CN114617885A - 异莲心碱在制备治疗实体瘤药物中的应用 - Google Patents

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杨光明
刘春美
陈景
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Abstract

本发明公开了异莲心碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗实体瘤药物中的应用，异莲心碱如式(1)所示，所述实体瘤包括胰腺癌、胃癌、肾癌。本研究通过MTT细胞活力检测实验，发现莲子心中成分异莲心碱具有抑制实体瘤细胞活力的能力，显示了异莲心碱在制备治疗腺癌、胃癌、肾癌药物中的应用前景。

Description

异莲心碱在制备治疗实体瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种化合物的应用，具体涉及异莲心碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗实体瘤药物中的应用。
背景技术
莲子心为睡莲科植物莲(Nelumbo nuciferiaGaertn)的成熟种子中间的绿色胚芽，是临床习用中药，也是重要药食两用作物品种之一，功能清热解毒，用于热病。异莲心碱(英文名：isoliensinine；缩写：IsoL)是莲生物总碱的主要组成之一，目前已被证明具有抗氧化、抗局部缺血等药理活性。陈灵骏《异莲心碱抗血小板聚集和抗凝血作用》提到异莲心碱能显著延长大鼠PT、APTT和TT，异莲心碱具有对抗血小板聚集和凝血作用。徐俊英《异莲心碱对实验性前脑缺血/再灌注损伤的保护机制》实验验证了异莲心碱对实验性前脑I/R损伤的保护作用机制可能与减少脑组织和脑细胞线粒体中过氧化物和氧自由基含量，增高SOD活性及改善ATPase活性有关。但尚无研究表明异莲心碱是否对胰腺癌、胃癌、肾癌有抑制作用。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供异莲心碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗实体瘤药物中的应用。
技术方案：如式(1)所示的异莲心碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗实体瘤药物中的应用。
Figure BDA0003485289100000011
所述实体瘤包括胰腺癌、胃癌、肾癌。
所述异莲心碱来源于从莲子心或其他植物中提取或者化学合成。
所述药物是由异莲心碱及其药学上可接受的盐添加药学上可接受的辅料所制成的药物。
所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
异莲心碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗胰腺癌药物中的应用。
异莲心碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗胃癌药物中的应用。
异莲心碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肾癌药物中的应用。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：本研究通过MTT细胞活力检测实验，发现莲子心中成分异莲心碱具有抑制人实体瘤细胞活力的能力，验证了异莲心碱具有抗实体瘤的作用，表明异莲心碱在制备治疗腺癌、胃癌、肾癌药物中的应用前景。
附图说明
图1是0～64μM异莲心碱在48h和72h下对人胰腺癌细胞系PANC1细胞的活力水平影响；
图2是0～64μM异莲心碱在48h下对人胃癌细胞系MGC803细胞的活力水平影响；
图3是异莲心碱对人胰腺癌BxPC-3细胞裸鼠异种移植肿瘤瘤重的影响；
图4是异莲心碱对人胰腺癌BxPC-3细胞裸鼠异种移植肿瘤实验动物体重的影响；
图5是异莲心碱对人胰腺癌BxPC-3细胞异种移植肿瘤生长的抑制作用照片；
图6是异莲心碱对人胃癌MGC-803裸鼠异种移植肿瘤瘤重的影响；
图7是异莲心碱对人胃癌MGC-803裸鼠异种移植肿瘤实验动物体重的影响；
图8是异莲心碱对人胃癌MGC-803异种移植肿瘤生长的抑制作用照片；
图9是0～64μM异莲心碱在48h和72h下对人肾癌细胞系OSRC2细胞的活力水平影响。
具体实施方式
实施例1
异莲心碱对胰腺癌和胃癌细胞系细胞活力的影响
1.1实验材料
1.1.1试剂与材料
①化合物
异莲心碱(C37H42N2O6，分子量：610.74)由南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究所提供，淡黄色粉末，纯度＞95％。使用前用二甲基亚砜将化合物粉末配置成浓度为0.05M储备液，置于-80℃保存。使用时采用细胞培养相应培养基稀释到所需浓度。
