CN114560935A - 一种用于检测铁蛋白的单链抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开一种用于检测铁蛋白的单链抗体及其制备方法与应用，旨在提供一种检测准确性高，获得方法简单的用于检测铁蛋白的单链抗体；所述单链抗体氨基酸序列如SEQIDNO.1‑7任意所示；其制备方法包括下述步骤：(1)提取母鸡淋巴细胞，将抗体轻链可变区基因与重链可变区基因进行拼接，与噬菌粒载体连接并转化至感受态大肠杆菌中，构建单链抗体噬菌体展示文库；(2)以铁蛋白作为包被抗原，采用pH洗脱法筛选得到抗铁蛋白的单链抗体噬菌体；(3)将噬菌粒转化至宿主表达菌，进行诱导表达出单链抗体。

Description

一种用于检测铁蛋白的单链抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于检测铁蛋白的单链抗体。
背景技术
铁蛋白是一种无处不在的金属蛋白，具有纳米大小的水合氧化铁核心和具有笼状结构的蛋白质壳，存在于大多数身体的组织并在其中起着重要的作用细胞内铁的储存。测定血清铁蛋白对判断体内铁储存，机体在增殖、免疫抑制、致癌作用和血管生成等的情况发挥重要作用。血清铁蛋白升高与恶性肿瘤，如乳腺癌、肝细胞癌癌、非霍奇金淋巴瘤和肾细胞癌具有相关性。此外，血清铁蛋白升高与乳腺癌、胰腺癌和胃癌等的预后不良有关。铁蛋白可能是一种显着的各种癌症类型的诊断和预后的生物标志物。
目前，血清、血浆或其他生物体液的铁蛋白均可用放射性、非放射性免疫分析方法和乳胶凝集试验进行测定。不同于传统的单克隆抗体，重组抗体的生产成本更低，均一性好。因此，开发出采用噬菌体展示技术和原核表达技术制备的抗铁蛋白单链抗体势在必行。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测准确性高，获得方法简单的用于检测铁蛋白的单链抗体。
本发明提供的第一个技术方案如下：
一种用于检测铁蛋白的单链抗体，所述单链抗体氨基酸序列如SEQIDNO.1-7任意所示。
本发明提供的第二个技术方案如下：
上述单链抗体的方法，依次包括下述步骤：
(1)提取母鸡淋巴细胞，将抗体轻链可变区基因与重链可变区基因进行拼接，与噬菌粒载体连接并转化至感受态大肠杆菌中，构建单链抗体噬菌体展示文库；
(2)以铁蛋白作为包被抗原，采用pH洗脱法筛选得到抗铁蛋白的单链抗体噬菌体；
(3)将噬菌粒转化至宿主表达菌，进行诱导表达出单链抗体。
进一步的，上述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，所述的单链抗体噬菌体展示文库的构建方法包括：
3)首先在scFv抗体基因片段的两端引入了两个SfiI酶切位点；
4)SfiI酶切位点直接与pComb3Xss载体进行酶切重组，并用T4连接酶进行连接。
进一步的，上述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体，所述的scFv抗体基因片段的两端引入了两个SfiI酶切位点的采用的试剂和用量分别为：10×BufferM20μl；pComb3Xss20μg；SfiI酶1μl；RNasefreeH2O补至200μl。
进一步的，上述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，所述的scFv抗体基因片段的两端引入了两个SfiI酶切位点的采用的方法为：将步骤5)所述的试剂置于PCR仪中，50℃，孵育5h；加入22.5μl0.5MEDTA，混匀，使SfiI酶失活；将酶切产物通过0.7％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果；回收酶切产物。
进一步的，上述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，所述的SfiI酶切位点直接与pComb3Xss载体进行酶切重组采用的试剂及其用量为：10×Ligasebuffer20μl；酶切后的pComb3xss载体1.4μg；酶切后的scFv基因片段700ng；T4DNA连接酶10μl；RNasefreeH2O补至200μl。
进一步的，上述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，所述的scFv抗体基因片段以切胶回收扩增后的重链可变区基因与扩增后的可变区基因作为模板，以CSC-F和CSC-B分别为上游和下游引物进行重叠PCR扩增得到的。
进一步的，上述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，所述的采用的扩增试剂为：5×PrimeSTARbuffer10μl；dNTP 4μl；上游引物1μl；下游引物1μl；VHPCR产物250ng；VLPCR产物250ng；PrimeSTARHSDNAPolymerase 0.5μl；灭菌水补至50μl；扩增条件：98℃120s；98℃30s；52℃15s；72℃90s；重复上述过程25个循环；72℃10min；4℃∞。
进一步的，上述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，所述的重链可变区基因以cDNA为模板，以CSCVHoFL为上游引物，以CSCG-B为下游引物，扩增重链可变区基因；所述的轻链可变区基因以cDNA为模板，以CSCVK为上游引物，以CKJo-B为下游引物，扩增轻链可变区基因；
扩增时采用的试剂及其用量如下：5×PrimeSTARbuffer0μl；dNTP 4μl；上游引物1μl；下游引物1μl；cDNA 500ng；PrimeSTARHSDNAPolymerase 0.5μl；灭菌水补至50μl；扩增条件为：98℃120s，98℃30s，56℃15s；72℃90s；重复25个循环；再在72℃保持10min，后冷却4℃∞。
上述的单链抗体在检测铁蛋白中的应用。
