CN110734497B

CN110734497B - 一种直接识别异丙威的单链抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110734497B
Application number: CN201911025013.3A
Authority: CN
Inventors: 徐振林; 吴会玲; 傅慧君; 陈子键; 沈玉栋; 孙远明; 肖治理; 王弘
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2039-10-25
Also published as: CN110734497A

Abstract

本发明公开了一种直接识别异丙威的单链抗体及其制备方法和应用，该单链抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；其编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。利用该单链抗体异丙威的ELiSA检测方法，可实现大量样品的快速检测筛选，降低成本；该单链抗体能通过基因工程技术体外表达，可在细菌中大规模经济化生产，避免单克隆细胞的丢失风险；该单链抗体与抗原的结合可被游离的半抗原异丙威竞争性抑制，具有很好的抗原结合活性。该基因工程抗体在异丙威的免疫检测和大量样品的快速检测筛选方面具有很好的应用前景。

Description

一种直接识别异丙威的单链抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种直接识别异丙威的单链抗体(scFv)及其制备方法和应用。

背景技术

异丙威(Isoprocarb，IPC)，又名灭扑散，叶蝉散，化学名称：2-异丙基苯基-N-甲基氨基甲酸酯，属于触杀性氨基甲酸酯类的一种常见杀虫剂，通过抑制昆虫体内的乙酰胆碱酯酶的生物活性，从而将昆虫麻痹致死，此类杀虫剂进入人体内也可抑制乙酰胆碱酯酶，造成急性中毒，刺激中枢神经系统，对人类健康存在潜在的危险，因此许多国家和地区对这种农药在水果蔬菜中的残留量都制定了严格的限量标准，中国农业部规定，叶菜类蔬菜中异丙威的最大残留限量为0.1μg/mL，水稻中允许的最大残留限量为0.2mg/kg，为确保食品安全，国际组织已确定氨基甲酸酯类杀虫剂在作物中的最大残留量Maximum Residue Limits(MR Ls)为0.02～5mg/kg。

近十几年来，食品中农药残留物在世界范围内引起了人们的关注，然而对异丙威残留物的研究不多。目前在很多国家，尤其是发展中国家中，大量不科学地使用也导致人畜中毒现象时有发生,因为这类农药也具有较强生物毒性。因此对农产品中异丙威残留建立检测方法十分必要。

前国内外的分析报道中，异丙威的常用检测方法主要包括仪器分析方法和免疫学分析方法。前者包括高效液相色谱检测法(HPLC)，气相色谱检测法(GC)高效液相色谱-质谱联用检测法(HPLC-MS)和气相色谱-质谱联用检测法(GC-MS)等仪器检测法，后者主要包括酶联免疫分析法(ELISA)和胶体金免疫层析法(ICA)。仪器检测方法都存在仪器设备昂贵并且要求专业的操作人员，前处理复杂，检验周期长和检测成本高等缺陷，无法满足现行对农产品中农药残留快速，准确的检测需求。而免疫学分析方法具有灵敏度高，特异性强，前处理简单，可实现现场高通量筛查和检验周期短等优点。在农药检测领域占有重要地位。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有异丙威检测技术的缺陷和不足，提供一种可直接识别异丙威的单链抗体(Single-chain antibody)。

本发明的第一个目的是提供一种直接识别异丙威的单链抗体。

本发明的第二个目的是提供一种直接识别异丙威的单链抗体的编码基因。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明的第四个目的是提供一种重组细胞。

本发明的第五个目的是提供所述单链抗体、所述编码基因、所述重组载体、所述重组细胞任意的一种或几种在检测异丙威或制备检测异丙威试剂盒中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种异丙威的酶联免疫检测方法。

本发明的第七个目的是提供一种识别异丙威的单链抗体的制备方法。

本发明的第八个目的是提供一种检测异丙威的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明要求保护以下内容：

一种直接识别异丙威的单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一种直接识别异丙威的单链抗体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

一种重组载体，所述重组载体为连接有所述编码基因的载体。

优选地，所述载体为表达载体。

更优选地，所述表达载体为pComb3XSS质粒。

一种重组细胞，所述重组细胞为携带有所述的重组质粒的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21DES。

