CN114594244A - 一种全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液及其制备方法，其特征在于：该低pH抗原修复缓冲液的原料主要包括：柠檬酸三钠，吐温‑20，丙三醇，ProClin950，且该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH 5.8～6.2。本申请的方案具有有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长，使抗原修复缓冲液无论在冷藏条件还是室温条件下，能长期稳定地保存与使用，具有更好的浸润性，其在较高温度下不容易挥发，避免导致组织切片发生干化情况，其pH具有较好的稳定性且具有较好的抗菌保存功能的优点。
Description
技术领域
本申请涉及全自动免疫组化染色机技术领域，具体是指一种全自动免疫组化染色机适配的低pH(pH 5.8～6.2)抗原修复缓冲液及其制备方法。
技术背景
免疫组织化学技术是近年来病理诊断迅速发展的检测技术，作为一种重要的病理辅助诊断方法，在临床的应用中日益受到重视。起初，免疫组化染色技术以人工操作为主，抗原修复液使用量大，使用方法不统一，质量标准无法统一，染色结果稳定性差。
免疫组化技术近年来得到迅速发展，并随着全自动免疫组化染色仪的应用推广，对于染色质量的要求也日益提高。其中，抗原修复在整个免疫组化染色过程中有着极其重要的作用，修复条件的好坏直接决定着最终染色结果的质量。
目前市面上的抗原修复液不能有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长，使抗原修复缓冲液在冷藏条件或者是室温条件下不能长期稳定地保存与使用；而且抗原修复缓冲液的成分对诊断试剂中的关键酶与底物的结合速率产生影响；此外，现有的抗原修复液在少量使用时，容易发生玻片上液体不均一现象，不能完全覆盖组织玻片，即浸润性差；此外，抗原修复液在少量使用时，高温(100℃左右)下容易发生干片，即易挥发。
发明内容
本申请针对现有技术的上述不足，提供一种有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长，使抗原修复缓冲液无论在冷藏条件还是室温条件下，能长期稳定地保存与使用，具有更好的浸润性，其在较高温度下不容易挥发，避免导致组织切片发生干化情况，其pH具有较好的稳定性且具有较好的抗菌保存功能的全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液。
为了解决上述技术问题，本申请采用的技术方案为：一种低pH抗原修复缓冲液，该低pH抗原修复缓冲液的原料主要包括：柠檬酸三钠，吐温-20，丙三醇，ProClin 950，且该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH 5.8～6.2。
进一步的，上述的低pH抗原修复缓冲液，每1000mL的该低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠2.10～3.25g，吐温-20 0.35～0.6mL，丙三醇150～550mL，ProClin 950 0.25～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH 5.8～6.2。
进一步的，上述的低pH抗原修复缓冲液，每1000mL的该低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠2.3～3.25g，吐温-20 0.45～0.6mL，丙三醇300～550mL，ProClin 9500.3～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH 5.8～6.2。
进一步的，上述的低pH抗原修复缓冲液，每1000mL的该低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠2.5～3.25g，吐温-20 0.5～0.6mL，丙三醇450～550mL，ProClin 9500.35～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH 5.8～6.2。
进一步的，上述的低pH抗原修复缓冲液，每1000mL的该低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠3.0～3.25g，吐温-20 0.55～0.6mL，丙三醇500～550mL，ProClin 9500.40～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH 5.8～6.2。
本申请还提供一种上述低pH抗原修复缓冲液的制备方法，具体包括：
(1)按配比称取柠檬酸三钠，用纯化水溶解柠檬酸三钠后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加配方量的吐温-20；
(2)在步骤(1)溶解后的溶液中再添加配方量的ProClin 950，最后用纯化水定容至额定容量；
(3)调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH5.8～6.2范围内即可。
优选的，上述低pH抗原修复缓冲液的制备方法，步骤(3)调节抗原修复缓冲液的pH值使用1M的NaOH溶液。
