，振荡培养至OD600值为0.55-0.6，获得菌悬液。然后将菌悬液加入预冷的无菌离心管中，冰浴10min后，在4℃，4000rpm下离心去除上清，保留细胞沉淀。最后，向细胞沉淀中加入氯化钙溶液和非离子有机硅表面活性剂，冰浴10min后，在4℃，4000rpm下离心去除上清，即得感受态细胞。
本申请中通过氯化钙和非离子有机硅表面活性剂的相互配合，使大肠杆菌细胞表面正电荷增加，通透性增加，提高大肠杆菌感受态细胞的转化率，大肠杆菌感受态细胞的转化率在1.01×109cfu/μg以上，进而提高外源DNA分子的通过率。
在一个实施方案中，所述非离子有机硅表面活性剂为Silwet L-77、Silwet-408、Silwet-618或Silwet-625。
有机硅表面活性剂是以聚二甲基硅氧烷为疏水主链，在其中间位或端位连接一个或多个有机硅极性基团而构成的一类表面活性剂。机硅表面活性剂按其化学结构中亲水基团R的化学性质可分为阴离子型、阳离子型、非离子型、和两性离子型4大类。非离子有机硅表面活性剂是R基团中含有聚醚、烷醇酰胺、酯、糖苷等单元。本申请所用Silwet L-77、Silwet-408、Silwet-618和Silwet-625中有效成分为聚环醚改性聚二甲基硅氧烷，属于非离子有机硅表面活性剂。
在本申请中，Silwet L-77、Silwet-408、Silwet-618或Silwet-625与氯化钙配合使用后，能够提高大肠杆菌感受态细胞的转化率，使转化率在1.03×109cfu/μg以上。当Silwet L-77、Silwet-408、Silwet-618和Silwet-625的浓度相同时，大肠杆菌感受态细胞的转化率由高到低依次为Silwet L-77、Silwet-408、Silwet-618和Silwet-625。
在一个实施方案中，所述非离子有机硅表面活性剂的浓度为0.1-0.5％。
在一个实施方案中，所述非离子有机硅表面活性剂的浓度为0.1-0.3％。
在一个实施方案中，所述非离子有机硅表面活性剂的浓度为0.3％。
在本申请中，非离子有机硅表面活性剂的浓度为0.1-0.5％，大肠杆菌感受态细胞的转化率在1.03×109cfu/μg以上。当非离子有机硅表面活性剂的类型相同，氯化钙的浓度保持不变时，随着非离子有机硅表面活性剂的浓度逐渐增大，大肠杆菌感受态细胞的转化率逐渐升高。非离子有机硅表面活性剂的浓度大于0.3％，大肠杆菌感受态细胞的转化率基本没有改变。
在一个实施方案中，所述氯化钙的浓度为0.5-1.5mM。
在本申请中，mM为毫摩尔每升。当非离子有机硅表面活性剂选用相同的类型且浓度保持相同时，随着氯化钙的浓度的逐渐增加，大肠杆菌感受态细胞的转化率呈现先升高后下降的趋势。当氯化钙的浓度为1.0mM时，与非离子有机硅表面活性剂相互配合，大肠杆菌感受态细胞的转化率较高。
在一个实施方案中，所述培养的温度为25-30℃。
在本申请中，大肠杆菌培养的温度为25-30℃，获得菌悬液，再通过离心分离得细胞沉淀，再向细胞沉淀中加入氯化钙溶液和非离子有机硅表面活性剂，制得感受态细胞，感受态细胞的转化率在1.01×109cfu/μg以上。在本领域中，大肠杆菌培养的最佳温度为37℃，在此温度下培养后经过分离、加入氯化钙溶液和非离子有机硅表面活性剂等操作后，制得感受态细胞，感受态细胞的转化率仅为0.49×109cfu/μg。
在一个实施方案中，振荡培养至OD600值为0.55-0.6。
OD600是指菌悬液在600nm波长处的吸光值，能够反应出菌悬液的浓度，一般地，利用紫外分光光度计进行测量。
在一个实施方案中，所述步骤S2中利用SOB液体培养基进行培养。
SOB液体培养基包括胰蛋白胨20g，酵母粉5g，氯化钠0.5g，氯化钾0.186g，氯化镁0.95，加入蒸馏水，定容至1L，搅拌使其充分溶解，pH7.1，在121℃高压灭菌15min，即得SOB液体培养基。
在一个实施方案中，所述步骤S1中利用LB液体培养基进行培养。
LB液体培养基包括蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加入蒸馏水定容至1L，pH7.0，在121℃灭菌25min，即得LB液体培养基。
第二方面，本申请提供了一种大肠杆菌感受态细胞，所述大肠杆菌感受态细胞通过本申请所述大肠杆菌感受态细胞的制备方法制得。