本发明进一步要求保护所述单链抗体、所述编码基因、所述重组载体、所述重组细胞任意的一种或几种在检测异丙威或制备检测异丙威试剂盒中的应用。

优选地，所述检测基于酶联免疫分析法。

本发明还要求保护一种异丙威的酶联免疫检测方法，利用所述单链抗体进行ci-ELISA检测。

优选地，包括以下步骤：

S1.包被：用包被液将式(I)所示包被原稀释至合适l25ng/mL，加入酶标板孔中，100μl/孔，37℃水浴箱中过夜；

S2.洗涤：倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加洗涤液250ul，拍干孔中液体；

S3.封闭：每孔加入120μl封闭液，37℃封闭3h，拍干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h备用；

S4.加样及孵育：将异丙威稀释成系列梯度标准液，分别稀释为10000、3333.33、1111.11、370.37、123.46、41.15、13.72、4.57、1.52、0.51ng/mL，每孔加50μl，然后加入合理稀释scFv蛋白稀释液50μl充分震荡混匀，37℃水浴箱中反应50min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液250ul，拍干孔中液体；

S5.加二抗：每孔加入100μl稀释5000倍的HRP-抗his鼠单克隆抗体，37℃水浴箱中反应40min后，洗板同S4；

S6.加三抗：每孔加入100μl稀释5000倍的HRP-羊抗鼠，37℃水浴箱中反应40min后，洗板同S4；

S7.显色：TMB底物液和底物缓冲液等体积混合，每孔加入混合液100μl，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μl 10％H₂SO₄终止液；

S8.测定：用酶联免疫检测仪测定各孔A450nm的吸光值；

S9.计算：用Origin8.5的四参数拟合模块计算抑制曲线的IC20，IC80值，制作标准曲线；根据标准曲线计算异丙威含量，

本发明还要求保护一种识别异丙威的单链抗体的制备方法，将所述编码基因构建于表达载体，得到重组表达载体，将重组表达载体转入宿主细胞，得到重组细胞，重组细胞经过诱导表达得到所述单链抗体。

优选地，宿主细胞为大肠杆菌，重组细胞的诱导产物采用Tris-蔗糖法提取大肠杆菌周质腔中可溶性单链抗体。

优选地，所述诱导表达的条件为：培养基为2×YT培养基，表达温度为26～30℃，表达时间为8～16h。

更优选地，所述诱导表达的条件为：培养基为2×YT培养基，表达温度为28℃，表达时间为16h。

本发明还要求保护一种检测异丙威的试剂盒，含有所述的单链抗体。

优选地，还含有包被液、(I)所示包被原、酶标板、洗涤液、封闭液、HRP-抗his鼠单克隆抗体、HRP-羊抗鼠、TMB底物液、底物缓冲液、终止液

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明制备的单链抗体是一种基因工程抗体，是针对抗异丙威的单克隆抗体的抗原结合片断中可变区设计，其建立的ELISA检测方法是基于抗体基因工程检测异丙威的ELiSA检测方法，可实现大量样品的快速检测筛选，降低成本。

本发明的单链抗体保持了亲本单克隆抗体的抗原亲和活性和特异性的功能性抗体片段，通过基因工程技术体外表达得到，可在细菌中大规模经济化生产，避免单克隆细胞阳性丢失风险。

另外，该单链抗体与抗原的结合可被游离的半抗原异丙威竞争性抑制，IC50为63.64ng/mL，检测限为3.53ng/mL，具有很好的抗原结合活性；通过标准曲线可知线性检测范围分别在14.58～277.91ng/mL之间。该基因工程抗体在异丙威的免疫检测和大量样品的快速检测筛选方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为pComb3XSS表达载体的构建。

图2为Ni-NTA纯化异丙威-scFv的SDS-PAGE蛋白电泳图；M：Marker；1：流穿液；2：10mM咪唑洗脱；3：20mM咪唑洗脱4：200mM咪唑洗脱。

图3为icELISA测定scFv抗体的标准曲线。

图4为scFv抗体三维同源建模模型图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 scFv重组质粒的构建筛选与鉴定

