CN114540405A - 一种提高毕赤酵母菌抗菌肽ll-37产量的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种提高毕赤酵母菌抗菌肽LL‑37产量的方法，步骤包括：制备感受态细胞、工程菌的构建、筛选阳性克隆菌、种子菌活化、发酵表达和电泳检测。本发明通过构建直接表达的菌体，避免了诱导表达中途加入诱导剂时的污染率，在常温条件下就能正常发酵产生LL‑37，通过条件优化，重组菌直接表达的目标产物大幅提升，其表达量比传统工艺提高30％，操作简便，污染率低，稳定性高，便于扩大规模生产和推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域领域，具体来说是一种提高发酵毕赤酵母抗菌肽LL-37产量的方法及其应用。
背景技术
Cathelicidin家族是一类保守的抗菌肽,表达于哺乳动物﹑禽类、鱼类及爬行动物等。LL-37是人体唯一的Cathelcidin家族抗菌肽，因含有37个氨基酸残基、N端前两个氨基酸残基为亮氨酸(L)而得名，在先天性免疫防御中起着重要的作用，在皮肤病中发病作用也日益受到重视。其生物活性依赖螺旋构象而产生，且与之成正比。LL-37在体内以前肽原的形式合成,前体分子包含N端30个氨基酸残基的信号肽序列，104个氨基酸残基的保守Cathelin结构域和C端的抗菌肽LL-37。当机体遭受病原体侵袭而出现炎症﹑感染﹑创伤时，前体分子在丝氨酸蛋白酶-3和其他蛋白水解酶的作用下释放出活性抗菌肽LL-37分子，参与宿主的防御反应。
LL-37在人体中表达分布广泛，在免疫细胞、上皮细胞中均有表达，除此还会分泌于汗腺、唾液、精腺及伤口渗透液中，在受伤后48h到达最高，伤口愈合后下降到受伤前的水平。LL-37目前在医药中的应用研究较多，但是没有系统的做过发酵工艺优化，因此该专利对其发酵条件进行了优化，为提高其表达量打下基础。
发明内容
针对现有技术发酵产生LL-37但表达量有待提高，本发明提供一种用毕赤酵母构建的组合型工程菌发酵条件的优化工艺，该工艺通过改善培养基的成分及培养条件，使LL-37的表达量提高30％。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种提高毕赤酵母菌抗菌肽LL-37产量的方法，步骤包括：
(1)制备感受态细胞：挑取毕赤酵母单菌落于10mLYPD培养基中，30℃过夜培养，待其OD值在2以上时用灭菌离心管装好后8000rpm离心5min，分别用灭菌水和1M的山梨醇进行洗涤，最后向洗涤好的沉淀中加入1mL的山梨醇混匀，这些操作都需要在冰浴上进行，感受态细胞即制备完成；
(2)工程菌的构建：将提取好的质粒线性化处理后测浓度，按照80uL感受态细胞与7ug的质粒进行混匀后加入电转杯中，电击后立刻加入1mL过滤除菌的1M山梨醇，放于恒温培养箱中30℃静置2h，取200uL菌液涂布于浓度为100uLzeocin/100mL的YPDS固体培养基上，30℃倒置培养24-36h；
(3)筛选阳性克隆菌：先配置每管25uL的PCR体系，用牙签轻轻挑取少许单菌落点入PCR管中混匀，管需要和单菌落分别对号，再放于PCR仪中反应，最后用琼脂糖凝胶电泳来检测其分子量大小，再将符合条件的单菌落重新保存于300uLzeocin/100mL的YPDS固体培养基上进一步筛选多拷贝的菌株；
(4)种子活化：配制30mLYPD种子培养基，需注意葡萄糖用115℃灭菌15min后，单独加入；再用灭菌的牙签挑取保存的单菌落加入种子培养基中，于30℃、250rpm培养24h，待其OD值在2-3之间时即可转接到表达培养基中；
(5)发酵表达：配置25mL液体发酵培养基，将活化后的种子菌液分别取2.5mL用灭菌的离心管于8000rpm离心5min后，弃掉上清，将菌体重悬于发酵培养基中，并且加入25uL的氨苄青霉素，置于恒温摇床中培养36-72h，条件为pH为6.5、温度为28℃，转速为200rpm；