通过本申请中的制备方法获得一种大肠杆菌感受态细胞，在氯化钙和非离子有机硅表面活性剂的共同作用下，再结合培养温度和生长密度等条件下，使大肠杆菌感受态细胞具有较高的转化率，具有较高的应用价值。本申请中的制备方法操作简单，易于实现。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请采用氯化钙和非离子有机硅表面活性剂的相互配合，可以提高大肠杆菌感受态细胞的转化率；大肠杆菌感受态细胞的转化率在1.01×109cfu/μg以上；
2、本申请中非离子有机硅表面活性剂优选采用为Silwet L-77，大肠杆菌感受态细胞的转化率较高；
3、本申请的制备方法，非离子有机硅表面活性剂的浓度0.3％(v/v)，氯化钙溶液的浓度为1.0Mm，大肠杆菌感受态细胞的转化率较高。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
原料
如无特殊说明，本申请中所用原料、器材均可通过市售获得。
Silwet L-77，购自于杭州晓柚生物科技有限公司；
Silwet 408，购自于诺农(北京)国际生物技术有限公司；
Silwet 618，购自于诺农(北京)国际生物技术有限公司；
Silwet 625，购自于诺农(北京)国际生物技术有限公司；
大肠杆菌Top10购自于北京华越洋生物NRR00710；
BL21(DE3)购自于北京华越洋生物NRR01210；
DH5α购自于北京华越洋生物NRR01060；
JM109购自于北京华越洋生物NRR00990；
HB101购自于北京百奥莱博科技有限公司；
SOB液体培养基购自于上海士锋生物科技有限公司。
实施例
实施例1
大肠杆菌Top10感受态细胞的制备方法包括以下步骤：
S1：大肠杆菌单菌落的基础培养；将大肠杆菌Top10在无抗生素LB平板上划线，28℃培养12h；挑取新活化的大肠杆菌单菌落至3ml LB液体培养基中，在28℃，200rpm的条件下振荡培养过夜，制得培养物；
其中LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1L，pH7.0，121℃灭菌25min；
S2：量取1mL步骤S1中的培养物，将培养物加入到100mL的SOB液体培养基中，28℃，200rpm的条件下振荡培养至OD600值为0.57，制得菌悬液；
S3：将步骤S2中制得的菌悬液转移到预冷的无菌离心管中，冰浴20min后，在4℃，4000rpm下离心，去除上清，保留细胞沉淀；
S4：向所述细胞沉淀中加入10mL浓度为1mM预冷的氯化钙溶液和5mL浓度为0.15％的非离子有机硅表面活性剂，冰浴10min后，在4℃，4000rpm下离心，去除上清，即得感受态细胞；
其中非离子有机硅表面活性剂为Silwet L-77；
S5：保存，在感受态细胞中加入0.5ml的无菌甘油，分装于Eppendorf管，100μl/管，在-80℃冰箱中冻存。
实施例2-18与实施例1的区别如表1所示。
表1实施例2-18与实施例1的区别
实施例19
实施例19与实施例2的区别在于，在步骤S2中，实施例19中培养的温度为25℃。
实施例20
实施例20与实施例2的区别在于，在步骤S2中，实施例20中培养的温度为30℃。
对比例
对比例1
对比例1与实施例2的区别在于，对比例1中不加入非离子有机硅表面活性剂Silwet L-77。
对比例2
对比例2与实施例2的区别在于，对比例2中不加入氯化钙溶液。
对比例3
对比例3与实施例2的区别在于，在步骤S2中，对比例3中培养的温度为37℃。
性能检测试验
1、转化率的检测
通过上述实施例1-20和对比例1-3获得感受态细胞，分别检测感受态细胞的转换率，具体检测过程包括以下步骤：
取一管(100μl)感受态细胞，在冰上融化后加入1μl浓度为10pg/μl的pUC19 DNA，混匀，冰中放置30min；于42℃热击60s；快速将管移到冰浴中，冷却3min；每管加900μlLB培养基，在37℃，180rpm复苏45min；将100μl已转化的感受态细胞涂布于抗性平板上，在37℃培养14h后菌落计数，重复转化实验三次，计算平均转化效率。具体检测结果如表2所示。
表2检测结果
结合实施例1-20和对比例1-3并结合表2可以看出，由实施例1-20制备的大肠杆菌Top10感受态细胞具有较高的转化率，感受态细胞的转化率1.01×109cfu/μg以上，尤其是实施例2制备获得的感受态细胞，感受态细胞的转化率为1.56×109cfu/μg；