优选的，上述低pH抗原修复缓冲液的制备方法，步骤(3)调节抗原修复缓冲液的pH值使用1M的HCl溶液。
本申请的优点和有益效果：
1.在本申请的抗原修复缓冲液中，首次添加了柠檬酸三钠，添加了柠檬酸三钠之后可以形成柠檬酸三钠水溶液作为缓冲液；由于柠檬酸三钠具有极好的溶解性能，并且溶解性随水温升高而增加；此外，柠檬酸三钠还具有良好的pH调节及缓冲性能，柠檬酸三钠作为一种弱酸强碱盐，与柠檬酸配伍可组成较强的pH缓冲剂，因此在某些不适宜pH大范围变化的场合有其重要用处；而本申请仅仅添加柠檬酸三钠、其经过大量的水稀释后，会有部分变成柠檬酸，这样柠檬酸三钠和柠檬酸两者就会共存于同一体系中，形成较强的pH缓冲剂；另外，柠檬三酸钠还具有优良的缓凝性能及稳定性能，安全无毒；本申请的pH值稳定，主要以生物缓冲剂柠檬酸三钠的水溶液为基础构成的缓冲液，同时也能作为pH调节剂，使得缓冲液的pH更加稳定。
2.在本申请的抗原修复缓冲液中，首次引入了ProClin 950，ProClin 950是一种高效生物防腐剂，ProClin 950的加入，可以有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长，使抗原修复缓冲液无论在冷藏条件还是室温条件下，能长期稳定地保存与使用；此外，ProClin 950不会对诊断试剂中的关键酶与底物的结合速率产生影响，比如：辣根过氧化酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)，且也不会对抗体的结合产生影响。
3.在本申请的抗原修复缓冲液中，吐温-20作为温和的表面活性剂，具有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力，降低抗体的非特异性结合，同时也可作为乳化剂使其他物质均匀在溶液中分散。
4.在本申请的抗原修复缓冲液中，丙三醇的加入，可与水以任何比例溶解，作为一种混合溶剂，能够提高抗原修复缓冲液液的沸点，防止其在高温条件下过度挥发，对抗原修复缓冲液中的活性成分和pH值的影响较小，且与组织切片的亲和性较好(浸润性好)，毒性低，不会对组织切片的修复造成过多影响；同时也具有延长保质期的功效。
5.本申请的抗原修复缓冲液具有较好的浸润性，而且抗原修复缓冲液分布均一；主要是通过加入合适比例的丙三醇和吐温-20相互作用，实现了与组织切片的亲和性较好(浸润性好)，且使缓冲液中的物质能均匀在溶液中分散。
6.本申请在少量使用和高温条件下，缓冲液能稳定存在及使用，是通过加入合适比例的丙三醇与水混合形成一种混合溶剂，能够提高抗原修复缓冲液液的沸点，防止其在高温条件下过度挥发。
7.本申请的修复液，通过以柠檬酸三钠、吐温-20、丙三醇和ProClin 950等物质作为制备抗原修复缓冲液的原料，抗原修复缓冲液具有更好的浸润性，其在较高温度下不容易挥发，避免导致组织切片发生干化情况，其pH具有较好的稳定性且具有较好的抗菌保存功能。从而使抗原修复缓冲液能够在较少的用量下对组织切片进行抗原修复过程，平均每张组织切片所需的修复缓冲液只需100-150微升，修复效果好，能够配合全自动免疫组化染色机使用。
8.本申请的修复液限定pH值范围为pH 5.8～6.2，因为免疫组化检测方法主要是检测人体组织中的抗原，而不同抗原对修复液pH的需求是不一样的。修复液的pH值对抗原修复的影响分为三类：A、B、C；A类抗原在任何pH条件下，修复结果都很好；B类抗原在低和高pH时，修复结果很好，但是在中等pH时，修复效果很差；C类抗原随着pH的增高，修复结果也越来越好；而本申请上述这种特定的pH值范围的划分可适用本申请这种特定组成的抗原修复液，且也是本申请修复液的最佳的pH范围，修复效果理想。
9.本申请通过采用以生物缓冲剂柠檬酸三钠的水溶液为基础构成的缓冲液，形成较稳定的低pH缓冲液；如果没有柠檬酸三钠的加入，即为中性溶液，抗原修复效果会比较差。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是优选实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
一种低pH抗原修复缓冲液：每1000mL低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠2.10g，吐温-20 0.35mL，丙三醇150mL，ProClinTM 950 0.25mL和余量的纯化水，pH值范围为pH 5.8～6.2。
制备方法：按配比称取柠檬酸三钠，用纯化水溶解柠檬酸三钠后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加吐温-20，溶解后再添加ProClinTM 950，最后用纯化水定容至额定容量，使用1M NaOH溶液或HCl溶液调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH5.8～6.2范围内即可。
实施例2
一种低pH抗原修复缓冲液：每1000mL低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠2.50g，吐温-200.45mL，丙三醇300mL，ProClinTM 9500.4mL和余量的纯化水，pH值范围为pH5.8～6.2。
制备方法：按配比称取柠檬酸三钠，用纯化水溶解柠檬酸三钠后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加吐温-20，溶解后再添加ProClinTM 950，最后用纯化水定容至额定容量，使用1M NaOH溶液或HCl溶液调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH5.8～6.2范围内即可。