与现有技术相比，本发明筛选出了特异性的抗铁蛋白单链抗体，通过柔性连接肽基因，将重链可变区基因和轻链可变区基因进行重叠PCR，获得全长单链抗体基因，适用于血液中铁蛋白的快速免疫检测，将在铁蛋白筛查中发挥巨大应用潜力。
附图说明
图1为以未经特异性抗原免疫的母鸡为模板，提取脾脏单个核细胞作为制备cDNA的模板，PCR扩增抗体重链可变区基因、轻链可变区基因的琼脂电泳图。
图中：VL为抗体轻链可变区基因；VH为抗体重链可变区基因；scFv为抗铁蛋白单链抗体全长基因。
图2为SDS-PAGE分析单链抗体蛋白的表达图；
图中：M-蛋白标准品；1-上清；2-流穿液；3-PBS洗涤液；4-洗脱蛋白
图3是单链抗体对铁蛋白的双抗夹心酶联免疫分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明技术方案的情况下对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
实施例1
本发明提供的一种用于检测铁蛋白的单链抗体，所述单链抗体氨基酸序列如SEQIDNO.1-7任意所示。
实施例2单链抗体的制备
步骤1.母鸡脾脏淋巴细胞的提取：
(1)将脾脏放置于盛有RPMI-1640培养液的培养皿中，随即放置于直径为200目的无菌细胞筛网中，顺时针碾磨，直至肉眼看到白色结缔组织；
(2)重复5次，每次碾磨2-3个脾脏，所得的粒细胞悬液收集在一起；
(3)将装有细胞悬液的离心管放到水平离心机中，1500rpm室温下离心5min；
(4)弃上清，加入6mLRPMI-1640培养液重悬，然后缓慢转移到装有3mL淋巴细胞分离液的离心管中，此时要注意保持液面平衡，保持分离的状态，1500rpm室温下离心20min；
(5)取中间白色云雾层，加入6mLRPMI-1640培养液中，1500rpm室温下离心5min；
(6)弃上清，加入1mLRPMI-1640培养液重悬。
步骤2.总RNA的提取
按照RNAisoPlus的说明书进行总RNA的提取，方法如下：
(1)将细胞重悬液倒入1.5mL离心管中，8000g4℃离心2min；
(2)弃上清，动作轻柔，注意不要破坏在离心管底部的细胞沉淀；
(3)加入RNAisoPlus(1mL每107个细胞)；
(4)充分混匀裂解细胞，直至肉眼看不到裂解液有明显的细胞沉淀；
(5)室温下静置5min；
(6)加入氯仿(1/5的RNAisoPlus，v/v)，上下颠倒溶液充分混匀，室温下静置5min；
(7)将离心管放置于离心机中，12000g4℃离心15min；
(8)从离心机中小心取出离心管，可以看到裂解液清晰分为三层；
(9)将上层裂解液转移到另一个新的离心管中；
(10)加入与RNAisoPlus等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀后，室温下静置10min；
(11)将离心管放置于离心机中，12000g4℃离心10min；
(12)小心弃去上清，加入与RNAisoPlus等体积的75％乙醇；
(13)将离心管放置于离心机中，7500g4℃离心5min；
(14)小心弃去上清，将离心管倒置，室温下干燥5min；
(15)加入25μl去离子水溶解沉淀，得到总RNA；
(16)紫外分光光度计测量OD260nm和OD280nm吸光值，计算提取得到的RNA浓度和纯度，保存于-80℃超低温冰箱中备用。
步骤3.cDNA的合成
以提取所得RNA为模板，使用PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit逆转录合成抗体编码基因的从DNA。过程如下：
(1)在PCR管中加入试剂及用量如表1所示
Figure BDA0003573236970000041
将反应置于PCR仪中，65℃保温5min后，冰上冷却；
(2)在上述反应体系中继续添加逆转录反应液，体系如表2所示：
表2
Figure BDA0003573236970000042
Figure BDA0003573236970000051
放置于PCR仪中，设置条件如表3所示：
表3
温度 时间
42℃ 60min
70℃ 15min
4℃ ∞
(3)将逆转录产物cDNA文库保存在-80℃冰箱备用。
步骤4拼接抗体轻链可变区基因与重链可变区基因
(1)、扩增抗体轻链(VL)和重链(VH)基因
扩增scFv抗体基因的引物由上海生物工程公司合成，引物序列如表4所示：
表4
Figure BDA0003573236970000052
备注：下划线标记碱基为酶切位点
(2)、分别扩增重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。
1)以cDNA为模板，CSCVHoFL和CSCG-B分别为上游和下游引物扩增重链可变区基因；以CSCVK和CKJo-B分别为上游和下游引物扩增轻链可变区基因。
在PCR管中加入试剂及用量如表5所示：
表5
Figure BDA0003573236970000053
Figure BDA0003573236970000061
在PCR仪中设置表6所示条件：
表6
Figure BDA0003573236970000062
2)琼脂糖凝胶电泳
①称取0.3g琼脂糖溶于30mLTAE缓冲液中，制成1％琼脂糖凝胶；
②微波炉加热至琼脂糖完全溶胶，呈无色透明状态；
③待凝胶冷却至50℃左右，加入1μlgoldview核酸染料，充分混匀；
④倒入制胶槽中，室温下冷却凝固；
⑤拔下梳子，PCR产物加入6×loadingbuffer，加入到对应的孔中；
⑥100V下运行20min；
⑦紫外灯下观察结果，参阅图1。
3)PCR产物纯化回收
①紫外灯下快速切取目的条带，切勿长时间在紫外灯下暴露以免DNA发生突变；
②用吸水纸先将凝胶表面水分吸干，称量凝胶块的重量，加入对应体积的Bindingbuffer(每1g凝胶对应加入1mlBindingbuffer)，在50-60℃中水浴溶解，每30s可以震荡一次，至凝胶完全溶解；
③将HiBindDNA柱子套在2ml收集管中；
