CN117686722A - 一种s100a4纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种S100A4纳米抗体及其应用。本发明公开了一种S100A4纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。本发明还公开了一种S100A4纳米抗体基因的筛选方法。实施例结果表明，S100A4纳米抗分子量大小约为15kDa，符合纳米抗体大小，纯化的纳米抗体可用于Western blottting一抗。

Description

一种S100A4纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种S100A4纳米抗体及其应用。
背景技术
单域抗体是骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体，单域抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又被称为纳米抗体。与传统的四联体抗体相比，纳米抗体的主要特点有：分子量小，结构简单，理化性质稳定等。纳米抗体的优良特性使其在多种方面具有优势：在抗体进入机体方面，纳米抗体能够穿过动物机体内的一些保护性屏障进入发病部位发挥作用，如血脑屏障、血睾屏障等；在抗原抗体结合方面，能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点，如GPCR、离子通道和酶活中心等；在降低生产成本方面，纳米抗体结构简单易于体外表达，同时体外表达不易产生包涵体，生产工艺简单。
S100A4也称为纤维母细胞特异性蛋白(FSP1)，兼具细胞内和细胞外活性，并具有调节某些信号通路蛋白的功能，其介导的Ca2+信号通路在细胞的增殖、分化、粘附、迁移、形态发生以及凋亡等生理过程中起到了决定性的作用；S100A4通常与丝状肌动蛋白共聚，并与非肌性肌球蛋白原和非肌性肌球蛋白相互作用，还可与细胞骨架蛋白直接结合，或通过调节钙黏蛋白/连环蛋白、CD44/细胞骨架复合物的细胞骨架连接，活化细胞外基质水解酶，来改变细胞动力学模式和迁移能力，参与细胞运动；在哺乳动物发育期间，S100A4广泛存在于胚胎巨噬细胞和分化的间充质组织当中，以及从上皮向间充质转变的过程中其表达水平较高。此外，S100A4在脑损伤、心肌损伤、类风湿性关节炎和组织纤维化等病变组织中也存在过度表达情况。因此，需要一种能够特异性结合S100A4蛋白，用于检测动物组织中S100A4的表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种S100A4纳米抗体及其应用，本发明提供的纳米抗体不仅能够特异性结合S100A4蛋白，可用于在免疫组织化学和Western Blotting法检测动物组织中S100A4的表达，还具有小分子量、稳定的理化特征、高亲和力和简单结构、易于重组表达制备以及能够穿过血脑屏障等优点。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种S100A4纳米抗体的筛选方法如下：
1)将黑素瘤纳米抗体文库进行第一轮淘洗，得到B16-S100A4-VHH1；
第一轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为20μg-30μg/ml；
2)将步骤1)得到的B16-S100A4-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；
第二轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为10μg/ml；
第三轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为8μg/ml；
第四轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为5μg/ml；
3)将步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一次振荡培养和第一次离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二次振荡培养和第二次离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同S100A4蛋白的反应性，以确定所述菌株与S100A4蛋白具有反应性；
第一次振荡的温度为35～42℃，第二次振荡的温度为28～32℃；
第一离心的离心力为7500～8500g，第二离心的离心力为2000～2100g；
5)将步骤4)与S100A4蛋白具有反应性的菌株进行质粒(pCANTAB5)提取，用该质粒的通用引物，得到纳米抗体VHH基因序列，并进行比对确认为VHH序列。
所述质粒引物包括质粒上游引物(SEQ ID No.6)和质粒下游引物(SEQ ID No.7)；
优先的，步骤1所述的黑素瘤纳米抗体文库是根据中国专利CN201910058785.0公开的方法制备的；
本发明提供了一种S100A4纳米抗体，所述S100A4纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
优选的，所述S100A4纳米抗体的分子量为14.5-15.5KD。
本发明还提供了编码所述的S100A4纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列。
优选的，所述核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本发明还提供了一种重组质粒，包含核苷酸序列SEQ ID No.5。
本发明还提供了一种表达菌株，包含上述重组质粒。
本发明还提供了上述技术方案所述的S100A4纳米抗体在制备结合S100A4蛋白的免疫相关技术中的应用。
有益效果
本发明所述的纳米抗体筛选方法利用噬菌体展示技术进行淘筛，噬菌体展示技术能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面,进而通过亲和富集法筛选表达有特异性蛋白质的噬菌体。
本发明采用噬菌体展示实验技术研发的S100A4纳米抗体能够特异性结合S100A4蛋白。