(6)表达：电泳检测：取1mL发酵液于1.5mL的离心管中，8000rpm离心5min后，收集上清液，取100uL上清液用4倍体积的丙酮来沉淀蛋白，放于-20℃条件下放置1h后14000rpm离心5min，再放于通风橱内静置20min，将丙酮挥发干净后，向沉淀中加入15uL的PBS涡旋混匀后加入5uL的5X的loading buffer混匀后放于金属浴中100℃5min，最后进行tricine-SDS-PAGE来检测其表达量。
进一步的，所述种子培养基和发酵培养基配方为：1％的葡萄糖、2.67％酵母膏、1.33％硫酸铵。
进一步的，步骤(3)中，PCR反应条件为94℃预变性2min，98℃下变性45s，56℃下退火30s，68℃延伸90s，进行30个循环，再在68℃下延伸10min。
本发明的有益技术效果是：本发明通过构建直接表达的菌体，避免了诱导表达中途加入诱导剂时的污染率，在常温条件下就能正常发酵产生LL-37，通过条件优化，重组菌直接表达的目标产物大幅提升，其表达量比工艺优化前提高了30％。本发明采用的是直接表达，操作简便，污染率低，稳定性高，便于扩大规模生产和推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为有机氮源及其比例对LL-37表达量影响的电泳图；图中，1为marker；2-10)Y6、空、Y5、Y4、空、Y3、Y2、空、Y1(酵母膏：蛋白胨)Y1为1:2；Y2为1:3Y3为1:1Y4为3:2Y5为1:3Y6为2:1；
图2为不同的碳氮比对LL-37表达量影响的电泳图；图中，1-6)17号菌条件N9、N8、N7、N6、N5、N4；7)LL-37；8-11)17、21、14、13号菌的条件N3
图3为不同的pH对LL-37表达量影响的电泳图；图中，1)LL-37；2-5)21号菌在ph6、6.5、7.0、7.5下培养48h；6)marker；
图4为不同温度对LL-37表达量影响的电泳图；图中，1-3)C5条件下24、26、28℃；4-5)培养基为C5时28、26℃；6)C4条件下28℃；7)LL-37；8)C4条件下26℃；9-10)培养基为C1时28、26℃；11)酵母；
图5为接种量对LL-37表达量影响的电泳图；图中，1-4)14号菌接种量为单1、单2、单3、单4时培养36h；5)LL-37；6-9)14号菌单5、21号菌接种量为单5、单4、单3时培养36h；10)marker；
图6为不同的培养转速对LL-37表达量影响的电泳图；图中1-4)转速为180、250、220、200rpm培养48h；5-7)转速为250、220、200rpm培养48h；8)LL-37；
图7为不同的培养时间对LL-37表达量影响的电泳图，图中1-4)分别用pH为9、8、7、6的PB平衡柱子；5)13号菌培养36h；6-10)21号菌培养24、36、48、72、84h；11)LL-37；
图8为不同浓度的LL-37对大肠杆菌DH5α的抑菌图；
图9为不同浓度的LL-37对金黄色葡萄球菌的抑菌图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1培养基配方及菌种表达条件的优化
以碳氮比为3:2、温度30℃、pH7.0,250rpm的基础上培养96h，在初始培养基的基础之上，利用单因素优化策略，进行发酵表达的条件优化实验，通过改变培养基的氮源及碳氮比来确定最佳的培养基成分及配比，再进行调节培养基pH、培养转速、温度及培养时间来确定出最优的发酵条件。
种子的初始培养基为：1％的酵母粉、2％的蛋白胨、2％的葡萄糖。
(1)氮源的确定