④将溶解完毕的凝胶加入到HiBindDNA柱子中，每次加入700μl，室温12000rpm离心1min，弃去滤液，重复数次直接至全部结合液都上完柱；
⑤加入300μlBindingbuffer，室温12000rpm离心1min，弃去滤液；
⑥加入700μlWashingbuffer，室温12000rpm离心1min，弃去滤液；
⑦室温12000rpm空柱离心2min以甩干柱子中的残余的液体；
⑧把结合柱放在一个洁净的离心管中，往柱子中心加入50μlElutionbuffer，室温下静置2min；
⑨室温12000rpm离心1min，收集滤液，并用微量紫外分光光度计测量回收得到的DNA的浓度和纯度，-20℃保存备用。
4)重叠PCR连接重链与轻链
以切胶回收得到的VH与VL基因作为模板，以CSC-F和CSC-B分别为上游和下游引物进行重叠PCR扩增得到scFv基因。
①在PCR管中加入试剂及用量如表7所示：
表7
试剂 用量
5×PrimeSTARbuffer 10μl
dNTP 4μl
上游引物(10μM) 1μl
下游引物(10μM) 1μl
VHPCR产物 250ng
VLPCR产物 250ng
PrimeSTARHSDNAPolymerase 0.5μl
灭菌水 补至50μl
在PCR仪中设置以下如表8所示条件：
表8
Figure BDA0003573236970000071
Figure BDA0003573236970000081
②PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，将目的条件进行切胶回收，纯化后得到scFv抗体基因片段并测量回收所得DNA的浓度和纯度，-20℃保存备用。
步骤5：抗铁蛋白的噬菌体单链抗体库的构建
(1)载体pComb3X和单链抗体基因片段的酶切反应
由于所得scFv抗体基因片段已经在两端引入了两个SfiI酶切位点，可以直接与pComb3Xss载体进行酶切重组，并用T4连接酶进行连接。过程简述如下：
1)载体pComb3xss的酶切
①在PCR管中加入试剂及用量如表9所示：
表9
试剂 用量
10×BufferM 20μl
pComb3Xss 20μg
SfiI酶 1μl
RNasefreeH<sub>2</sub>O 补至200μl
②置于PCR仪中，50℃，孵育5h；
③加入22.5μl0.5MEDTA，混匀，使SfiI酶失活；
④将酶切产物通过0.7％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果；
⑤参照前述步骤，回收酶切产物。
2)scFv抗体基因片段的酶切
①在PCR管中加入试剂及用量如表10所示：
表10
Figure BDA0003573236970000082
Figure BDA0003573236970000091
②置于PCR仪中，50℃，孵育5h；
③加入22.5μl0.5MEDTA，混匀，使SfiI酶失活；
④将酶切产物通过1％琼脂糖凝胶电泳；
⑤参照前述步骤，回收酶切产物。
3)载体pComb3xss和单链抗体基因片段的连接与纯化
①在PCR管中加入试剂及用量如表11所示：
表11
试剂 用量
10×Ligasebuffer 20μl
酶切后的pComb3xss载体 1.4μg
酶切后的scFv基因片段 700ng
T4DNA连接酶 10μl
RNasefreeH<sub>2</sub>O 补至200μl
②置于PCR仪中，16℃反应过夜；
③次日，65℃孵育10min，使T4DNA连接酶热失活；
④将连接产物转移至1.5mL离心管，加入20μl3M乙酸钠(pH＝5.2)，再加入660μl无水乙醇；
⑤将离心管置于-20℃，过夜；
⑥次日，将连接产物4℃，12000rpm离心30min；
⑦此时可以看到白色DNA沉淀，弃上清，75％乙醇重悬沉淀；
⑧4℃，12000rpm离心15min；
⑨弃上清，将离心管倒置，静置数分钟，挥发残留的乙醇
⑩加入30μl无菌水复溶沉淀，样品置于-20℃保存备用。
(2)载体pComb3X和单链基因片段连接产物的电转化
为了提高抗体文库的库容，使用电转化提高转化效率，简述如下：
1)将E.coliER2738电转化感受态细胞从-80℃冰箱中取出，于冰上融化；
2)以25μl的电转感受态细胞为一个反应，加入3μl纯化得到的连接产物，冰浴10min；
3)将混合物迅速转移到预冷的电击杯中，在1.8KV，200Ω，25μF的条件下电击转化；
4)10s内迅速加入975μl37℃预热的SOC培养基，重悬转化后的细胞转移到50mL离心管中；
5)重复上述步骤9次，总共将30μl连接产物转化至E.coliER2738感受态细胞中；
6)将转化后的细胞置于摇床中，37℃，250rpm振荡复苏1小时；
7)取2μl培养物进行10倍梯度稀释，然后分别涂布在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上。将LB平板置于恒温培养箱中，37℃倒置培养过夜；
8)次日，计算梯度平板上的菌落数，计算得到原始抗体文库的库容；
9)在平板上随机挑取16个转化子，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中培养过夜，进行DNA测序，分析插入序列的多样性；
10)将步骤(6)中剩余的培养液加入到200mL的SB培养基中，加入200μl羧苄青霉素(50μg/mL)和200μl四环素(20μg/mL)，继续培养2小时，然后进行噬菌体文库的制备。
(3)禽源天然单链抗体噬菌体展示文库的构建
1)向上述菌液中添加1mL1×1013cfu/mL的辅助噬菌体，37℃静置30min，使噬菌体浸染含有scFv抗体基因的E.coliER2738；
2)将菌液置于摇床37℃，250rpm培养2h；
3)加入500μl卡那霉素70mg/mL卡那霉素，置于摇床37℃，250rpm培养过夜；
4)次日，将菌液转移到离心瓶中，4℃，10000rpm离心30min；