本发明所述S100A4纳米抗体能够特异性结合S100A4蛋白，可用于在免疫组织化学和Western Blotting法检测蒙古牛皮肤、血液和脂肪等组织中S100A4的表达。
本发明所述S100A4纳米抗体分子量大小约为15kDa，符合纳米抗体大小，具有小分子量、稳定的理化特征、高亲和力和简单结构、易于重组表达制备以及能够穿过血脑屏障等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Western Blotting对纯化的S100A4-VHH-His检测。
图2为考马斯亮蓝检测纯化的S100A4-VHH检测。
图3为Western Blot法用S100A4-VHH纳米抗体检测蒙古牛血液淋巴细胞中S100A4蛋白的表达
图4为免疫组织化学法用S100A4纳米抗体检测蒙古牛皮肤中S100A4表达分布，左图为实验组，右图为对照组。
具体实施方式
本发明提供了一种S100A4纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种S100A4纳米抗体的筛选方法如下：
1)将黑素瘤纳米抗体文库(根据中国专利CN201910058785.0公开的方法制备即可)进行第一轮淘洗，得到B16-S100A4-VHH1；
第一轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为20μg-30μg/ml；
2)将步骤1)得到的B16-S100A4-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；
第二轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为10μg/ml；
第三轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为8μg/ml；
第四轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为5μg/ml；
3)将步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一次振荡培养和第一次离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二次振荡培养和第二次离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同S100A4蛋白的反应性，以确定所述菌株与S100A4蛋白具有反应性；
第一次振荡的温度为35～42℃，第二次振荡的温度为28～32℃；
第一次离心的离心力为7500～8500g，第二次离心的离心力为2000～2100g；
5)将步骤4)与S100A4蛋白具有反应性的菌株进行质粒(pCANTAB5)提取，用该质粒的通用引物进行测序，得到纳米抗体VHH基因序列，并进行比对确认为VHH序列。将正确的纳米抗体VHH片段与表达载体(pCold)连接，得到重组质粒；
所述质粒引物包括质粒上游引物(SEQ ID No.6)和质粒下游引物(SEQ ID No.7)；
6)将步骤5)得到的重组质粒转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，将所述蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blotting鉴定，根据分子量大小和his-tag标签鉴定为S100A4纳米抗体。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的S100A4纳米抗体进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
S100A4纳米抗体的筛选，具体包括以下步骤：
(1)根据中国专利CN201910058785.0公开的方法制备黑素瘤纳米抗体文库，从已制备的黑素瘤纳米抗体文库进行第一轮淘洗，得到B16-S100A4-VHH1，分装冻存于-80℃。
淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，以S100A4蛋白包被免疫管。
淘洗方法如下：
1)将500μl黑素瘤纳米抗体文库接种于100ml 2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD600为0.4；
2)加入KM13辅助噬菌体，100ml菌液加100μl KM13辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后振荡培养30min；
3)4000×g离心10min，去除培养基上清，用100ml 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；
4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10min，将上清转至新的离心瓶并加入20ml PEG/NaCl溶液，混匀冰浴90min；
5)11000×g，4℃离心30分钟，弃上清，而后再次离心2min，彻底吸尽上清；
6)使用1.3ml PBS缓冲液重悬沉淀，而后将其分装于2个1.5ml离心管中，11600×g离心10min；
7)回收上清，命名为SR-B16-S100A4-VHH1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.2mlMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的S100A4-VHH1)，待用。
包被蛋白处理：
1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。
2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。
3)在免疫管中加入2ml上述淘洗步骤7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。
4)在每管中加入2ml 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2ml Tris-HCl溶液中和。
