CN114594243A - 一种全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液及其制备方法，其特征在于：该抗原修复缓冲液的原料主要包括：三(羟甲基)氨基甲烷，乙二胺四乙酸二钠盐二水，吐温‑20，丙三醇和ProClin950；且该修复缓冲液的pH值范围为pH8.9～9.1。本申请的方案具有有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长，使抗原修复缓冲液无论在冷藏条件还是室温条件下，能长期稳定地保存与使用，具有更好的浸润性，其在较高温度下不容易挥发，避免导致组织切片发生干化情况，其pH具有较好的稳定性且具有较好的抗菌保存功能的优点。
Description
技术领域
本申请涉及全自动免疫组化染色机技术领域，具体是指一种全自动免疫组化染色机适配的高pH(pH8.9～9.1)抗原修复缓冲液及其制备方法。
技术背景
免疫组化技术近年来得到迅速发展，并随着全自动免疫组化染色仪的应用推广，对于染色质量的要求也日益提高。其中，抗原修复在整个免疫组化染色过程中有着极其重要的作用，修复条件的好坏直接决定着最终染色结果的质量。全自动染色仪因为其自身的结构特点，其用于盛放修复液的容器体积较小，不能像手工修复那样把组织切片完全浸泡在修复液中，并且全自动免疫组化染色仪在抗原修复时需要在较高的温度(100℃左右)下进行，因此修复液容易挥发，进一步减少了修复液的体积，使得其修复效果相对较差，而且也严重影响了后续免疫组化染色的效果。因此如何在全自动免疫组化染色机上正常完成抗原修复过程是全自动免疫组化染色仪必须解决的一个技术问题。
如果要较好地解决在全自动免疫组化染色机上正常完成抗原修复过程的技术问题，则可通过抗原修复缓冲液的改进来实现。将改进的抗原修复液于全自动免疫组化染色机上，一方面，该改进的抗原修复缓冲液需要有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长，使抗原修复缓冲液无论在冷藏条件还是室温条件下，能长期稳定地保存与使用；而且还要求抗原修复缓冲液的成分不会对诊断试剂中的关键酶与底物的结合速率产生影响；此外，该改进的抗原修复缓冲液需要在较少用量的情况下将组织切片完全浸渍并完成较好的修复，即改进的抗原修复缓冲液应具有较好均一的浸润性；另一方面，需要提高改进抗原修复缓冲液的沸点，使其在较高温度下也不容易挥发，避免导致组织切片发生干化情况，而一旦发生干化，组织切片的抗原就会变为不可逆转的破坏而无法修复；最后，改进的抗原修复缓冲液稳定使用问题，即改进的抗原修复缓冲液无论冷藏还是室温其pH具有较好的稳定性且具有较好的抗菌保存功能。
发明内容
本申请针对现有技术的上述不足，提供一种有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长，使抗原修复缓冲液无论在冷藏条件还是室温条件下，能长期稳定地保存与使用，具有更好的浸润性，其在较高温度下不容易挥发，避免导致组织切片发生干化情况，其pH具有较好的稳定性且具有较好的抗菌保存功能的全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液。
为了解决上述技术问题，本申请采用的技术方案为：一种全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液，该抗原修复缓冲液的原料主要包括：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)，吐温-20，丙三醇和ProClin950；且该修复缓冲液的pH值范围为pH8.9～9.1。
进一步的，上述的高pH抗原修复缓冲液，每1000mL的该高pH抗原修复缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)1.10～1.25g，乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)0.31～0.41g，吐温-20 0.35～0.6mL，丙三醇150～550mL，ProClin950 0.25～0.5mL和余量的纯化水，且该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH8.9～9.1。
进一步的，上述的高pH抗原修复缓冲液，每1000mL的该高pH抗原修复缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)1.15～1.25g，乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)0.35～0.41g，吐温-20 0.45～0.6mL，丙三醇300～550mL，ProClin950 0.35～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH8.9～9.1。
进一步的，上述的高pH抗原修复缓冲液，每1000mL的该高pH抗原修复缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)1.20～1.25g，乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)0.38～0.41g，吐温-20 0.5～0.6mL，丙三醇400～550mL，ProClin950 0.4～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH8.9～9.1。
进一步的，上述的高pH抗原修复缓冲液，每1000mL的该高pH抗原修复缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)1.22～1.25g，乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)0.40～0.41g，吐温-20 0.55～0.6mL，丙三醇450～550mL，ProClin950 0.45～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH8.9～9.1。