5)收集上清，加入125mL5×PEG/NaCl，冰上静置2h，沉淀辅助噬菌体；
6)4℃，10000rpm离心30min，可见白色噬菌体沉淀，加入100mLPBS清洗沉淀，并加入25mL5×PEG/NaCl沉淀，冰上静置2h；
7)4℃，10000rpm离心30min，用10mL含有0.1％BSA的无菌PBS复溶，并通过0.22μm滤膜除菌，取2μl测滴度，为禽源天然单链抗体噬菌体文库的库容，其余噬菌体放在-80℃冰箱备用。
步骤6抗铁蛋白单链抗体库的富集
(1)用CBS包被缓冲液将铁蛋白按照不同的轮数依次稀释至20、10、5、2μg/mL，按100μl/孔加入到96孔板中，4℃包被过夜；
(2)次日，弃去包被液，用PBST洗涤四次，按250μl/孔加入3％脱脂奶粉，37℃孵育封闭1h；
(3)弃去封闭液，用PBST洗涤四次，加入100μl/孔禽源天然噬菌体单链抗体文库，标记为Input，37℃孵育2h；
(4)将孔中的噬菌体吸出，用PBST剧烈吹吸10次；
(5)加入100μl/孔0.1M甘氨酸-盐酸(pH＝2.2)洗脱噬菌体，37℃孵育10min；
(6)往孔中加入50μl1MTris-HCl(pH＝8.8)中和洗脱的噬菌体；
(7)收集上清液，取2μl测定滴度，其余的上清液加入2mL新鲜培养的E.coliER2738菌液(OD600＝0.8)中，37℃静置30min；
(8)加入6mL含50μg/mL羧苄青霉素的LB溶液中，置于37℃摇床中振荡培养2h；
(9)加入1mL辅助噬菌体(1×1013cfu/mL)，补加91mLLB培养基和羧苄青霉素(终浓度为50μg/mL)，置于37℃摇床中振荡培养2h；
(10)加入卡那霉素(终浓度为70μg/mL)，置于37℃摇床中振荡培养过夜；
(11)次日，用5×PEG/NaCl沉淀噬菌体，噬菌体用2mL含有0.1％BSA的无菌PBS复溶，得到的噬菌体标记为Output，再投入下一轮淘选；淘选条件如表12所示：
表12
轮数 包被抗原(μg/mL) 洗涤次数 Tween-20(％)
1 20 10 0.05
2 10 15 0.1
3 5 20 0.5
4 2 20 0.5
步骤6：单链抗体的检测及强阳性株的筛选
(1)淘选结果的评估
1)用CBS包被缓冲液将铁蛋白稀释至1μg/mL，按100μl/孔加入到96孔板中，4℃包被过夜；另包被等量的脱脂奶粉作为阴性对照；
2)次日，弃去包被液，用PBST洗涤四次，按250μl/孔加入3％脱脂奶粉，37℃孵育封闭1h；
3)用PBST洗板四次，分别加入100μl/孔筛选前与每一轮扩增后的噬菌体文库(1×1011cfu/mL)，37℃孵育1h；
4)将孔内的噬菌体溶液弃去，用PBST洗板四次，加入100μl/孔抗M13-HRP酶标抗体(1：10000稀释)，37℃孵育1h；
5)将孔内的二抗弃去，用PBST洗板四次，加入100μl/孔TMB显色液，37℃反应15min；
6)加入50μl/孔2MH2SO4终止反应，置于酶标仪中读取OD450的吸光值。
(2)特异性单链抗体阳性克隆的筛选
1)从第三轮和第四轮筛选后的Output噬菌体滴度测定的板上，随机挑取40个单克隆菌落，接种到1ml含有50μg/mL羧苄青霉素中，置于37℃，250rpm摇床中振荡培养数小时(OD600＝0.8)；
2)加入10μl辅助噬菌体(1×1013cfu/mL)，37℃静置15min使噬菌体完成浸染；
3)置于37℃，250rpm摇床中振荡培养2h；
4)加入终浓度为70μg/mL的卡那霉素，置于37℃，250rpm摇床中振荡培养过夜；
5)次日，10000g离心25min，收集噬菌体上清备用；
6)用CBS缓冲液将铁蛋白稀释成1μg/mL，100μl/孔加入到酶标板中，4℃过夜，同样的包被OVA作为阴性对照；
7)次日，弃去包被液，用PBST洗涤四次，配制3％脱脂奶粉，按250μl/孔加入到96孔板中，37℃孵育封闭1h；
8)将封闭液甩去，用PBST洗涤四次，往加入100μl/孔的噬菌体上清，混匀，37℃孵育封闭1h；
9)将上述液甩出，用PBST洗涤四次，加入100μl/孔抗M13-HRP酶标抗体(1：10000稀释)，37℃孵育1h；
10)将孔内的二抗弃去，用PBST洗板四次，加入100μl/孔TMB显色液，37℃反应15min；
11)加入50μl/孔2MH2SO4终止反应，置于酶标仪中读取OD450的吸光值；
步骤7抗皮质醇单链抗体的原核表达与纯化
(1)噬菌粒的提取：
1)收集过夜培养的阳性克隆培养液，10000g室温下离心1min；
2)弃去上清，加入250μlSolutionI/RNaseA，反复吹吸直至细菌沉淀完全重悬；
3)加入250μlSolutionII，轻柔的上下颠倒离心管，可以看到菌液逐渐透明；
4)加入350μlSolutionIII，轻柔的上下颠倒离心管，可以看到产生白色的沉淀；
5)13000g室温下离心10min；
6)将上清转移至
Figure BDA0003573236970000121
结合柱中，套上2mL的收集管；
7)13000g室温下离心1min；
8)弃去滤液，加入500μlHBCbuffer；
9)13000g室温下离心1min；
10)弃去滤液，加入700μlDNAWashBuffer；
11)13000g室温下离心1min；
12)弃去滤液，13000g室温下空柱离心2min；
13)将结合柱转移到一个洁净的1.5mL离心管中，加入30μl的elutionbuffer，静置1min；
14)13000g室温下离心1min后得到滤液，取出一部分用于DNA测序，其余保存在-20℃冰箱备用。
(2)单链抗体蛋白的原核表达
1)将阳性克隆接种于5mL含有50μg/mLLB培养液中，置于37℃，250rpm摇床中振荡培养过夜；
2)次日，按照1％接种量将上述过夜培养的菌液转接至200mL含有50μg/mLLB培养液中，置于37℃，250rpm摇床中振荡培养数小时至OD600＝0.8；
3)加入IPTG使得终浓度为0.5mM，置于30℃，250rpm摇床中振荡培养过夜；
