CN114651726B - 一种楠木种胚无菌苗的培养方法 - Google Patents

一种楠木种胚无菌苗的培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114651726B
CN114651726B CN202210479441.9A CN202210479441A CN114651726B CN 114651726 B CN114651726 B CN 114651726B CN 202210479441 A CN202210479441 A CN 202210479441A CN 114651726 B CN114651726 B CN 114651726B
Authority
CN
China
Prior art keywords
embryo
phoebe
seeds
culture
washing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210479441.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114651726A (zh
Inventor
赵丹
谢娜
王建存
赵德刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou University
Original Assignee
Guizhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou University filed Critical Guizhou University
Priority to CN202210479441.9A priority Critical patent/CN114651726B/zh
Publication of CN114651726A publication Critical patent/CN114651726A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114651726B publication Critical patent/CN114651726B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting
    • A01C1/08—Immunising seed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/002—Culture media for tissue culture

Abstract

本发明提供一种楠木种胚无菌苗的培养方法，包括如下步骤：1)对楠木种子进行预处理，选取种子并置于培养皿中，将种皮划开，冲洗，得到种胚；2)将得到的种胚，用无菌水冲洗，用乙醇溶液浸泡1.8‑2.2min后，无菌水冲洗，然后加入升汞溶液消毒18‑20min后，用无菌水冲洗，得到消毒后的种胚；3)将所述消毒后的种胚吸干表面水分，用解剖刀切掉78％‑82％的子叶，选取带有18％‑22％子叶的胚，接种至添加1.8‑2.2mg/L赤霉素GA3的MS培养基中进行萌发培养，得到无菌苗。本发明属于植物组织培养技术领域，使用楠木种子进行培养，存活率控制在75％以上，污染率控制在10％以下，萌发率达到90％以上。