一、实验方法

前期，本实验室已成功人工合成抗异丙威单克隆抗体。将异丙威半抗原与乳铁蛋白偶联，免疫小鼠，并经过融合及细胞筛选获得了分泌抗克百威单克隆抗体的细胞株。

1、杂交瘤细胞总mRNA提取

S1.与RNA实验操作相关的PCR管、离心枪头镊子等耗材及器具先用0.1％DEPC溶液完全浸泡过夜。次日尽量倒DEPC溶液，高压灭菌备用；

S2.将培养好约1×10⁷杂交瘤细胞悬浮后加入到15mL离心管中，1000r/min离心沉淀细胞，弃上清液，用枪头尽量吸尽残液；

S3.加入2mL Trizol，用枪头反复抽吸，混匀细胞；

S4.将此溶液各1mL分装在两个1.5mL无RNAase的离心管中，分别加入0.2ml氯仿，剧烈地振荡15s，在冰上孵育5min后，室温下，12000×g下离心10min；

S5.小心转移不多于80％上层水相(含RNA)到两个新的1.5mL无RNAase的离心管中(约500μl)，分别缓慢加入350μl的无水乙醇，涡旋混匀，将得到溶液和沉淀一起转入GBC吸附柱中，12000r/min离心30s；

S6.弃废液，向GBC吸附柱中加入500μlWash BufferⅠ，12000r/min离心1min；

S7.弃废液，向GBC吸附柱中加入600μlWash BufferⅡ(检查是否已加入无水乙醇)，12000r/min离心30s；

S8.弃废液，重复S7；

S9.空转12000r/min离心1min，倒掉废液，在超净台彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

S10.将GBC吸附柱转入一个新的1.5mL无RNAase的离心管中，加入30～100μlRNAase水，室温放置2min，4℃12000r/min离心1min，取2.5μl，于核酸蛋白分析仪上测定RNA含量与纯度。

2、cDNA第一链合成

cDNA试剂盒购自深圳市艾伟迪生物科技有限公司，参照试剂盒说明书进行。取总RNA约2ug，42℃加热5min以除去二级结构，立即置于冰浴2min，于2min内准备好反应体系。将所有溶液混匀，短暂离心后，42℃30min(反转录合成cDNA第一链)，95℃5min(反转录酶灭活)，反应产物置于冰上。

3、重链和轻链可变区基因序列PCR扩增及鉴定

(1)引物序列见表1。

表1 PCR通用引物：

注：所列简并碱基符号为：M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T。

(2)PCR反应体系见表2，PCR反应条件：94℃变性5min，进行以下循环：94℃，50s，55℃，50s，72℃，50s，共30个循环，最后72℃延伸8min。反应完毕后，取反应产物5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增后的PCR产物用PCR清洁试剂盒(北京天根生物技术有限公司)进行切胶纯化。纯化后的x链，Fd段基因目的片段用pEASY-Blunt Simple Cloning Kit试剂盒(北京全式金生物有限公司)进行T载体连接以及转化。挑取单克隆阳性转化菌落进行培养、质粒提取并进行双酶切和测序鉴定。

表2 PCR扩增体系：

cDNA第一条反应链(约10ug)	1μl
		10×PCR Buffer	2.5μl
dNTP Mixture(2.5mmol/L)	2μl
		HB/LB primer(10μmol/L)	0.5μl
HF/LF pimer(10μumol/L)	0.5μl
		ddH<sub>2</sub>O	18μl
Pfu DNA Polymerase(5μ/μl)	0.5μl
		total volume	50μl

(3)酶切

载体pEASY TBlunt要插入片段的两端设计有EcoR I酶切位点，经酶切位点EcoRI对重组质粒进行酶切便可判断重是否含有插入片段，体系如表3：

表3 EcoR I酶切体系：

10×H缓冲液	2μl
		重组质粒	10μl
EcoRI	1μl
		无核酸酶的水	7μl
Total	20μl

将反应溶液轻混匀，短暂离心恒温水浴中37℃反应3h。

取全部酶切反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。将双酶切鉴定正确的阳性质粒测序。用DNAman软件对得到的多个重链基因序列进行比软件对，选取合适的抗体轻重链用于构建scFv基因。