4)将培养过夜的菌液收集到离心瓶中，4℃，5000g离心20min；
5)弃上清，称量菌体重量，加入B-PER细菌裂解液(每1g细菌沉淀加入4mLB-PER)，反复吹吸重悬菌体，室温上下颠倒15min，充分裂解细菌；
6)4℃，15000g离心10min；
7)收集上清液，为可溶性蛋白，用于后续纯化。
(3)单链抗体蛋白的纯化
1)吸取Ni-NTA基质，重复3次离心置换保存液为PBS，加入上述可溶性蛋白，室温上下颠倒混匀1h；
2)将纯化柱垂直固定，往纯化柱中加入上述液，收集样品流穿液；
3)加入5倍柱体积的平衡缓冲液(含有10mM咪唑的PBS)，洗脱杂蛋白；
4)加入5倍柱体积的洗脱缓冲液(含有250mM咪唑的PBS)，分别收集洗脱液，直至流穿液在A280时的信号值接近于0；
5)将纯化的抗体通过SDS-PAGE电泳检测；
6)收集得到的纯化后的单链抗体溶液装入透析袋中，在PBS中透析三天，每天换液两次以除去多余的咪唑等其他杂质。
实施例3单链抗体的应用
(1)双抗夹心ELISA标准曲线的建立
1)用CBS将多抗稀释至2μg/ml，按100μl/孔加入96孔酶标板，4℃包被过夜；
2)次日，将孔板内的包被缓冲液体甩出，PBST洗板四次；
3)加入270μl/孔3％脱脂奶粉封闭液，37℃孵育1h；
4)加入1μg/mL单链抗体(100μl)和等体积的一系列浓度的铁蛋白标准溶液，混匀，37℃孵育1h；
5)弃孔内液体，PBST洗板四次；
6)加入1:10000稀释的HRP酶标记的Anti-HA鼠单抗(100μl/孔)，37℃孵育1h；
7)弃孔内液体，PBST洗板五次；
8)加入100μl/孔TMB显色底物液，37℃避光反应15min；
9)加入50μl/孔2MH2SO4终止反应；
10)在酶标仪中读取OD450；
11)以铁蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)加标回收实验
1)每个血清样本取50μl，用PBS对其稀释200倍；
2)向其中添加铁蛋白标准品使其浓度为50、20、10ng/mL；
3)分别用基于单链抗体建立的双抗夹心ELISA检测样品中铁蛋白的含量，并计算其回收率等。
实验数据如表12所示：
表12加标的血清样品中回收铁蛋白
Figure BDA0003573236970000141
序列表
<110> 广东工业大学
<120> 一种用于检测铁蛋白的单链抗体及其制备方法与应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 256
<212> PRT
<213> 单链抗体(single chain antibody fragment)
<400> 1
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Gly Trp Phe
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asp Ser
35 40 45
Thr Asn Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser
50 55 60
Gly Ser Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu
65 70 75 80
Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ser Ala Asp Ser Ser Tyr Val Ala Ile Phe
85 90 95
Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu Asp Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Gly Leu Ser Leu Val Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Thr Ser Ser
165 170 175
Gly Ile Gly Thr Asn Tyr Gly Ser Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Lys Ser Ala Tyr Ser
210 215 220
Gly Tyr Tyr Trp Asp Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ile Asp Ala Trp Gly
225 230 235 240
His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln
245 250 255
<210> 2
<211> 255
<212> PRT
<213> 单链抗体(single chain antibody fragment)
<400> 2
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Gln Asn Asp Lys
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Gly Asn Val Asp Ser Gly Asn Val Asp Ser Ser Ala Gly
85 90 95
Ile Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr
115 120 125
Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Ala Leu Ser
130 135 140
Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr Ala Met Met
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile
165 170 175