②细胞系
人胰腺癌细胞系PANC1，和人胃癌细胞系MGC803，均购自上海中国科学院细胞所。
③细胞培养试剂
DMEM培养基(GIBCO，Carlsbad，CA，USA)：取6.74g DMEM粉末和1.85g NaHCO3共同溶于0.5L ddH2O中。用无菌圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃保存。使用前加入100U/mL青霉素(辰欣药业股份有限公司，济宁，中国)和100mg/L链霉素(辰欣药业股份有限公司)。
胎牛血清(GIBCO)保存于-20℃，使用前于56℃水浴灭活35min后分装保存于4℃，一周内使用。使用时将胎牛血清与培养基按1∶10混合。
④相关指标检测试剂盒
MTT溶液：避光操作，0.05g MTT(翌圣生物科技，上海，中国)粉末溶于10mLPBS缓冲液中，超声20min，配制成浓度为5mg/mL溶液。采用0.22μm无菌滤头过滤，分装，置于-80℃保存。使用时提前于室温溶解。
1.1.2实验仪器
YJ-875型医用净化工作台(净化设备厂，苏州，中国)；3111型水套式CO2培养箱(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)；702型超低温冰箱(ThermoFisherScientific)；电子天平(赛多利斯仪器系统有限公司，北京，中国)；QIUJING血细胞计数板(求精生化试剂仪器有限公司，上海，中国)；LD4-2普通离心机(医用离心机厂，上海，中国)；5417R型台式冷冻高速离心机(EppendorfAG，Hamburg，Germany)；Research型单道可调移液器(Eppendorf AG)；THZ-312型台式恒温振荡器(精宏试验设备有限公司，上海，中国)；Varioskan全波长酶标仪(ThermoFisher Scientific)。
1.2、实验方法
①细胞活力检测
原理：MTT可以被细胞内线粒体脱氢酶还原生成蓝紫色结晶甲臜(Formazan)，在570nm波长处检测光密度(optical density，OD)值并比较，可以反映细胞活力相对水平。操作流程：100μL细胞(5000个/孔)均匀培养在96孔板内，加入100μL一定浓度的异莲心碱，细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养；药物作用结束后，每孔加入15μL MTT溶液。培养箱中孵育3h后，使用酶标仪测定570nM下OD值。抑制率％＝(1一给药组细胞平均吸光值/对照组细胞平均吸光值)×100％；Graphpad Prism 8.0软件计算半数抑制浓度(50％inhibitingconcentration，IC50)。
1.3、实验结果
通过MTT法检测从中药莲子心中提取出的天然化合物异莲心碱在不同浓度下对不同消化系统肿瘤细胞的活力抑制作用。结果显示，0～64μM异莲心碱对细胞均有显著的活力抑制作用。异莲心碱在48h和72h对PANC1细胞的IC50分别为15.36μM和8.72μM(图1)；异莲心碱在48h对MGC803细胞的IC50为20.25μM(图2)。该结果表明异莲心碱对人消化系统肿瘤具有显著的活力抑制作用，尤其是对胰腺癌、胃癌具有显著的抑制作用。
实施例2
异莲心碱对胰腺癌BxPC-3细胞裸鼠异种移植肿瘤生长研究
1.1受试药物
名称：异莲心碱
配制方法：每次给药前用CMC-Na溶解药物，配成浓度为10mg/mL的制剂，给药体积为0.4mL/20g，即为剂量200mg/kg。
1.1对照药物
名称：注射用盐酸吉西他滨片
生产厂家：江苏豪森药业集团有限公司
批号：619201121
规格：0.2g
配制方法：每次给药前称取粉末，加入0.9％氯化钠注射液(生产厂家：安徽双鹤药业有限责任公司；批号：2103223C；规格：500mL：4.5g)配制成浓度为1mg/mL的液体，给药体积为0.2mL/20g，即给药剂量为10mg/kg。
1.2剂量设置
空白对照组
异莲心碱组剂量为200mg/kg
吉西他滨组剂量为10mg/kg
1.3实验动物
来源、种系、品系：BALB/c裸小鼠，由江苏华创信诺医药科技有限公司提供(实验动物生产许可证：SCXK(苏)2020-0009)。
日龄：35-40天
体重：18-24g
性别：雌性
1.4实验动物分组
阴性对照组12只
药物治疗组(异莲心碱200mg/kg)6只
阳性对照组(吉西他滨800mg/kg)6只
1.5移植瘤
人胰腺癌BxPC-3细胞裸小鼠移植瘤，由人胰腺癌BxPC-3细胞株接种于裸小鼠腋窝皮下而建立。细胞接种量为5×106个/只。
1.6实验方法
取对数生长期的人胰腺癌BxPC-3细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1mL接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100～300mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量为每3天测1次。给药体积为0.4mL/20g。21天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：