实施例3
一种低pH抗原修复缓冲液：每1000mL低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠3.25g，吐温-200.6mL，丙三醇550mL，ProClinTM 950 0.5mL和余量的纯化水，pH值范围为pH5.8～6.2。
制备方法：按配比称取柠檬酸三钠，用纯化水溶解柠檬酸三钠后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加吐温-20，溶解后再添加ProClinTM 950，最后用纯化水定容至额定容量，使用1M NaOH溶液或HCl溶液调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH5.8～6.2范围内即可。
实施例4
一种低pH抗原修复缓冲液：每1000mL低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠3.0g，吐温-200.50mL，丙三醇450mL，ProClinTM 950 0.35mL和余量的纯化水，pH值范围为pH 5.8～6.2。
制备方法：按配比称取柠檬酸三钠，用纯化水溶解柠檬酸三钠后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加吐温-20，溶解后再添加ProClinTM 950，最后用纯化水定容至额定容量，使用1M NaOH溶液或HCl溶液调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH5.8～6.2范围内即可。
实施例5
一种低pH抗原修复缓冲液：每1000mL低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠2.3g，吐温-200.55mL，丙三醇500mL，ProClinTM 950 0.45mL和余量的纯化水，pH值范围为pH 5.8～6.2。
制备方法：按配比称取柠檬酸三钠，用纯化水溶解柠檬酸三钠后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加吐温-20，溶解后再添加ProClinTM 950，最后用纯化水定容至额定容量，使用1M NaOH溶液或HCl溶液调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH5.8～6.2范围内即可。
对本申请的上述实施例获得的抗原修复缓冲液进行测试，其测试结果见下表1-2所示：
测试结果：
表1实施例1-5的修复液的pH测试结果
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 |
| pH | 5.89 | 6.09 | 6.17 | 6.10 | 6.20 |
表2组织切片染色结果
注：表中表示阴性；+表示弱阳性；++表示中等阳性；+++表示强阳性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
对比例1
采用与实施例1同一配方配制产品，其中实施例1是加入了ProClin950，为A0组产品；而对比例作为另一组产品不加ProClin950，为A1产品；将A0产品和A1产品分别在冷藏条件下保存，发现A1产品在1～2个月内产品会慢慢变浑浊，有微生物的污染，而A0产品液体依旧澄清，无微生物污染；同样将A0产品和A1产品分别在室温条件下，A1产品在1～4周内(具体要看使用环境的洁净度)也会慢慢变浑浊，有微生物的污染；而A0产品液体依旧澄清，无微生物污染；充分说明本申请含有ProClin950的修复液能使产品无论冷藏条件还是室温条件下，都能长期稳定地保存与使用。
对比例2
采用与实施例1同一配方配制产品，其中实施例1是加入了ProClin950，为A0组产品；另一组产品不加ProClin950，为A1产品；现配现用，上机进行免疫组化染色测试：采用同一抗体工作液，相邻组织切片，相同预染程序和染色程序，染色结果基本一致；说明本申请含有ProClin950的修复液不会对诊断试剂中的关键酶与底物的结合速率产生影响，也不会对抗体的结合产生影响。
对比例3
采用本实施例1与对比例即手工方法的抗原修复液(不含丙三醇)比对测试，在相同的两张组织切片上盖上玻片盖板后，分别滴加手工抗原修复缓冲液和本产品至组织切片和盖板处，发现本产品能快速全面地覆盖组织，且比较均匀。而手工抗原修复液不能全面地覆盖组织切片，部分组织没有修复液浸润，说明本申请的修复液浸润性好。
同样采用实施例1与手工方法的抗原修复液(不含丙三醇)比对测试，上机进行免疫组化染色测试：采用同一抗体工作液，相邻组织切片，相同预染程序和染色程序；染色过程中发现，在抗原修复过程中，手工抗原修复液出现液体沸腾现象，抗原修复过程结束后出现部分干片现象；而实施例1未发现上述现象，且实施例1的液体在抗原修复过程中均能全面覆盖组织；染色结果显示，实施例1的染色结果背景干净，染色强度符合要求，而手工抗原修复液的染色结果，出现大片非特异染色背景，无法观察组织细胞的染色强度。
通过上述对比例可知，本申请的抗原修复液能使产品无论冷藏条件还是室温条件下，都能长期稳定地保存与使用；本申请的修复液不会对诊断试剂中的关键酶与底物的结合速率产生影响，也不会对抗体的结合产生影响；本申请的修复液浸润性好，抗原修复过程中均能全面覆盖组织，染色结果显示本申请的修复液染色结果背景干净，染色强度符合要求。