Tyr Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Thr Tyr Glu Ser Ala Val Lys Gly Arg
180 185 190
Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Leu Arg Leu Gln Leu
195 200 205
Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Ser
210 215 220
Thr Ala Asn Tyr Cys Gly Thr Ala Glu Cys Ile Asp Ala Trp Gly His
225 230 235 240
Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln
245 250 255
<210> 3
<211> 254
<212> PRT
<213> 单链抗体(single chain antibody fragment)
<400> 3
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Tyr Gly Trp Phe Gln
20 25 30
Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asn Asn Asn
35 40 45
Asn Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Val Tyr Tyr Cys Gly Ser Ala Asp Ser Ser Tyr Ala Gly Ile Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu Asp Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Gly Leu Ser Leu Val Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu Thr Ser Tyr Asp Met Gln Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Asn Val Ala
165 170 175
Gly Ser Ser Thr Asn Tyr Gly Ser Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Ala Gly Gly
210 215 220
Tyr Asn Trp Tyr Tyr Glu Ala Gly Asp Ile Asp Ala Trp Gly His Gly
225 230 235 240
Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln
245 250
<210> 4
<211> 255
<212> PRT
<213> 单链抗体(single chain antibody fragment)
<400> 4
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Ser Asn Asp Lys
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Glu Asp Ser Thr Thr Gly Tyr Thr Gly Ile
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu
115 120 125
Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Thr Leu Ser Leu
130 135 140
Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ala Trp
145 150 155 160
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Tyr
165 170 175
Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Gly Ser Ala Val Lys Gly Arg Ala
180 185 190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Leu Arg Leu Gln Leu Asn
195 200 205
Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Ser Ala
210 215 220
Tyr Cys Cys Asp Gly Asp Ser Ala Asp Gly Ile Asp Ala Trp Gly His
225 230 235 240
Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln
245 250 255
<210> 5
<211> 257
<212> PRT
<213> 单链抗体(single chain antibody fragment)
<400> 5
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Glu Ser
35 40 45
Thr Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser
50 55 60
Gly Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu
65 70 75 80
Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asp Ser Gly Ile