在初始培养基氮源的基础上，利用单因素优化的方法，对氮源进行优化，选取不同的氮源及其比例进行优化，不同的氮源及其比例对重组菌表达量的影响见图1、图2,氮源及比例见表1、表2。从图中可以明显的看出，当酵母粉的量大于蛋白胨时，LL-37的表达量明显高于蛋白胨更多的组，没有酵母又会降低其表达量，又由于酵母粉色素较重，因此不能完全选用酵母粉；可以选用YNB(无氨基教母氮源)、硫酸铵等氮源稍微的替代部分的酵母粉，但是不能完全取代，当YNB完全取代酵母粉时，表达量会低于最初的基础培养基，需要多种氮源混合使用，效果更好的复合氮源比例为Y4，即蛋白胨：酵母粉：YNB为3％：1％：1％。
表1有机氮源对LL-37表达量的影响
| Y1 | Y2 | Y3 | Y4 | Y5 | |
| 比例 | 1:2 | 2:1 | 1：1 | 3:2 | 2:3 |
| 酵母粉 | 1％ | 2％ | 1.5％ | 1.8％ | 1.2％ |
| 蛋白胨 | 2％ | 1％ | 1.5％ | 1.2％ | 1.8％ |
表2复合氮源对LL-37表达量的影响
(2)碳氮比的确定
在初始培养基氮源的基础上，确定了氮源及其比例为蛋白胨：酵母粉：YNB为2:1:1，利用单因素优化的方法，进行碳源和氮源比例的优化，不同的碳氮比对LL-37表达量的影响见图3，不同的氮源及碳氮比见表3。由此可以得出，最适于重组菌表达的碳氮比为复合氮源：碳源为4:1，其中碳源为1％，氮源为蛋白胨：酵母粉为1％：2％。
(3)培养基pH值的确定
通过发酵培养基的优化实验，确定最佳的发酵培养基配方为氮源：碳源为4:1，其中碳源为1％，氮源为蛋白胨：酵母粉为1％：2％。在此优化培养基的基础上进行培养条件的优化实验，将配置好的培养基的pH调为5.5、6、6.5、7、7.5，于29℃下250rpm培养84h，不同的pH对LL-37表达量的影响见图4，培养情况如表4所示，pH为6.5-7之间效果都不错，选择pH6.5为最佳的条件。
表4 pH值对发酵培养基的影响
| pH值 | 5.5 | 6.0 | 6.5 | 7.0 | 7.5 |
| OD600 | 2.654 | 2.654 | 2.678 | 2.623 | 2.654 |
(4)种子菌的初始接种量对发酵表达的影响
通过发酵培养基的优化实验，确定最佳的发酵培养基配方为氮源：碳源为4:1，其中碳源为1％，氮源为蛋白胨：酵母粉为1％：2％。在此优化培养基的基础上进行培养条件的优化实验，将pH调为6.5后，分别向25mL的培养基中加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL的活化的种子菌液，于30℃下250rpm培养72h，不同的pH对LL-37表达量的影响见图5，种子菌液占比如表5，得出最佳的接种量为12％。
表5种子菌的初始接种量
| 接种量 | 1mL | 2mL | 3mL | 4mL | 5mL |
| 占比 | 4％ | 8％ | 12％ | 16％ | 20％ |
(5)培养温度的确定
通过发酵培养基的优化实验，确定最佳的发酵培养基配方为氮源：碳源为4:1，其中碳源为1％，氮源为蛋白胨：酵母粉为1％：2％。在此优化培养基的基础上进行培养条件的优化实验，将pH调为6.5后，分别置于24℃、26℃、28℃、29℃、30℃下，200rpm培养36h，不同的培养温度对LL-37表达量的影响见图5,28℃为最佳的培养温度。
(6)培养转速的确定
通过发酵培养基的优化实验，确定最佳的发酵培养基配方为氮源：碳源为4:1，其中碳源为1％，氮源为蛋白胨：酵母粉为1％：2％。在此优化培养基的基础上进行培养条件的优化实验，将pH调为6.5后，设置温度为28℃，分别设置转速为150rpm，180rpm、200rpm、220rpm、250rpm，培养36h后表达情况如图6所示，200rpm为最适的培养转速。
(7)培养时间的确定