本申请还提供一种上述高pH抗原修复缓冲液的制备方法：具体步骤包括：
(1)按配比称取三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)，然后用纯化水将三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)溶解；
(2)向着步骤(1)溶解后溶液中加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加配方量的吐温-20，溶解后再添加ProClin950，最后用纯化水定容至额定容量；
(3)然后调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH8.9～9.1范围内即可。
优选的，所述的调节抗原修复缓冲液的pH值使用1M的NaOH溶液进行调节。
优选的，所述的调节抗原修复缓冲液的pH值使用1M的HCl溶液进行调节。
本申请的优点和有益效果：
1.在本申请的抗原修复缓冲液中，采用三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)的水溶液作为缓冲液；因为Tris为弱碱，在室温(25℃)下，它的pKa为8.1；根据缓冲理论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到9.2之间；Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得该pH值的缓冲液，并且同时加入乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)作为pH调节剂，使得缓冲液的pH更加稳定，同时也作为稳定剂，可以减慢反应，保持化学平衡，降低表面张力。
2.在本申请的抗原修复缓冲液中，采用吐温-20作为温和的表面活性剂，具有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力，降低抗体的非特异性结合；同时通过加入合适比例的丙三醇和吐温-20，使其与组织切片的亲和性较好(浸润性好)，且使缓冲液中的物质能均匀在溶液中分散，获得的修复液具有较好的浸润性、抗原修复缓冲液分布均一的优点。
3.在本申请的抗原修复缓冲液中，采用丙三醇可与水以任何比例溶解，作为一种混合溶剂，能够提高抗原修复缓冲液液的沸点，防止其在高温(100度左右)条件下过度挥发，而且其对抗原修复缓冲液中的活性成分和pH值的影响较小，且与组织切片的亲和性较好(浸润性好)，毒性低，不会对组织切片的修复造成过多影响。同时也具有延长保质期的功效，
4.在本申请的抗原修复缓冲液中，首次创造性的添加了ProClin950，ProClin950是一种高效生物防腐剂，ProClin950的加入，可以有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长，使抗原修复缓冲液无论在冷藏条件还是室温条件下，都能长期稳定地保存与使用；此外，ProClin950不会对诊断试剂中的关键酶与底物的结合速率产生影响，比如：辣根过氧化酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)，且也不会对抗体的结合产生影响。
5.本申请的抗原修复缓冲液其pH值稳定，主要以生物缓冲剂三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)的水溶液为基础缓冲液，再加入合适比例的乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)作为pH调节剂，使得缓冲液的pH更加稳定。
6.本申请通过以Tris、EDTA、吐温-20、丙三醇和ProClin950等物质的相互协同作用，构成制备抗原修复缓冲液的原料，该抗原修复缓冲液具有更好的浸润性，其在较高温度下不容易挥发，避免导致组织切片发生干化情况，其pH具有较好的稳定性且具有较好的抗菌保存功能；从而使抗原修复缓冲液能够在较少的用量下对组织切片进行抗原修复过程，平均每张组织切片所需的修复缓冲液只需100-150微升，修复效果好，能够配合全自动免疫组化染色机使用。
7.本申请限定了特定的pH范围，免疫组化检测方法主要是检测人体组织中的抗原，而不同抗原对修复液pH的需求是不一样的；修复液的pH值对抗原修复的影响分为三类：A、B、C；A类抗原在任何pH条件下，修复结果都很好；B类抗原在低和高pH时，修复结果很好，但是在中等pH时，修复效果很差；C类抗原随着pH的增高，修复结果也越来越好；而本申请这种特定的pH值范围是本申请这种特定抗原修复液的最佳的pH范围，修复效果理想。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是优选实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
一种高pH抗原修复缓冲液：每1000mL高pH抗原修复缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)1.10g，乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)0.31g，吐温-200.35mL，丙三醇150mL，ProClin9500.25mL和余量的纯化水，pH值范围为pH8.9～9.1。
制备方法：按配比称取Tris和EDTA，用纯化水溶解Tris和EDTA后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加吐温-20，溶解后再添加ProClin950，最后用纯化水定容至额定容量，使用1M NaOH溶液或HCl溶液调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH8.9～9.1范围内即可。