TV＝＝1/2×a×b2
其中a、b分别表示长宽。
根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
Figure BDA0003485289100000051
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。
抑瘤率计算公式如下：
Figure BDA0003485289100000052
Tweight：治疗组平均瘤重；Cweight：阴性对照组平均瘤重。
2结果和讨论
异莲心碱对人胰腺癌BxPC-3细胞裸小鼠移植瘤的实验性治疗结果见表1和图3，4，5。实验结果如下，异莲心碱以200mg/kg灌胃给药，每天给药1次，共给药21天，给药20次后，对人胰腺癌BxPC-3细胞裸小鼠移植瘤的抑瘤率为40.54％。吉西他滨以10mg/kg灌胃给药，每周给药1次，共给药3次后对人胰腺癌BxPC-3细胞裸小鼠移植瘤的抑瘤率达61.27％。
表1.异莲心碱对人胰腺癌BxPC-3细胞裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用(X±SD)
Figure BDA0003485289100000061
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例3
异莲心碱对胃癌MGC-803细胞裸鼠异种移植肿瘤生长研究
1实验材料
1.1受试药物
名称：异莲心碱
配制方法：每次给药前用CMC-Na溶解药物，配成浓度为10mg/mL的制剂，给药体积为0.4mL/20g，即为剂量200mg/kg。
2.1对照药物
名称：卡培他滨片
生产厂家：齐鲁制药有限公司
批号：1H1003DE3
规格：500mg×12片
配制方法：每次给药前称取粉末，加入0.9％氯化钠注射液(生产厂家：安徽双鹤药业有限责任公司；批号：210322 3C；规格：500mL：4.5g)配制成浓度为40mg/mL的液体，给药体积为0.4mL/20g，即给药剂量为800mg/kg。
2.2剂量设置
空白对照组
异莲心碱组剂量为200mg/kg
卡培他滨组剂量为800mg/kg
2.3实验动物
来源、种系、品系：BALB/c裸小鼠，由江苏华创信诺医药科技有限公司提供(实验动物生产许可证：SCXK(苏)2020-0009)。
日龄：35-40天
体重：18-24g
性别：雌性
2.4实验动物分组
阴性对照组12只
药物治疗组(异莲心碱200mg/kg)6只
阳性对照组(卡培他滨800mg/kg)6只
2.5移植瘤
人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤，由人胃癌MGC-803细胞株接种于裸小鼠腋窝皮下而建立。细胞接种量为5×106个/只。
2.6实验方法
取对数生长期的人胃癌MGC-803细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1mL接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100～300mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量为每3天测1次。给药体积为0.4mL/20g。21天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：
TV＝1/2×a×b2
其中a、b分别表示长宽。
根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
Figure BDA0003485289100000071
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。
抑瘤率计算公式如下：
Figure BDA0003485289100000072
Tweight：治疗组平均瘤重；Cweight：阴性对照组平均瘤重。
3结果和讨论
异莲心碱对人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤的实验性治疗结果见表2和图6，7，8。实验结果如下，异莲心碱以200mg/kg灌胃给药，每天给药1次，共给药21天，给药20次后，对人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤的抑瘤率为39.83％。卡培他滨以800mg/kg灌胃给药，每2天给药1次，共给药10次后对人胃癌MGC-803细胞裸小鼠移植瘤的抑瘤率达73.35％。