通过发酵培养基的优化实验，确定最佳的发酵培养基配方为氮源：碳源为4:1，其中碳源为1％，氮源为蛋白胨：酵母粉为1％：2％。在此优化培养基的基础上进行培养条件的优化实验，将pH调为6.5后，设置温度为28℃，转速为200rpm。在该条件下分别发酵培养12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h，如图7所示，当发酵时间达到48h时，表达量较高。
综上得出最适的种子培养基及发酵培养条件如下，发酵培养基配方为：氮源：碳源为4:1，其中碳源为1％，氮源为蛋白胨：酵母粉为1％：2％；pH为6，温度为28℃，转速为200rpm，培养到48h时表达量达到最高。
实施例2
(1)制备感受态细胞：挑取毕赤酵母单菌落于10mLYPD培养基中，30℃过夜培养，待其OD值在2以上时用灭菌离心管装好后8000rpm离心5min，分别用灭菌水和1M的山梨醇进行洗涤，最后向洗涤好的沉淀中加入1mL的山梨醇混匀，这些操作都需要在冰浴上进行，感受态细胞即制备完成。
(2)工程菌的构建：提取好的质粒线性化处理后测得浓度为0.252ug/uL，按照80uL感受态细胞与7ug的质粒进行混匀后加入电转杯中，电击后立刻加入1mL过滤除菌的预冷的1M山梨醇，放于恒温培养箱中30℃静置培养2h，取200uL菌液涂布于浓度为100uLzeocin/100mL的YPDS固体培养基上，30℃倒置培养24-36h。
(3)筛选阳性克隆菌：一共有24个单菌落，以每管25uL的PCR体系，加上正负对照一共配置30管的体系，再分装到PCR管中。用牙签轻轻挑取少许单菌落点入PCR管中混匀，管需要和单菌落分别对号，再放于PCR仪中94℃预变性2min，98℃下变性45s，56℃下退火30s，68℃延伸90s，进行30个循环，再在68℃下延伸10min。最后用1％的琼脂糖凝胶电泳来检测其分子量大小，再将符合条件的单菌落重新保存于300uLzeocin/100mL的YPDS固体培养基上进一步筛选多拷贝的菌株。
表6 PCR反应体系
(4)种子菌活化：配制30mLYPD种子培养基，需注意葡萄糖用115℃灭菌15min后，单独加入；再用灭菌的牙签挑取保存的单菌落加入种子培养基YPD中，于30℃、250rpm培养24h，待其OD值在2-3之间时即可转接到表达培养基中；
(5)发酵表达：配置25mL液体发酵培养基，配方为1％葡萄糖，2.67％酵母粉、1.33％硫酸铵，将活化后的种子菌液分别取2.5mL用灭菌的离心管于8000rpm离心5min后，弃掉上清，将菌体重悬于发酵培养基中，并且加入25uL的氨苄青霉素，置于恒温摇床中培养36-72h，条件为pH为6.5、温度为28℃，转速为200rpm；
(6)电泳检测：取1mL发酵液于1.5mL的离心管中，8000rpm离心5min后，收集上清液，取100uL上清液用4倍体积的丙酮来沉淀蛋白，放于-20℃条件下放置1h后14000rpm离心5min，再放于通风橱内静置20min，将丙酮挥发干净后，向沉淀中加入15uL的PBS涡旋混匀后加入5uL的5×的loading buffer混匀后放于金属浴中100℃5min，最后进行tricine-SDS-PAGE来检测其表达量。
表7条件优化后蛋白的表达量
| 编号 | E1 | E2 | E3 | E4 | E5 | E6 | E7 | E8 | E9 |
| 碳氮比 | 1:4 | 1:4 | 1:4 | 1:4 | 1:4 | 1:4 | 2:3 | 2:3 | 1:4 |
| Ph | 5.5 | 6 | 6.5 | 7 | 7.5 | 8 | 6.5 | 6.5 | 6.5 |
| 表达量％ | 82 | 80 | 83.9 | 81.1 | 80.9 | 79.9 | 67.1 | 90.8 | 97.1 |