5)将洗脱的噬菌体(命名为SC-B16-S100A4-VHH1)转至50ml离心管，并加入16mlOD600为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液。(并在免疫管内加入4ml的OD600为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24ml的体积)。
6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。
7)使用1ml 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。
8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为B16-S100A4-VHH1，分装冻存于-80℃。
测定拯救噬菌体滴度：SR-B16-S100A4-VHH1进行梯度稀释，稀释度从10-7～10-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μl OD600为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算SR-B16-S100A4-VHH1滴度。
测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算SC-B16-S100A4-VHH1滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比I/O。
在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗：S100A4蛋白包被浓度分别为20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml；拯救噬菌体滴度测定稀释度分别为10-7～10-12、10-8～10-11、10-8～10-11；洗脱噬菌体M13-S100A4的滴度测定稀释度分别为10-1～10-6、10-1～10-6、10-8～10-11；洗脱的噬菌体用Tris-HCl溶液(1M，pH值为7.4)中和后，取200μl噬菌体感染800μl OD600为0.4的TG1菌液(取100μl进行梯度稀释，剩余的进行保菌)，而后做10-3～10-6共4个稀释度，每个稀释度涂布3个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，每板100μl菌液，置于30℃培养过夜；对培养板菌落计数，计算滴度，并将培养板标记为平板，置于4℃冰箱待用。
特异性纳米抗体的筛选：
单克隆噬菌体上清的制备：从平板各挑取96个单克隆菌株共接种1块96孔深孔培养板，每孔中均含1ml 2×YTAG培养基，培养板分别标记为S100A4文库菌株，于30℃振荡培养。8h后，从每孔中吸取20μl菌液接种于180ul 2×YTAG培养基，于37℃振荡培养，原平板的剩余菌液中则加入60μl 60％的甘油至终浓度为15％，冻存于-80℃。转接平板于37℃振荡培养1h后，在每孔中加入50μl KM13(60μl KM13+12ml 2×YTAG培养基)辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后37℃振荡培养40min。1800×g离心深孔板10min，弃上清并在每孔中加入400ul 2×YTAK培养基重悬沉淀，30℃振荡培养过夜。次日，最大转速2020xg离心20分钟，从各孔中吸250μl噬菌体上清转移至新的深孔板中，并在每孔中加入250μl封闭液(含3％BSA的PBS缓冲溶液)常温共孵育1小时，待用于间接ELISA检测。
特异性单克隆噬菌体的鉴定：通过间接ELISA试验检测噬菌体上清同S100A4蛋白的反应性，具体方法如下：设计实验组、阴性对照组和BSA对照组，实验组与阴性对照组使用S100A4蛋白，包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/ml，BSA对照组使用BSA蛋白包被96孔酶标板，包被浓度为2ug/ml，每孔100μl，置于4℃过夜。次日弃孔内包被液体，在每孔中加入100μl封闭液于37℃封闭1h。弃孔内封闭液，实验组和BSA对照组在每孔分别中加入100μl封闭液处理过的四轮筛选得到的噬菌体上清作为一抗，阴性对照加入等量PBS，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板10次。在每孔中加入100μl二抗(HRP-M13 Antibody，稀释度1:6000)，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板10次。在每孔中加入100μl显色底物，避光反应5～15min，而后在每孔中加入50μl终止液终止反应。将96孔酶标板置于读板机上读取OD450吸收值。对ELISA结果进行分析并确定阳性菌株。
将阳性孔对应的甘油菌接种于5ml 2×YTAG培养基，37℃振荡培养后将菌液送测序公司测序。待测序结果返回后，对测序结果进行分析，选择测序正确的菌株再次重复上述实验，验证阳性菌株。
测序和特异性单克隆噬菌体ELISA筛选结果：
通过测序公司进行测序，选择能够正确表达VHH片段克隆菌株的进行间接ELISA方法检测单克隆对应的噬菌体上清同S100A4蛋白的反应性，S100A4蛋白包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/ml，每孔50μl，置于4℃过夜。次日弃孔内包被液体，在每孔中加入100μl封闭液于37℃封闭1小时。弃孔内封闭液，PBST洗液洗板10次，选取96孔板的最后一列作为对照组加入100μl的PBS，在其余每孔分别中加入100μl封闭液处理过的噬菌体上清作为一抗，37℃孵育1小时。用PBST洗液洗板10次。在每孔中加入100μl二抗(HRP-M13 Antibody，稀释度1:10000)，37℃孵育1小时。用PBST洗液洗板10次。在每孔中加入50μl显色底物，37℃避光反应5分钟，而后在每孔中加入50μl终止液终止反应。将96孔酶标板置于读板机上读取OD450吸收值。对ELISA结果进行分析并确定阳性孔号。这4个单克隆均同S100A4蛋白有不同程度的反应性(表1)。
表1S100A4单克隆ELISA筛选结果
测序正确并预测的氨基酸序列为SEQ ID No.1(S100A4-VHH-A10)、SEQ ID No.2(S100A4-VHH-B9)、SEQ ID No.3(S100A4-VHH-E2)、SEQ ID No.4(S100A4-VHH-G3)所示。