表2.异莲心碱对人胃癌MGC-803裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用(X±SD)
Figure BDA0003485289100000081
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例4
异莲心碱对肾癌细胞系细胞活力的影响
1.1实验材料
1.1.1试剂与材料
①化合物
异莲心碱(C37H42N2O6，分子量：610.74)由南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究所提供，淡黄色粉末，纯度＞95％。使用前用二甲基亚砜将化合物粉末配置成浓度为0.05M储备液，置于-80℃保存。使用时采用细胞培养相应培养基稀释到所需浓度。
②细胞系
人肾癌细胞系OSRC2购自上海中国科学院细胞所。
③细胞培养试剂
DMEM培养基(GIBCO，Carlsbad，CA，USA)：取6.74g DMEM粉末和1.85gNaHCO3共同溶于0.5L ddH2O中。用无菌圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃保存。使用前加入100U/mL青霉素(辰欣药业股份有限公司，济宁，中国)和100mg/L链霉素(辰欣药业股份有限公司)。
胎牛血清(GIBCO)保存于-20℃，使用前于56℃水浴灭活35min后分装保存于4℃，一周内使用。使用时将胎牛血清与培养基按1∶10混合。
④相关指标检测试剂盒
MTT溶液：避光操作，0.05g MTT(翌圣生物科技，上海，中国)粉末溶于10mLPBS缓冲液中，超声20min，配制成浓度为5mg/mL溶液。采用0.22μm无菌滤头过滤，分装，置于-80℃保存。使用时提前于室温溶解。
1.1.2实验仪器
YJ-875型医用净化工作台(净化设备厂，苏州，中国)；3111型水套式CO2培养箱(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)；702型超低温冰箱(ThermoFisherScientific)；电子天平(赛多利斯仪器系统有限公司，北京，中国)；QIUJING血细胞计数板(求精生化试剂仪器有限公司，上海，中国)；LD4-2普通离心机(医用离心机厂，上海，中国)；5417R型台式冷冻高速离心机(EppendorfAG，Hamburg，Germany)；Research型单道可调移液器(EppendorfAG)；THZ-312型台式恒温振荡器(精宏试验设备有限公司，上海，中国)；Varioskan全波长酶标仪(ThermoFisher Scientific)。
1.2实验方法
①细胞活力检测
原理：MTT可以被细胞内线粒体脱氢酶还原生成蓝紫色结晶甲臜(Formazan)，在570nm波长处检测光密度(optical density，OD)值并比较，可以反映细胞活力相对水平。操作流程：100μL细胞(5000个/孔)均匀培养在96孔板内，加入100μL一定浓度的异莲心碱，细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养；药物作用结束后，每孔加入15μL MTT溶液。培养箱中孵育3h后，使用酶标仪测定570nM下OD值。抑制率％＝(1-给药组细胞平均吸光值/对照组细胞平均吸光值)×100％；Graphpad Prism 8.0软件计算半数抑制浓度(50％inhibitingconcentration，IC50)。
1.3实验结果
通过MTT法检测从中药莲子心中提取出的天然化合物异莲心碱在不同浓度下对肾癌细胞OSRC2的活力抑制作用。结果显示，0～64μM异莲心碱对OSRC2细胞有显著的活力抑制作用，呈时间和浓度依赖性。异莲心碱在48h和72h对OSRC2细胞的IC50分别为23.02μM和17.66μM(图9)。该结果表明异莲心碱对肾癌具有显著的活力抑制作用。

Claims (5)

1.如式(1)所示的异莲心碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗实体瘤药物中的应用。
Figure FDA0003485289090000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述实体瘤包括胰腺癌、胃癌、肾癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述异莲心碱来源于从莲子心或其他植物中提取或者化学合成。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是由异莲心碱及其药学上可接受的盐添加药学上可接受的辅料所制成的药物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
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