注：E7为原始培养基，E9相比E7增长了30％。
表8培养基配方表
(7)抑菌圈检测活性：取100ul保存的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液于25ml的LB培养基在37℃、180rpm下过夜培养，第二天取1ml菌液于新的25ml的LB培养基中，约2h达到对数期，即OD600为0.5左右，取100ul对数期的菌液和培养基混合均匀后，倒LB固体平板，每个平板20ml即可，轻轻放上牛津杯，取50ul样品于牛津杯中，正放于培养箱37℃过夜培养，用尺子量出抑菌圈大小；同时用LL-37标准品和氨苄做正对照，生理盐水做负对照，并且都续作平行试验，如图8和图9明显可以看出负对照长菌，其他样品均有抑菌性。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.一种提高毕赤酵母菌抗菌肽LL-37产量的方法，其特征在于：步骤包括：
(1)制备感受态细胞：挑取毕赤酵母单菌落于10mLYPD培养基中，30℃过夜培养，待其OD值在2以上时用灭菌离心管装好后8000rpm离心5min，分别用灭菌水和1M的山梨醇进行洗涤，最后向洗涤好的沉淀中加入1mL的山梨醇混匀，这些操作都需要在冰浴上进行，感受态细胞即制备完成；
(2)工程菌的构建：将提取好的质粒线性化处理后测浓度，按照80uL感受态细胞与7ug的质粒进行混匀后加入电转杯中，电击后立刻加入1mL过滤除菌的1M山梨醇，放于恒温培养箱中30℃静置2h，取200uL菌液涂布于浓度为100uLzeocin/100mL的YPDS固体培养基上，30℃倒置培养24-36h；
(3)筛选阳性克隆菌：先配置每管25uL的PCR体系，用牙签轻轻挑取少许单菌落点入PCR管中混匀，管需要和单菌落分别对号，再放于PCR仪反应，最后用琼脂糖凝胶电泳来检测其分子量大小，再将符合条件的单菌落重新保存于300uLzeocin/100mL的YPDS固体培养基上进一步筛选多拷贝的菌株；
(4)种子活化：配制30mLYPD种子培养基，需注意葡萄糖用115℃灭菌15min后，单独加入；再用灭菌的牙签挑取保存的单菌落加入种子培养基中，于30℃、250rpm培养24h，待其OD值在2-3之间时即可转接到表达培养基中；
(5)发酵表达：配置25mL液体发酵培养基，将活化后的种子菌液分别取2.5mL用灭菌的离心管于8000rpm离心5min后，弃掉上清，将菌体重悬于发酵培养基中，并且加入25uL的氨苄青霉素，置于恒温摇床中培养36-72h，条件为pH为6.5、温度为28℃，转速为200rpm；
(6)表达：电泳检测：取1mL发酵液于1.5mL的离心管中，8000rpm离心5min后，收集上清液，取100uL上清液用4倍体积的丙酮来沉淀蛋白，放于-20℃条件下放置1h后14000rpm离心5min，再放于通风橱内静置20min，将丙酮挥发干净后，向沉淀中加入15uL的PBS涡旋混匀后加入5uL的5X的loading buffer混匀后放于金属浴中100℃5min，最后进行tricine-SDS-PAGE来检测其表达量。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述种子培养基和发酵培养基配方为：1％的葡萄糖、2.67％酵母膏、1.33％硫酸铵。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR反应条件为94℃预变性2min，98℃下变性45s，56℃下退火30s，68℃延伸90s，进行30个循环，再在68℃下延伸10min。
4.根据权利要求1或3任一项所述方法生产的抗菌肽LL-37在牙膏生产中的应用。
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