结合实施例1-12并结合表2可以看出，在制备感受态细胞时，当氯化钙溶液的浓度保持不变，非离子有机硅表面活性剂的浓度相同，选用不同类型的非离子有机硅表面活性剂时，大肠杆菌感受态细胞的转化率由高到低依次为Silwet L-77、Silwet-408、Silwet-618、Silwet-625。
结合实施例1-12并结合表2可以看出，在制备感受态细胞时，选用相同类型的非离子有机硅表面活性剂，当氯化钙溶液的浓度保持不变，随着非离子有机硅表面活性剂的浓度逐渐升高，感受态细胞的转化率也随之升高；当非离子有机硅表面活性剂的浓度大于0.3％时，感受态细胞的转化率基本保持不变。
结合实施例1、13和14，实施例2、15和16，实施例3、17和18并结合表2可以看出，非离子有机硅表面活性剂为Silwet L-77，当Silwet L-77的浓度不变时，感受态细胞的转化率随着氯化钙溶液的浓度先升高后下降。
结合实施例2和对比例1-2并结合表2可以看出，在制备感受态细胞过程中，需要氯化钙溶液和非离子有机硅表面活性剂的相互配合，感受态细胞的转化率为1.56×109cfu/μg。当在制备过程中不加入氯化钙溶液或非离子有机硅表面活性剂时，感受态细胞的转化率为0.078×109cfu/μg。
结合实施例2、19、20和对比例3并结合表2可以看出，培养温度为25-30℃时，感受态细胞具有较高的转化率，感受态细胞的转化率在1.01×109cfu/μg以上。当培养温度为37℃时，感受态细胞的转化率为0.49×109cfu/μg。
2、不同大肠杆菌转化率的检测
将实施例1中的大肠杆菌Top10更换为大肠杆菌DH5α、HB101、JM109、BL21(DE3)，培养过程均与实施例1相同，检测不同大肠杆菌的转化率，具体检测结果如表3所示。
表3不同大肠杆菌转化率的检测结果
| 组别 | 转化效率(x109 cfu/μg) |
| DH5α | 1.26±0.32 |
| HB101 | 1.16±0.39 |
| JM109 | 1.35±0.48 |
| BL21(DE3) | 1.31±0.44 |
从表3中可以看出，利用本申请的制备方法，对不同大肠杆菌具有广泛适用性。本申请的制备方法操作简便，易于实现，且时间较短。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本申请的原理而采用的示例性实施方式，然而本申请并不局限于此。对于本领域内的技术人员而言，在不脱离本申请的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：大肠杆菌单菌落的基础培养；
S2：取步骤S1中的培养物振荡培养，制得菌悬液；
S3：将所述菌悬液转移到预冷的无菌离心管中，冰浴后，离心弃上清，保留细胞沉淀；
S4：向所述细胞沉淀中加入预冷的氯化钙溶液和非离子有机硅表面活性剂，冰浴后，离心弃上清，即得感受态细胞;
所述非离子有机硅表面活性剂为Silwet L-77、Silwet-408、Silwet-618或Silwet-625;
所述非离子有机硅表面活性剂的浓度为0.1-0.5%;
所述氯化钙的浓度为0.5-1.5mM;
在步骤S1和步骤S2中，所述培养的温度为25-30℃。
2.根据权利要求1所述大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述非离子有机硅表面活性剂的浓度为0.1-0.3%。
3.根据权利要求1所述大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，振荡培养至OD600值为0.55-0.6。
4.根据权利要求1所述大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中利用SOB 液体培养基进行培养。
5.根据权利要求1所述大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中利用LB 液体培养基进行培养。
6.一种大肠杆菌感受态细胞，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞通过权利要求1-5任一项所述大肠杆菌感受态细胞的制备方法制得。
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