实施例2
一种高pH抗原修复缓冲液：每1000mL高pH抗原修复缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)1.20g，乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)0.35g，吐温-200.45mL，丙三醇300mL，ProClin9500.4mL和余量的纯化水，pH值范围为pH8.9～9.1。
制备方法：按配比称取Tris和EDTA，用纯化水溶解Tris和EDTA后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加吐温-20，溶解后再添加ProClin950，最后用纯化水定容至额定容量，使用1M NaOH溶液或HCl溶液调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH8.9～9.1范围内即可。
实施例3
一种高pH抗原修复缓冲液：每1000mL高pH抗原修复缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)1.25g，乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)0.41g，吐温-200.6mL，丙三醇550mL，ProClin9500.5mL和余量的纯化水，，pH值范围为pH8.9～9.1。
制备方法：按配比称取Tris和EDTA，用纯化水溶解Tris和EDTA后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加吐温-20，溶解后再添加ProClin950，最后用纯化水定容至额定容量，使用1M NaOH溶液或HCl溶液调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH8.9～9.1范围内即可。
实施例4
一种高pH抗原修复缓冲液：每1000mL高pH抗原修复缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)1.15g，乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)0.38g，吐温-200.5mL，丙三醇450mL，ProClin9500.35mL和余量的纯化水，pH值范围为pH8.9～9.1。
制备方法：按配比称取Tris和EDTA，用纯化水溶解Tris和EDTA后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加吐温-20，溶解后再添加ProClin950，最后用纯化水定容至额定容量，使用1M NaOH溶液或HCl溶液调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH8.9～9.1范围内即可。
实施例5
一种高pH抗原修复缓冲液：每1000mL高pH抗原修复缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)1.23g，乙二胺四乙酸二钠盐二水(EDTA)0.40g，吐温-20 0.55mL，丙三醇500mL，ProClin9500.5mL和余量的纯化水，pH值范围为pH8.9～9.1。
制备方法：按配比称取Tris和EDTA，用纯化水溶解Tris和EDTA后，加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加吐温-20，溶解后再添加ProClin950，最后用纯化水定容至额定容量，使用1M NaOH溶液或HCl溶液调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH8.9～9.1范围内即可。
对本申请的上述实施例获得的抗原修复缓冲液进行测试，其测试结果见下表1-2所示：
表1实施例1-5的修复液的pH测试结果
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 |
| pH | 8.91 | 8.99 | 9.08 | 8.95 | 9.10 |
表2实施例1-5的修复液的组织切片染色结果
注：表中表示阴性；+表示弱阳性；++表示中等阳性；+++表示强阳性；
以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请作任何限制，凡是根据本申请技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本申请技术方案的保护范围。
对比例1
采用与实施例1同一配方配制产品，区别在于实施例1中加入了ProClin950，设定为A0组产品；此处对比例中不加ProClin950，为A1产品。将A0产品和A1产品分别在冷藏条件下保存，发现A1产品在1～2个月内产品会慢慢变浑浊，有微生物的污染，而A0产品液体依旧澄清，无微生物污染。同样将A0产品和A1产品分别在室温条件下，A1产品在1～4周内(具体要看使用环境的洁净度)也会慢慢变浑浊，有微生物的污染；而A0产品液体依旧澄清，无微生物污染。说明本申请含有ProClin950的修复液能使产品无论冷藏条件还是室温条件下，都能长期稳定地保存与使用。
对比例2
采用与实施例1同一配方配制产品，区别在于实施例1中加入了ProClin950，为A0组产品；另一组产品不加ProClin950，为A1产品。现配现用，上机进行免疫组化染色测试：采用同一抗体工作液，相邻组织切片，相同预染程序和染色程序。染色结果基本一致。说明本申请含有ProClin950的修复液不会对诊断试剂中的关键酶与底物的结合速率产生影响，也不会对抗体的结合产生影响。
对比例3