4、单链抗体基因(scFv基因)构建

采用重叠延伸的方法构建抗异丙威基因。根据测得的可变区VH和VL基因的序列设计上下游引物，在VH上游引物和VL下游引物的5’分别加入限制性内切酶位点SacI和SpeI，在VH下游引物和VL上游引物的5’分别加入连接肽基因序列，有15个碱基互补。再以VH和VL的重组质粒为模板，VH/VL的上下游引物对为引物，全式金公司的EasyPfu DNA Polymerase为聚合酶扩增带有限制性内切酶位点和连接肽基因序列的可变区序列，切胶回收；然后将纯化的VH和VL基因等量混匀，加入PCR反应体系，VH和VL互补的(G4S)3连接肽序列将互为引物，进行重叠延伸PCR，从而将VH和VL基因通过连接肽基因连接起来。

表4抗异丙威单链抗体基因构建与表达所用引物：

引物名称	引物序列
		VH-Back(SacI)	5’-CCGAGCTCGATGTGCAGCTTCTGGAG-3’
VL-For(SpeI)	5’-CCACTAGTTTTGATCTCCAGCTTGGT-3’
		VH-linker	5’-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACTGA-3’
VL-linker	5’-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATGTTTTGATGACCCAC-3’

表5 VH基因引入SacI酶切位点和连接肽PCR扩增：

反应体系涡旋短暂混匀，短暂离心后，进行PCR扩增反应，反应条件以及过程为：94℃×5min变性，进行以下循环：94℃30s，56℃1min，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。反应完毕后，反应产物取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。并用清洁回收试剂盒回收。

表6 VL基因引入SacI酶切位点和连接肽PCR扩增：

2×EasyPfu Buffer	25μl
		含有VL基因的重组质粒	1μl
VL-For(SpeI)	1μl
		VL-linker	1μl
ddH<sub>2</sub>O	加到50μl
		total volume	50μl

以胶回收纯化的引入酶切位点和连接肽的VH、VL基因片断互为模板和引物，进行重叠反应形成编码连接肽(G4S)3的序列，从而将VH和轻链VL基因拼接为scFv。重叠反应体系如下：

表7重叠延伸反应体系：

2×EasyPfu Buffer	25μl
		VH gene PCR amplification product	1μl
VL gene PCR amplification product	1μl
		ddH2O	加到50μl
total volume	50μl

重叠反应完毕后，以重叠反应中形成的scFv为模板，进行延伸PCR扩增。

延伸PCR体系如下：

表8 scFv PCR扩增体系：

2×EasyPfu Buffer	25μl
		重叠延伸体系	1μl
VH-F primer	1μl
		VL-R primer	1μl
ddH2O	加到50μl
		total volume	50μl

5、scFv表达载体构建

S1.scFv基因片段双酶切采用Sac I和SpeI限制性内切酶。双酶切反应体系如表9，

表9 scFv双酶切体系：

scFv基因片段	2μl
		10×Buffer	2μl
SacI	1μl
		SpeI	1μl
无菌水	24μl
		总体积	30μl

S2.pComb3XSS质粒双酶切采用Sac I和SpeI限制性内切酶。双酶切反应体系如表10，

表10 pComb3XSS双酶切体系：

S3.pComb3XSS-scFv表达载体构建。将用片段清洁试剂盒回收的双酶切scFv基因与经相应酶切并切胶回收的载体pComb3XSS连接，构建pComb3XSS-scFv表达载体(如图1示)。连接体系如下：

表11 scFv片段连接体系：

双酶切pComb3XSS载体纯化产物	1μl
		双酶切scFv纯化产物	3μl
10×T4 DNA Buffer	2μl
		T4 DNA ligase	1μl
无菌水	13μl
		总体积	20μl

S4.重组质粒转化。取10ng(5μl)质粒加入到将刚解冻的Trans5α(50μl)，冰育30min，然后马上42℃水浴热激90s，再马上置于冰上冷却2min，然后加入500mL SOC培养基，37℃震荡复苏培养1h。取100μl菌液涂布0.1％氨苄LB平板。过夜培养后挑取单克隆菌落测序鉴定。通用测序引物分别为ompA和gback。

二、实验结果

实施例上中获得重链可变区(VH)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区(VL)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQID NO.2所示；进一步构建得到的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5。