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu
115 120 125
Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Arg Gly Ala Leu Ser Leu
130 135 140
Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Phe Phe Ser Ser His Asp Met Val Trp
145 150 155 160
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Thr Ala Val Lys Gly Arg Ala
180 185 190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn
195 200 205
Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys Thr Arg Gly Gly
210 215 220
Trp Trp Ala Gly Ala Pro Gly Tyr Ala Ala Gly Ile Ile Asp Ala Trp
225 230 235 240
Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Gln Ala Gly
245 250 255
Gln
<210> 6
<211> 256
<212> PRT
<213> 单链抗体(single chain antibody fragment)
<400> 6
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly Trp Tyr Gln
20 25 30
Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Trp Asp Asp
35 40 45
Gln Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ser Gly
50 55 60
Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala
65 70 75 80
Val Tyr Phe Cys Gly Ser Gly Asp Ser Ser Thr Ser Ala Ile Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu Asp Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Ala Leu Ser Leu Val Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Arg Gly Met Gly Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile Ala Gly Ile Ser Asn Ser
165 170 175
Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Gly Ala Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Ile Pro Tyr Gly
210 215 220
Cys Asp Ala Tyr Gly Cys Gly Ala Tyr Gly Ser Ile Asp Ala Trp Gly
225 230 235 240
His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln
245 250 255
<210> 7
<211> 258
<212> PRT
<213> 单链抗体(single chain antibody fragment)
<400> 7
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asp Asn Asn Asn
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Ala Ser Ala Asp Ser Ser Asn Asn Pro Ala Ile Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu Asp Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Thr Leu Ser Leu Val Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gln Met Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Phe Val Ala Ala Ile Asn Ala Phe
165 170 175
Gly Asn Ser Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asp Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys Thr Lys Tyr Leu Tyr Ala
210 215 220
Tyr Cys Gly Thr Gly Thr Trp Cys Pro Val Gly Ser Ser Ile Asp Ala
225 230 235 240
Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Gln Ala
245 250 255
Gly Gln
<210> 12
<211> 71
<212> DNA/RNA
<213> CSCVHoFL
<400> 12