实施例2
原核表达载体的构建及S100A4纳米抗体表达
选择阳性较强的1个克隆S100A4-VHH1-A10(SEQ ID No.1)做为特异性单克隆阳性菌株，进行后续试验。
对特异性单克隆进行后续原核表达载体的构建，具体方法为：选取S100A4-VHH1菌株提取质粒后与PMD19-T载体进行连接，进行蓝白斑筛选后送去测序公司测序，选取测序成功的菌株和Pcold I载体提取质粒进行双酶切后将二者进行连接，转化入DH5α后送测序公司进行测序，将测序成功的菌株转化入BL21(DE3)，成功构建S100A4-VHH1-A10蛋白表达菌株，S100A4纳米抗体诱导表达并纯化。
实施例3
S100A4纳米抗体检测
纯化：将诱导表达后的菌液进行超声破碎离心后取上清，用His标签镍柱进行纯化，配制500mM的咪唑洗脱液，进行5％-100％的梯度洗脱后发现在20％的咪唑洗脱梯度中有较为单一的S100A4-VHH-His目的条带。
S100A4-VHH-His检测。将纯化的纳米抗体作为待检蛋白进行Western blottting鉴定：配制15％的分离胶和5％的浓缩胶，将菌液的上清原液、上清过柱液、结合液和20％的咪唑洗脱液分别加入泳道，电泳结束后进行湿转，后37℃封闭1h,使用HRPAnti His-TagMouse抗体1:20000配制，37℃孵育1h,后用TBST进行洗膜并曝光，检测鉴定纯化的纳米抗体，将20％咪唑洗脱液条带与结合液的空白对照作对比，根据上清原液的蛋白条带位置并通过分子量大小和特异性结合判断为S100A4纳米抗体。结果如图1所示，结果发现分子量大小约为15kDa，符合纳米抗体大小。
考马斯亮蓝检测。将纯化的纳米抗体作为待检蛋白进行考马斯亮蓝鉴定，判断纯化的纳米抗体是否单一。配制15％的分离胶和5％的浓缩胶，将菌液的上清原液、上清过柱液、结合液和20％的咪唑洗脱液分别加入泳道，电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液将胶体染色，结果如图2所示。可以看到原液上清和过柱液的泳道中杂蛋白较多，结合液对照中无蛋白条带，20％咪唑洗脱液中目的条带较为单一。
S100A4-VHH-S100A4纳米抗体检测。配制12％的分离胶和5％的浓缩胶选取蒙古牛血淋巴细胞蛋白样品分别加入泳道，电泳结束后进行转膜，后37℃封闭1h，将S100A4-VHH-His作一抗，4℃过夜孵育，次日室温复温30min后将HRPAnti His-Tag Mouse用作二抗，1:20000配制，37℃孵育1h,后用TBST进行洗膜并曝光，如图3所示，均有条带显示，大小约为60kDa左右,实验结果充分说明纯化的纳米抗体可用于Westernblottting一抗，且实验效果较为理想。
蒙古牛皮肤的S100A4-VHH-S100A4纳米抗体免疫组化检测。将蒙古牛皮肤的组织切片进行脱蜡，然后用柠檬酸钠修复液进行抗原修复，修复结束后用3％的过氧化氢阻断内源性过氧化物的活性，然后用3％BSA进行封闭，封闭结束后，将S100A4纳米抗体用作一抗，4℃过夜孵育，次日取出切片，室温复温30min,将HRPAnti His-Tag Mouse用作二抗，1:350配制，37℃孵育1h后用DAB显色10min，苏木精复染后用自来水反蓝，脱水并用中性树胶封片。如图4所示，实验结果充分说明纯化的纳米抗体可用于免疫组化一抗，且实验效果理想。
由以上实施例可知本发明提供的S100A4纳米抗分子量大小约为15kDa，符合纳米抗体大小，纯化的纳米抗体可用于Westernblottting一抗；即可用于在免疫组织化学和Western Blotting法检测蒙古牛组织中S100A4的表达。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种S100A4纳米抗体VHH基因的筛选方法，其特征在于，
1)将黑素瘤纳米抗体文库进行第一轮淘洗，得到B16-S100A4-VHH1；
第一轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为20μg-30μg/ml；
2)将步骤1)得到的B16-S100A4-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；
第二轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为10μg/ml；
第三轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为8μg/ml；
第四轮淘洗的S100A4蛋白的包被浓度为5μg/ml；
3)将步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同S100A4蛋白的反应性；
5)将步骤4)与S100A4蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，利用该质粒载体的通用引物进行测序，得到S100A4纳米抗体VHH序列。
2.根据权利要求1所述的S100A4纳米抗体VHH基因的筛选方法，其特征在于，步骤4)中第一振荡的温度为35～42℃，第二振荡的温度为28～32℃；第一离心的离心力为7500～8500g，第二离心的离心力为2000～2100g。
3.根据权利要求1所述的S100A4纳米抗体VHH基因的筛选方法，其特征在于，步骤5)中质粒引物包括质粒上游引物SEQ ID No.6和质粒下游引物SEQ ID No.7。
4.根据权利要求1所述的S100A4纳米抗体VHH基因的筛选方法，其特征在于，步骤1)所述的黑素瘤纳米抗体文库是根据中国专利CN201910058785.0公开的方法制备的。
5.一种S100A4纳米抗体，所述S100A4纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
6.编码权利要求5所述的S100A4纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
8.一种重组质粒，其特征在于，包含权利要求7所述核苷酸序列。
9.一种表达菌株，其特征在于，包含权利要求8所述重组质粒。
10.权利要求5所述S100A4纳米抗体在制备结合S100A4蛋白的免疫技术中的应用。
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