实施例2 scFv抗体可溶性表达提取

一、实验方法

本发明所采用的pComb3XSS噬粒载体是含有噬菌体基因间隔区的质粒载体，它综合了噬菌体和质粒载体的优点，噬粒在多克隆位点与gm之间有一个琥珀酸终止子(AmberStop Codon)，当重组噬菌体pComb3XSS-Fab转化抑制型大肠杆菌XLl-Blue时，琥珀酸终止子被通读成谷氨酸，结果抗体融合蛋白会表达在噬菌体的表面，即噬菌体表面展示。当pComb3XSS-Fab转化非抑制型的大肠杆菌DH5α，琥珀酸终止子被辨认为终止密码子，通过乳糖类似物IPTG的诱导，抗体表达后分泌到胞浆中，成为可溶性分子。

其表达和提取步骤如下：

S1.挑取实施例1获得的阳性单菌落，于10mL含0.1％氨苄2×YT培养基，37℃，250r/min震荡培养；

S2.取7.5mL上述菌液加入750mL含0.1％氨苄2×YT培养基，37℃，250r/min震荡培养至OD600nm值0.6～0.8，然后28℃，220r/min震荡过夜表达；

S3.表达温度为28℃，培养时间为16h。

采用Tris一蔗糖法提取大肠杆菌周质腔中的Fab蛋白。其具体步骤如下：

S1.取750mL上一步获得的已经过表达的菌液，12000rpm离心10min，弃掉上清液。加入3.75mLTris-蔗糖-EDTA溶液，用移液枪把沉积在离心管底部的细菌吹散，然后搅拌10min；

S2.将搅拌后的菌液放置-80℃，3h后水浴解冻，加入稀释4倍的Tris-蔗糖-EDTA溶液15mL，震荡成溶液状态，16℃，250r/min，30min，此时周质腔蛋白被释放到溶液中；

S3.将上述溶液13000rpm离心，离心温度为4℃，离心时间为l0min，取上清液，上清液即为单链抗体蛋白提取液。

将获得的单链抗体蛋白提取液经过Ni-NTA纯化，分别使用10mM、20mM、200mM咪唑洗脱。

二、实验结果

用不同浓度梯度的咪唑缓冲液对目的蛋白进行洗脱，收集洗脱液进行SDS-PAGE蛋白电泳鉴定，结果如图2所示，目的蛋白经200mM咪唑(如图2泳道4)即可洗脱得到，蛋白分子质量约为26kD，判定这是表达出来的蛋白。

实施例3 scFv可溶性蛋白ci-ELISA检测

一、实验方法

ci-ELISA检测步骤如下:

S1.包被：用包被液将(I)所示包被原稀释至合适l25ng/mL，加入酶标板孔中，100μl/孔，37℃水浴箱中过夜

S2.洗涤：倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加洗涤液250μl，拍干孔中液体。

S3.封闭：每孔加入120μl封闭液，37℃封闭3h，拍干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h备用。

S4.加样及孵育：将异丙威稀释成系列梯度标准液，分别稀释为10000、3333.33、1111.11、370.37、123.46、41.15、13.72、4.57、1.52、0.51ng/mL，每孔加50μl，然后加入合理稀释scFv蛋白稀释液50μl稀释震荡混匀，37℃水浴箱中反应50min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液250μl，拍干孔中液体。

S5.加二抗：每孔加入100μl稀释5000倍的HRP-抗his鼠单克隆抗体，37℃水浴箱中反应40min后，洗板同S4。

S6.加二抗：每孔加入100μl稀释5000倍的HRP-羊抗鼠，37℃水浴箱中反应40min后，洗板同S4。

S7.显色：TMB底物液和底物缓冲液等体积混合，每孔加入混合液100μl，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μl 10％H₂SO₄终止液。

S8.测定：用酶联免疫检测仪测定各孔A450nm的吸光值。

S9.计算：用Origin8.5的四参数拟合模块计算抑制曲线的IC20，IC80值。

二、实验结果

标准曲线见图3，scFv抗体特异性检测如下表1，所得标准曲线IC50值为63.64ng/mL，检测限为3.53ng/mL，线性检测范围为14.58～277.91ng/mL。

利用本方法检测异丙威及其类似物的检测，结果如表1所示。

表1抗异丙威scFv特异性检测

实施例4 scFv抗体同源建模

单链抗体(scFv)的氨基酸序列见SEQ ID NO.5所示，采用Swiss-Model数据库中4H0G蛋白(Identity67.8％，Courage100％)为模板，进行同源建模。图4为scFv蛋白三维图，结果显示SEQ ID NO.5所示蛋白即为单链抗体蛋白。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种直接识别异丙威的单链抗体及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> 单链抗体scFv重链可变区氨基酸序列(Variable region of heavychain)