ggtcagtcct ctagatcttc cggcggtggt ggcagctccg gtggtggcgg ttccgccgtg 60
acgttggacg a 71
<210> 11
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> CSCG-B
<400> 11
ctggccggcc tggccactag tggaggagac gatgacttcg gtcc 44
<210> 11
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> CSCVK
<400> 11
gtggcccagg cggccctgac tcagccgtcc tcggtgtc 38
<210> 11
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> CKJo-B
<400> 11
ggaagatcta gaggactgac ctaggacggt cagg 34
<210> 12
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> CSC-F
<400> 12
gaggaggagg aggaggaggt ggcccaggcg gccctgactc ag 42
<210> 13
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> CSC-B
<400> 13
gaggaggagg aggaggagga gctggccggc ctggccacta gtggagg 47

Claims (10)

1.一种用于检测铁蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体氨基酸序列如SEQ IDNO.1-7任一所示。
2.制备权利要求1所述用于检测铁蛋白的单链抗体方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
(1)提取母鸡淋巴细胞，将抗体轻链可变区基因与重链可变区基因进行拼接，与噬菌粒载体连接并转化至感受态大肠杆菌中，构建单链抗体噬菌体展示文库；
(2)以铁蛋白作为包被抗原，采用pH洗脱法筛选得到抗铁蛋白的单链抗体噬菌体；
(3)将噬菌粒转化至宿主表达菌，进行诱导表达出单链抗体。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的单链抗体噬菌体展示文库的构建方法包括：
1)首先在scFv抗体基因片段的两端引入了两个SfiI酶切位点；
2)SfiI酶切位点直接与pComb3Xss载体进行酶切重组，并用T4连接酶进行连接。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体，其特征在于，所述的scFv抗体基因片段的两端引入了两个SfiI酶切位点的采用的试剂和用量分别为：10×BufferM20μl；pComb3Xss20μg；SfiI酶1μl；RNasefreeH2O补至200μl。
5.根据权利要求3所述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的scFv抗体基因片段的两端引入了两个SfiI酶切位点的采用的方法为：将步骤5)所述的试剂置于PCR仪中，50℃，孵育5h；加入22.5μl0.5MEDTA，混匀，使SfiI酶失活；将酶切产物通过0.7％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果；回收酶切产物。
6.根据权利要求3所述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的SfiI酶切位点直接与pComb3Xss载体进行酶切重组采用的试剂及其用量为：10×Ligasebuffer20μl；酶切后的pComb3xss载体1.4μg；酶切后的scFv基因片段700ng；T4DNA连接酶10μl；RNasefreeH2O补至200μl。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的scFv抗体基因片段以切胶回收扩增后的重链可变区基因与扩增后的可变区基因作为模板，以CSC-F和CSC-B分别为上游和下游引物进行重叠PCR扩增得到的。
8.根据权利要求7所述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的采用的扩增试剂为：5×PrimeSTARbuffer10μl；dNTP 4μl；上游引物1μl；下游引物1μl；VHPCR产物250ng；VLPCR产物250ng；PrimeSTARHSDNAPolymerase 0.5μl；灭菌水补至50μl；扩增条件：98℃120s；98℃30s；52℃15s；72℃90s；重复上述过程25个循环；72℃10min；4℃∞。
9.根据权利要求7所述的一种用于检测铁蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的重链可变区基因以cDNA为模板，以CSCVHoFL为上游引物，以CSCG-B为下游引物，扩增重链可变区基因；所述的轻链可变区基因以cDNA为模板，以CSCVK为上游引物，以CKJo-B为下游引物，扩增轻链可变区基因；
扩增时采用的试剂及其用量如下：5×PrimeSTARbuffer0μl；dNTP 4μl；上游引物1μl；下游引物1μl；cDNA 500ng；PrimeSTARHSDNAPolymerase 0.5μl；灭菌水补至50μl；扩增条件为：98℃120s，98℃30s，56℃15s；72℃90s；重复25个循环；再在72℃保持10min，后冷却4℃∞。
10.权利要求1所述的单链抗体在检测铁蛋白中的应用。
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