Claims (8)
1.一种全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液，其特征在于：该低pH抗原修复缓冲液的原料主要包括：柠檬酸三钠，吐温-20，丙三醇，ProClin 950，且该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH 5.8～6.2。
2.根据权利要求1所述的全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液，其特征在于：每1000mL的该低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠2.10～3.25g，吐温-20 0.35～0.6mL，丙三醇150～550mL，ProClin 950 0.25～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH 5.8～6.2。
3.根据权利要求2所述的全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液，其特征在于：每1000mL的该低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠2.3～3.25g，吐温-200.45～0.6mL，丙三醇300～550mL，ProClin 950 0.3～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH 5.8～6.2。
4.根据权利要求4所述的全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液，其特征在于：每1000mL的该低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠2.5～3.25g，吐温-200.5～0.6mL，丙三醇450～550mL，ProClin 950 0.35～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH 5.8～6.2。
5.根据权利要求4所述的全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液，其特征在于：每1000mL的该低pH抗原修复缓冲液包括：柠檬酸三钠3.0～3.25g，吐温-200.55～0.6mL，丙三醇500～550mL，ProClin 950 0.40～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH 5.8～6.2。
6.一种全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液的制备方法，其特征在于：具体包括：
(1)按配比称取柠檬酸三钠，用纯化水溶解柠檬酸三钠后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加配方量的吐温-20；
(2)在步骤(1)溶解后的溶液中再添加配方量的ProClin 950，最后用纯化水定容至额定容量；
(3)调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH5.8～6.2范围内即可。
7.根据权利要求6所述的全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液的制备方法，其特征在于：步骤(3)调节抗原修复缓冲液的pH值使用1M的NaOH溶液。
8.根据权利要求6所述的全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液的制备方法，其特征在于：上述低pH抗原修复缓冲液的制备方法，步骤(3)调节抗原修复缓冲液的pH值使用1M的HCl溶液。
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| CN202210091294.8A CN114594244A (zh) | 2022-01-26 | 2022-01-26 | 一种全自动免疫组化染色机适配的低pH抗原修复缓冲液及其制备方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN115326951A (zh) * | 2022-07-27 | 2022-11-11 | 河南省奶牛生产性能测定中心 | 一种牛奶中黄曲霉素m1的检测方法 |
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| AU2006202931A1 (en) * | 2001-03-07 | 2006-08-03 | Ventana Medical Systems, Inc. | Automated immunohistochemical and in situ hybridization assay formulations |
| CN105987840A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-10-05 | 浙江世纪康大医疗科技股份有限公司 | 一种柠檬酸抗原修复液 |
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