<400> 1

Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asp Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Phe Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 单链抗体scFv轻链可变区氨基酸序列(Variable region of lightchain)

<400> 2

Asp Val Leu Met Thr His Thr Pro Leu Ile Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

His Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Phe Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 342

<212> DNA

<213> 单链抗体scFv重链可变区核苷酸序列(Variable region of heavychain)

<400> 3

gatgtgcagc ttctggagtc tggacctgac ctggtgaaac cttctcagtc actttcactc 60

acctgcactg tcactggcta ctccatcacc agtggttata gttggcactg gatccggcag 120

tttccaggag acaagttgga gtggatgggc tacatacact acagtggttt cactaacttc 180

aacccatctc tcgaaggtcg attctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac cactgaggac acagccacat attactgtgc aagagagggg 300

ggggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct ca 342

<210> 4

<211> 336

<212> DNA

<213> 单链抗体scFv轻链可变区核苷酸序列(Variable region of lightchain)

<400> 4

gatgttttga tgacccacac tccactcatt ttgtcggtta ccattggaca tccagcctcc 60

atctcttgca agtcatttca gagcctctta catagtaatg gaaaaaccta tttgcactgg 120

ttcttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgaaga tttgggcgtt tattactgcg cgcaaggtac acattttccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggag atcaaa 336

<210> 5

<211> 241

<212> PRT

<213> 单链抗体scFv的氨基酸序列(scFv amino acid sequence)

<400> 5

Asp Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asp Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Phe Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Val Leu Met Thr His Thr Pro Leu Ile Leu Ser Val Thr Ile

130 135 140

Gly His Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Phe Gln Ser Leu Leu His

145 150 155 160

Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln

165 170 175

Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val

180 185 190

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

195 200 205

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln

210 215 220

Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225 230 235 240

Lys

<210> 6

<211> 723

<212> DNA

<213> 单链抗体scFv的核苷酸序列(scFv nucleotide sequence)

<400> 6

gatgtgcagc ttctggagtc tggacctgac ctggtgaaac cttctcagtc actttcactc 60

acctgcactg tcactggcta ctccatcacc agtggttata gttggcactg gatccggcag 120

tttccaggag acaagttgga gtggatgggc tacatacact acagtggttt cactaacttc 180

aacccatctc tcgaaggtcg attctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac cactgaggac acagccacat attactgtgc aagagagggg 300

ggggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct caggtggagg cggttcaggc 360

ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggat gttttgatga cccacactcc actcattttg 420

tcggttacca ttggacatcc agcctccatc tcttgcaagt catttcagag cctcttacat 480

agtaatggaa aaacctattt gcactggttc ttacagaggc caggccagtc tccaaagcgc 540

ctaatctatc tggtgtctaa actggactct ggagtccctg acaggttcac tggcagtgga 600

tcaggaacag attttacact gaaaatcagc agagtggagg ctgaagattt gggcgtttat 660

tactgcgcgc aaggtacaca ttttccgtac acgttcggag gggggaccaa gctggagatc 720

aaa 723

Claims

1.一种直接识别异丙威的单链抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种直接识别异丙威的单链抗体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体为连接有权利要求2所述编码基因的载体。

4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为携带有权利要求3所述重组载体的宿主细胞。

5.权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述重组载体、权利要求4所述重组细胞任意的一种或几种在检测异丙威或制备检测异丙威试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测基于酶联免疫分析法。

7.一种异丙威的酶联免疫检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述单链抗体进行ic-ELISA检测。

8.一种识别异丙威的单链抗体的制备方法，其特征在于，将权利要求2所述编码基因构建于表达载体，得到重组表达载体，将重组表达载体转入宿主细胞，得到重组细胞，重组细胞经过诱导表达得到所述单链抗体。

9.一种检测异丙威的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的单链抗体。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还含包被液、(I)所示包被原、酶标板、洗涤液、封闭液、HRP-抗his鼠单克隆抗体、HRP-羊抗鼠、TMB底物液、底物缓冲液、终止液