Description

一种楠木种胚无菌苗的培养方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种楠木种胚无菌苗的培养方法。
背景技术
楠木(Phoebezhennan S.W.Lee etF.N.Wei)为樟科(Lauraceae)楠属(Phoebe)亚热带常绿大乔木，楠木又称桢楠，是我国特有的园林绿化树种和珍贵用材树种。根据《博古要览》，楠木可分为三种：香楠、金丝楠木和水楠。在我国，楠木主要分布在贵州西北部、湖北西部、四川及重庆。由于人类长期以来的过度伐用、楠木生长发育缓慢及人工培育技术不完善等，造成了目前楠木资源破坏严重，开展楠木组培技术研究是楠木资源保护和良种选育的方法之一。
植物组织培养是利用其细胞具有全能性的特定再人工施以干预引导的环境，将择选消毒后的外植体置入特定培养基中诱导并形成完整植株的过程。外植体无菌体系的建立是楠木组培技术研究的前提条件。目前楠木组培研究的外植体多选择嫩叶或带腋芽的茎段，比如魏欢平等发表的题为“桢楠愈伤组织诱导初探”的论文，然而利用种子培养无菌苗作为外植体的研究则鲜有报道。利用种子培养无菌苗的优点是不受外界环境限制，任何时候都可以制备，且获得无菌苗的叶、茎、子叶节以及下胚轴等均可作为组培技术研究，同时也存在如下不足之处：消毒往往不彻底，容易污染，种子发芽慢，发芽时间较长，发芽率低。楠木种子的污染率相对较高，通常高达50％以上，其原因可能是由于种子的种皮自带内生菌。余云云的硕士学位论文“桢楠组培技术研究”公开了：桢楠带芽茎段的最佳消毒措施是以0.1％HgCl2溶液处理4.5min，污染率控制在40％左右，且萌发率最高，达到了68.42％。在此基础上增加处理时间，以0.1％HgCl2施以5.5-15min时的污染率没有区别，但是芽萌发率却降到了15.39％。以0.1％升汞浸泡外植体3.0-3.5min，或者用不同浓度的NaClO溶液浸泡15min时，污染率突增，污染率达到了90％左右。可见，通过延长消毒时间的方式来控制污染率，很可能导致芽萌发率的降低。
现有技术尚未发现使用楠木种子培养无菌苗的报道，使用楠木种子进行无菌苗培养的方法，在控制污染率的同时提高发芽率具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种楠木种胚无菌苗的培养方法，使用楠木种子进行培养，通过消毒剂的组合及时间控制，并使用添加特定浓度赤霉素GA3的MS培养基进行萌发培养，使存活率控制在75％以上，污染率控制在10％以下，萌发率达到90％以上。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
一种楠木种胚无菌苗的培养方法，包括如下步骤：
1)对楠木种子进行预处理，选取颗粒饱满、无病虫害的种子并置于培养皿中，将种皮划开，冲洗，得到种胚；优选地，用解剖刀将种皮划开，尽可能保持子叶的完整，注意不要伤害种胚；
2)将步骤1)得到的种胚，在超净工作台或生物安全柜中用无菌水冲洗，用乙醇溶液浸泡1.8-2.2min后，无菌水冲洗，然后加入升汞溶液消毒18-20min后，用无菌水冲洗，得到消毒后的种胚；
3)将所述消毒后的种胚吸干表面水分，用解剖刀切掉78％-82％的子叶，选取带有18％-22％子叶的胚，接种至添加1.8-2.2mg/L赤霉素GA3的MS培养基中进行萌发培养40-60d，得到无菌苗。
优选地，所述步骤1)中的预处理包括如下步骤：将楠木种子用0.4％-0.6％质量百分含量的高锰酸钾溶液浸泡40-80min，洗净阴干，在含1.5％-2.5％质量百分含量的洗洁精水溶液中浸泡8-12min，将漂浮在水面的发育不完整及干瘪种子挑出。通过预处理，将不够理想的种子及时挑出，便于选取颗粒饱满、无病虫害的种子进行培养。
优选地，所述乙醇溶液的体积分数为75％，浸泡时间为2min。
优选地，所述升汞溶液的质量分数为0.1％，消毒时间为18min。乙醇溶液和升汞溶液的消毒时间相配合，在75％体积分数的乙醇溶液浸泡消毒2min后，使用0.1％质量分数的升汞溶液消毒时间18min，此时的存活率高达85％以上，污染率低于7％。升汞溶液的浓度应较低，否则容易对外植体造成伤害。
优选地，所述萌发培养的条件包括：培养温度为(25±2)℃、光照/黑暗周期为11-13h/11-13h、光照强度为2000-2500lx。
优选地，所述赤霉素GA3的浓度为2mg/L。赤霉素GA3的浓度较低，发芽时间低至7-20d，萌发率高达90％以上。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明技术可以随时进行无菌苗制备，解决了现有技术采集嫩叶或腋芽为消毒外植体的方法存在的受季节限制的问题。
(2)本发明发现楠木种子在消毒过程中，如果消毒剂浓度和消毒时间不够合理，则会造成种子污染率和死亡率严重，并进而导致发芽率受抑制等问题。本发明采用75％乙醇溶液结合0.1％升汞溶液浸泡消毒的方法，用解剖刀切除大部分子叶(以减少污染率)，并利用特定浓度赤霉素对楠木种子萌发的促进作用，提高了消毒的彻底性，降低了污染率和死亡率，增加了种子的萌发率，提高了楠木无菌苗的获得效率。
附图说明
图1楠木种胚萌发过程示意图；其中1-A为种胚刚放入MS培养基时的示意图；1-B为种胚萌发7天时的示意图；1-C为种胚萌发40天时的示意图；1-D为种胚萌发60天得到的无菌苗示意图。