采用实施例1与手工方法的抗原修复液(不含丙三醇)比对测试，在相同的两张组织切片上盖上玻片盖板后，分别滴加手工抗原修复缓冲液和本产品至组织切片和盖板处，发现实施例1的修复液能快速全面地覆盖组织，且比较均匀；而手工抗原修复液不能全面地覆盖组织切片，部分组织没有修复液浸润；说明本产品的浸润性好。
同样我们采用实施例1与手工方法的抗原修复液(不含丙三醇)比对测试，上机进行免疫组化染色测试：采用同一抗体工作液，相邻组织切片，相同预染程序和染色程序。染色过程中发现，在抗原修复过程中，手工抗原修复液出现液体沸腾现象，抗原修复过程结束后出现部分干片现象；而实施例1的修复液未发现上述现象，且实施例1的液体在抗原修复过程中均能全面覆盖组织；染色结果显示，实施例1的染色结果背景干净，染色强度符合要求，而手工抗原修复液的染色结果出现大片非特异染色背景，无法观察组织细胞的染色强度。
通过上述对比例和本申请的技术方案对比可知：本申请的修复液的浸润性能好，高温不挥发；本申请含有ProClin950的修复液不会对诊断试剂中的关键酶与底物的结合速率产生影响，也不会对抗体的结合产生影响；本申请含有ProClin950的修复液能使产品无论冷藏条件还是室温条件下，都能长期稳定地保存与使用。
Claims (8)
1.一种全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液，其特征在于：该抗原修复缓冲液的原料主要包括：三(羟甲基)氨基甲烷，乙二胺四乙酸二钠盐二水，吐温-20，丙三醇和ProClin 950；且该修复缓冲液的pH值范围为pH8.9～9.1。
2.根据权利要求1所述的全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液，其特征在于：每1000mL的该高pH抗原修复缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷1.10～1.25g，乙二胺四乙酸二钠盐二水0.31～0.41g，吐温-20 0.35～0.6mL，丙三醇150～550mL，ProClin9500.25～0.5mL和余量的纯化水，且该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH8.9～9.1。
3.根据权利要求2所述的全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液，其特征在于：三(羟甲基)氨基甲烷1.15～1.25g，乙二胺四乙酸二钠盐二水0.35～0.41g，吐温-200.45～0.6mL，丙三醇300～550mL，ProClin950 0.35～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH8.9～9.1。
4.根据权利要求3所述的全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液，其特征在于：每1000mL的该高pH抗原修复缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷1.20～1.25g，乙二胺四乙酸二钠盐二水0.38～0.41g，吐温-200.5～0.6mL，丙三醇400～550mL，ProClin950 0.4～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH8.9～9.1。
5.根据权利要求4所述的全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液，其特征在于：三(羟甲基)氨基甲烷1.22～1.25g，乙二胺四乙酸二钠盐二水0.40～0.41g，吐温-200.55～0.6mL，丙三醇450～550mL，ProClin950 0.45～0.5mL和余量的纯化水，该抗原修复缓冲液的pH值范围为pH8.9～9.1。
6.一种全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液的制备方法：其特征在于：具体步骤包括：
(1)按配比称取三(羟甲基)氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠盐二水，然后用纯化水将三(羟甲基)氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠盐二水溶解；
(2)向步骤(1)溶解后的溶液中加入配方量的丙三醇，完全溶解后添加配方量的吐温-20，溶解后再添加ProClin950，最后用纯化水定容至额定容量；
(3)然后调节抗原修复缓冲液的pH值，使其pH值在pH8.9～9.1范围内即可。
7.根据权利要求6所述的全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液的制备方法：其特征在于：所述的调节抗原修复缓冲液的pH值使用1M的NaOH溶液进行调节。
8.根据权利要求6所述的全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液的制备方法：其特征在于：所述的调节抗原修复缓冲液的pH值使用1M的HCl溶液进行调节。
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| CN202210091293.3A CN114594243A (zh) | 2022-01-26 | 2022-01-26 | 一种全自动免疫组化染色机适配的高pH抗原修复缓冲液及其制备方法 |
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Citations (2)
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| 汪世华等: "《抗体技术》", 军事医学科学出版社, pages: 183 * |
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