图2不同GA3浓度对种胚培养20天的影响结果示意图；其中，2-A为不含GA3的MS培养基萌发幼苗结果示意图；2-B为添加1mg/L GA3的MS培养基萌发幼苗结果示意图；2-C为添加2mg/L GA3的MS培养基萌发幼苗结果示意图；2-D为添加3mg/L GA3的MS培养基萌发幼苗结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中，所涉及的材料和试剂均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。例如：MS培养基成分为：4.43g MS基础培养基+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH值为6.0，MS基础培养基购自美国Sigma公司。
实施例一楠木种胚无菌苗的培养方法
楠木种胚无菌苗的培养方法，包括如下步骤：
1)对楠木种子进行预处理，选取颗粒饱满、无病虫害的种子并置于培养皿中，用解剖刀将种皮划开，冲洗，得到种胚；预处理包括如下步骤：将楠木种子用0.5％质量百分含量的高锰酸钾溶液浸泡60min，洗净阴干；为防止种子水分散失，种子可与河沙混合贮藏，沙藏期间注意控制好河沙的湿度，备用；在含2％质量百分含量的洗洁精水溶液中浸泡10min，将漂浮在水面的发育不完整及干瘪种子挑出。
2)将步骤1)得到的种胚，在超净工作台中用无菌水冲洗4次，用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡2min后，无菌水冲洗5次，然后加入质量分数为0.1％的升汞溶液消毒18min后，消毒期间摇动3次，用无菌水冲洗5次，得到消毒后的种胚；
3)将所述消毒后的种胚吸干表面水分，用解剖刀切掉80％的子叶，选取带有20％子叶的胚，接种至添加2mg/L赤霉素GA3的MS培养基中进行萌发培养，培养温度为(25±2)℃，光照/黑暗周期为12h/12h，光照强度为2000-2500lx，楠木种胚萌发率为95％，得到无菌苗，培养40d的苗高为2.1cm，60d的苗高为3.2cm。楠木种胚萌发过程示意图如图1所示。
实施例二不同处理对楠木种胚无菌苗的培养的影响
按实施例一的方法，考察不同消毒剂处理时间对存活率和污染率等的影响，结果如表1所示。
表1不同处理对种胚消毒效果的影响
Figure BDA0003627109400000051
注:均值±标准误差，表中的不同字母是在0.05水平下的显著性。
从表1可知，在75％体积分数的乙醇溶液浸泡消毒2min后，使用0.1％质量分数的升汞溶液消毒时间18min，此时的消毒效果好，存活率高达85％，污染率仅6.11％，死亡率仅8.89％。
按实施例一的方法，考察不同浓度GA3对存活率和污染率等的影响，结果如表2所示。不同GA3浓度对种胚培养20天的影响结果示意图如图2所示。
表2不同浓度GA3对楠木种胚萌发的影响
Figure BDA0003627109400000061
注:均值±标准误差，表中的不同字母是在0.05水平下的显著性。
从表2可知，当赤霉素GA3的浓度为2mg/L时，发芽时间低至7-20d，萌发率高达92％，萌发整齐，胚轴长，植株强壮。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种楠木种胚无菌苗的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)对楠木种子进行预处理，选取颗粒饱满、无病虫害的种子并置于培养皿中，将种皮划开，冲洗，得到种胚；
2)将步骤1)得到的种胚，在超净工作台或生物安全柜中用无菌水冲洗，用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡2min后，无菌水冲洗，然后加入质量分数为0.1％的升汞溶液消毒18min后，用无菌水冲洗，得到消毒后的种胚；
3)将所述消毒后的种胚吸干表面水分，用解剖刀切掉78％-82％的子叶，选取带有18％-22％子叶的胚，接种至添加1.8-2.2mg/L赤霉素GA3的MS培养基中进行萌发培养40-60d，得到无菌苗。
2.根据权利要求1所述的楠木种胚无菌苗的培养方法，其特征在于：所述步骤1)中的预处理包括如下步骤：将楠木种子用0.4％-0.6％质量百分含量的高锰酸钾溶液浸泡40-80min，洗净阴干，在含1.5％-2.5％质量百分含量的洗洁精水溶液中浸泡8-12min，将漂浮在水面的发育不完整及干瘪种子挑出。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的楠木种胚无菌苗的培养方法，其特征在于：所述萌发培养的条件包括：培养温度为(25±2)℃、光照/黑暗周期为11-13h/11-13h、光照强度为2000-2500lx。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的楠木种胚无菌苗的培养方法，其特征在于：所述赤霉素GA3的浓度为2mg/L。
CN202210479441.9A 2022-05-05 2022-05-05 一种楠木种胚无菌苗的培养方法 Active CN114651726B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210479441.9A CN114651726B (zh) 2022-05-05 2022-05-05 一种楠木种胚无菌苗的培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210479441.9A CN114651726B (zh) 2022-05-05 2022-05-05 一种楠木种胚无菌苗的培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114651726A CN114651726A (zh) 2022-06-24
CN114651726B true CN114651726B (zh) 2023-06-20

Family

ID=82036479

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210479441.9A Active CN114651726B (zh) 2022-05-05 2022-05-05 一种楠木种胚无菌苗的培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114651726B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103444531A (zh) * 2013-08-28 2013-12-18 遵义县华富农业生物科技有限公司 一种金丝楠木组织培养的快繁方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106212288B (zh) * 2016-08-24 2018-07-31 华南农业大学 一种刨花润楠的组培繁殖方法
CN107047296B (zh) * 2017-01-22 2018-09-11 浙江农林大学 一种浙江楠体细胞胚诱导方法
CN107926709A (zh) * 2017-12-22 2018-04-20 华南农业大学 一种刻节润楠的组培快繁方法
BR112020021748A2 (pt) * 2018-05-03 2021-01-26 Evogene Ltd. polipeptídeos inseticidas e uso dos mesmos
CN108605633A (zh) * 2018-05-04 2018-10-02 永嘉县原野园林工程有限公司 一种楠木组培快繁方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103444531A (zh) * 2013-08-28 2013-12-18 遵义县华富农业生物科技有限公司 一种金丝楠木组织培养的快繁方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114651726A (zh) 2022-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108552056B (zh) 一种通过胚拯救技术快速培育百山祖冷杉幼苗的方法
CN104855292B (zh) 一种牛樟茎段组培快繁的方法
CN102144556A (zh) 瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法
CN109220810A (zh) 一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法
CN110352853A (zh) 一种提高茅苍术试管苗品质和移栽成活率的方法
CN101455179B (zh) 一种老龄秤锤树的组织培养方法
CN108496804B (zh) 无刺花椒组织培养初代诱导的方法
CN107232056B (zh) 一种茶树组培快繁体系的建立方法
CN114651726B (zh) 一种楠木种胚无菌苗的培养方法
CN107568069B (zh) 一种光皮桦组培苗高效增殖方法
Jabir et al. Micropropagation and in vitro flowering of an ornamental aquarium plant Lindernia antipoda (L.) Alston
CN108990800A (zh) 三角枫的组织培养方法
CN105794650B (zh) 一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法
CN108094206A (zh) 一种光叶蕨孢子体繁殖的培养方法
CN104186324A (zh) 樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法
CN104823649B (zh) 提高乌饭树种发芽率的方法
CN108293862A (zh) 一种非洲百合的快速繁殖方法
CN109997692B (zh) 青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基及其培养方法
Patel et al. In vitro micro propagation of papaya var. Red Lady.
CN110122331A (zh) 一种以叶为外植体的亚美马褂木的快繁方法
CN112640782B (zh) 橙黄玉凤花的组织培养方法
CN114303952B (zh) 一种睡莲块茎诱导组培快繁的方法
He et al. Effects of different hormones on germination and callus induction of hemp seeds
CN111887152B (zh) 一种燕子花丛生芽途径的植株再生体系建立方法
CN108056024B (zh) 一种蛇舌兰快速成苗方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant