CN114533614B - 一种美白活性肽纳米组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种美白活性肽纳米组合物及其制备方法，所述美白活性肽纳米组合物包括如下质量百分含量的组分：0.001～1％九肽‑1，0.001～1％六肽‑2，0.01～10％肌肽，0.01～10％四氢甲基嘧啶羧酸，0.01～10％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚，0.01～10％植物提取物，0.5～20％磷脂、0.1～5％胆固醇、1～20％乳化剂、1～40％多元醇和余量的水。本发明提供的美白活性肽纳米组合物采用多种美白原料协同作用，从不同途径抑制酪氨酸酶活性，有效从源头防止黑色素生成，且稳定性好、安全性高，能提高活性成分的经皮渗透生物利用度和皮肤储留量，并缓释、控释，延长作用时间，具有优异的美白功效。

Description

一种美白活性肽纳米组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体地涉及一种美白活性肽纳米组合物及其制备方法和应用。
背景技术
人体皮肤的颜色由多种色素共同参与决定，其中最主要的就是黑色素，黑色素的合成过程相当复杂，是一个多步骤的酶促生化反应。首先皮肤中的黑素细胞摄取酪氨酸后，在含铜离子的酪氨酸酶的作用下氧化为多巴醌，多巴醌很快经过分子内环合变成多巴色素，多巴色素经过分子内重排，最后形成黑色素。
酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，其数量和活性决定了黑色素合成的速率。酪氨酸酶的活性受多种因素影响：(1)紫外线照射皮肤，能使酪氨酸酶活性增加，还能诱导活性氧引起色素沉着；(2)酪氨酸酶以铜离子作为辅基，其活性与铜离子相关，巯基化合物能通过络合铜离子而抑制酪氨酸酶活性；(3)角质细胞释放的内皮素能与黑素细胞膜受体结合，能刺激黑素细胞分化、增殖，并提高酪氨酸酶的活性；(4)促黑素细胞激素(MSH-α)与黑素细胞上的黑皮素-1受体(MC-1R)结合，经腺苷酸环化酶来提高环磷酸腺苷(cAMP)的水平，从而增强酪氨酸酶的活性，刺激黑素细胞分化、增殖，促进黑色素合成。
目前市售美白产品虽然层出不穷，然而目前的市售美白产品往往无法真正从源头阻断黑色素的合成；其次，市售美白产品大多是将美白活性成分直接加入化妆品中，在产品放置过程中美白活性成分易失去活性，导致美白效果不佳；再次，黑素细胞存在于皮肤表皮的基底层，由于皮肤自有屏障功能，产品中的美白活性成分难以透过皮肤屏障到达基底层，大大降低美白功效；此外，部份美白活性成分还易引起皮肤刺激。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种美白活性肽纳米组合物，按质量百分比计，其原料组成包括：
进一步地，所述植物提取物为洋甘菊提取物、三白草提取物、山茶花提取物、甘草提取物、川芎提取物、红景天提取物、原花青素、维药牛舌草提取物、茶叶提取物、桑白皮提取物中的至少一种。
进一步地，所述磷脂为卵磷脂、大豆卵磷脂、羟基化卵磷脂、氢化卵磷脂、氢化溶血卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、氢化磷脂酰胆碱中的至少一种。
进一步地，所述乳化剂为聚甘油类乳化剂、聚氧乙烯类乳化剂、葡萄苷类乳化剂、蔗糖类乳化剂中的至少一种。所述聚甘油类乳化剂优选为聚甘油-10油酸酯、聚甘油-10月桂酸酯、聚甘油-10肉豆蔻酸酯中的至少一种；所述聚氧乙烯类乳化剂优选为PEG-10油酸酯、PEG-40甘油椰油酸酯、PEG-8辛酸/癸酸甘油酯类、聚氧乙烯氢化蓖麻油中的至少一种；所述葡糖苷类乳化剂优选为十六烷基葡糖苷、月桂基葡糖苷、鲸蜡硬脂基葡糖苷中的至少一种；所述蔗糖类乳化剂优选为蔗糖多硬脂酸酯、蔗糖油酸酯、蔗糖棕榈酸酯中的至少一种。
进一步地，所述多元醇为丙二醇、辛甘醇、1,2-戊二醇、丁二醇、1,2-己二醇、1,3-丙二醇、双丙甘醇、甘油、PEG-200中的至少一种。
进一步地，所述美白活性肽纳米组合物的粒径为10～200nm，Zeta电位为-60～0mV。
另一方面，本发明还提供了一种制备上述任一所述的美白活性肽纳米组合物的方法，包括如下步骤：
S1、将所述九肽-1、六肽-2、肌肽、四氢甲基嘧啶羧酸、植物提取物、乳化剂、水混合，之后，进行低压均质处理，得到水相；
S2、将所述异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、磷脂、胆固醇、多元醇混合，得到脂质溶液；
S3、将所述步骤S1中的水相与所述步骤S2中的脂质溶液进行混合乳化，之后，进行微米化处理，得到微米级分散体；
S4、经所述步骤S3中的微米级分散体进行纳米化处理，得到所述美白活性肽纳米组合物。
进一步地，所述步骤S1中，混合的温度为20～70℃，所述低压均质的压力为200～600bar，所述低压均质的温度为20～70℃，所述低压均质的次数为1～8次；所述步骤S2中，混合的温度为20～70℃；所述步骤S3中，混合乳化的方式为：在温度为20～70℃并伴随搅拌的条件下将所述脂质溶液滴加至所述水相中，所述微米化处理为高速剪切乳化；所述步骤S4中，纳米化处理为高压均质处理或高速微射流处理。
进一步地，所述步骤S3中，所述搅拌的速率为200～1000rpm，滴加的速度为1～15滴/秒。
此外，本发明还提供了一种上述美白活性肽纳米组合物在化妆品中的应用。
本发明将九肽-1、六肽-2、肌肽、四氢甲基嘧啶羧酸、异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、植物提取物负载于同一纳米级脂质囊泡中，协同增效，使得所制备的美白活性肽纳米组合物具有显著的美白、抗氧化功效，且可从源头防止黑色素生成。此外，活性成分被包裹于脂质囊泡中，可防止活性成分氧化降解或失活，提高活性成分的稳定性；同时，脂质囊泡的磷脂双分子层结构能够进入皮肤角质层细胞内部，与角蛋白相互作用，使角质层细胞的致密程度降低，并构成脂质通道，促进活性成分透过角质层进入皮肤基底层，能提高活性成分的经皮渗透量，延长活性成分在皮肤中的滞留时间和作用时间，提升美白功效。
本发明制备的美白活性肽纳米组合物可从多角度、全方位抑制酪氨酸酶的活性，可从源头阻断黑色素生成。九肽-1、六肽-2是促黑素细胞激素(MSH-α)的结构相似物，九肽-1、六肽-2通过竞争性结合黑素细胞上的MC-1R，进而干扰MSH-α与MC-1R结合，抑制黑素细胞分化、增殖，从而抑制酪氨酸酶的活性，减少黑色素的生成，此外，九肽-1分子中的巯基能与酪氨酸酶中的铜离子络合而抑制酪氨酸酶活性；肌肽能还原黑色素生成环节中的氧化产物多巴醌并抑制其生成，从而阻断黑色素的生成，此外，肌肽还能抑制由于紫外线、雾霾等引起的自由基活性氧，从而减缓皮肤胶原蛋白等的氧化导致的皮肤衰老和肤色暗沉；异丁酰胺基噻唑基间苯二酚可有效抑制酪氨酸酶的活性，进而抑制黑素合成；四氢甲基嘧啶羧酸来源于高嗜盐性菌，是较好的保湿剂、角质屏障修复剂，使皮肤能有效对抗微生物及过敏原的入侵，减少皮肤水分散失，此外，其还能修复紫外线导致的细胞DNA损伤，有效减少晒伤细胞的生成，防止细胞膜结构受到伤害，并降低紫外线诱导的活性氧引起的色素沉着；洋甘菊提取物是高效的内皮素拮抗剂，能够竞争性地抑制内皮素与黑素细胞膜受体结合，从而抑制黑素细胞分化、增殖，抑制酪氨酸酶的活性；三白草提取物、山茶花提取物、甘草提取物、川芎提取物、红景天提取物、原花青素、维药牛舌草提取物、茶叶提取物、桑白皮提取物等植物提取物具有较好的美白祛斑、抗炎、抗氧化功效。
本发明还提供了上述美白活性肽纳米组合物在制备具有美白、淡斑、亮肤等功效的化妆品中的应用。所述化妆品的形式包括但不限于化妆水、精华、膏霜、乳液、面膜和凝胶。利用本发明所述美白活性肽纳米组合物制备为化妆品时，可直接将所述美白活性肽纳米组合物添加于各类具有美白、淡斑、亮肤产品的基质中，使用方便，所述纳米组合物在化妆品中添加的质量百分含量为0.1～30％。
附图说明
图1为实施例15中对比例2制备的纳米复合霜剂和对比例3制备的普通霜剂在12h后体外皮肤累积透过量结果图；和普通霜剂比较，**P<0.01；
图2为实施例15中对比例2制备的纳米复合霜剂和对比例3制备的普通霜剂的体外皮肤滞留量结果图；和普通霜剂比较，**P<0.01；
图3为实施例16中测试样品酪氨酸酶活性结果图；与模型组比较，**P<0.01；与游离对照组比较，#P<0.05；
图4为实施例17中测试样品ROS含量测定结果图；与模型组比较，**P<0.01；与游离对照组比较，#P<0.05；
图5为实施例18中测试样品抗UVB损伤结果图；与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05；与游离对照组比较，#P<0.05；
图6为实施例19中测试样品黑色素MI值变化率结果图；与空白对照组比较，##P<0.01；与游离对照组比较，fP<0.05；与美白活性肽组比较，aP<0.05；与肌肽组比较，bP<0.05；与四氢甲基嘧啶羧酸组比较，cP<0.05；与植物提取物组比较，ddP<0.01；与异丁酰胺基噻唑基间苯二酚组比较，eP<0.05。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
以下实施例制备的美白活性肽纳米组合物的粒径、Zeta电位均采用ZetasizerNano-ZS90激光粒度仪检测。
实施例1：
以质量百分含量计：
将0.001％九肽-1、0.001％六肽-2、0.01％肌肽、0.01％四氢甲基嘧啶羧酸、0.01％洋甘菊提取物、15％聚甘油-10油酸酯、5％聚氧乙烯氢化蓖麻油与4.968％水在温度为60℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为60℃、压力为200bar条件下进行低压均质处理，循环1次，得到水相；
将10％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、10％卵磷脂、10％羟基化卵磷脂、5％胆固醇与15％1,2-戊二醇、15％1,2-己二醇、10％1,3-丙二醇在温度为60℃水浴加热条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以1滴/秒的速度加入水相中并在200rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为3000rpm的条件下高速剪切乳化1min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为60℃、压力为700bar条件下进行高压均质处理，循环1次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物的粒径为12.3nm，Zeta电位为-5.3mV。
本发明对所述美白活性肽纳米组合物中的组分的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明将水相物质进行低压均质预处理，提高了九肽-1、六肽-2、肌肽、四氢甲基嘧啶羧酸的溶解度，进而提高了美白活性肽纳米组合物的稳定性。
在本发明中，将脂质溶液滴加至水相中时，脂质溶液中磷脂和胆固醇在水中可形成磷脂双分子层的球形脂质囊泡，混合乳化时，活性成分被包封于脂质囊泡中，可防止活性成分氧化降解或失活，提高活性成分的稳定性。将水相和脂质溶液混合乳化后依次进行微米化、纳米化处理，使得脂质囊泡粒径纳米化，粒度更均一。
实施例2：
以质量百分含量计：
将0.005％九肽-1、0.005％六肽-2、0.1％肌肽、0.05％四氢甲基嘧啶羧酸、0.1％三白草提取物、9％聚甘油-10油酸酯、9％聚氧乙烯氢化蓖麻油与15.24％水在温度为70℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为70℃、压力为600bar条件下进行低压均质处理，循环8次，得到水相；
将9％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、10％卵磷脂、8％羟基化卵磷脂、4.5％胆固醇、10％1,2-己二醇、10％1,3-丙二醇、15％甘油在温度为70℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以15滴/秒的速度加入水相中并在1000rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为15000rpm的条件下高速剪切乳化10min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为70℃、压力为1800bar条件下进行高压均质处理，循环8次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物的粒径为187.5nm，Zeta电位为-58.6mV。
实施例3：
以质量百分含量计：
将0.01％九肽-1、0.01％六肽-2、0.5％肌肽、0.1％四氢甲基嘧啶羧酸、0.5％甘草提取物、8％聚甘油-10肉豆蔻酸酯、8％PEG-8辛酸/癸酸甘油酯类与25.88％水在温度为30℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为30℃、压力为300bar条件下进行低压均质处理，循环2次，得到水相；
将8％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、10％大豆卵磷脂、5％羟基化卵磷脂、4％胆固醇、10％1,2-己二醇、10％1,3-丙二醇与10％甘油在温度为30℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以2滴/秒的速度加入水相中并在300rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为5000rpm的条件下高速剪切乳化2min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为30℃、压力为800bar条件下进行高压均质处理，循环2次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物的粒径为36.2nm，Zeta电位为-12.8mV。
实施例4：
以质量百分含量计：
将0.03％九肽-1、0.03％六肽-2、2％肌肽、0.5％四氢甲基嘧啶羧酸、1％川芎提取物、8％聚甘油-10肉豆蔻酸酯、7％PEG-8辛酸/癸酸甘油酯类与31.94％水在温度为50℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为50℃、压力为400bar条件下进行低压均质处理，循环6次，得到水相；
将7％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、7％大豆卵磷脂、7％氢化磷脂酰胆碱、3.5％胆固醇、15％1,2-己二醇、10％丙二醇在温度为50℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以10滴/秒的速度加入水相中并在700rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为11000rpm的条件下高速剪切乳化6min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为50℃、压力为1400bar条件下进行高压均质处理，循环6次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物的粒径为68.5nm，Zeta电位为-38.7mV。
实施例5：
以质量百分含量计：
将0.05％九肽-1、0.05％六肽-2、1％肌肽、1％四氢甲基嘧啶羧酸、2％原花青素、10％聚甘油-10油酸酯、4％PEG-10油酸酯与35.9％水在温度为40℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为40℃、压力为400bar条件下进行低压均质处理，循环4次，得到水相；
将6％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、6％卵磷脂、6％磷脂酰胆碱、3％胆固醇、15％丁二醇、10％甘油在温度为40℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以6滴/秒的速度加入水相中并在500rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为7000rpm的条件下高速剪切乳化4min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为40℃、压力为1000bar条件下进行高压均质处理，循环5次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物的粒径为79.7nm，Zeta电位为-24.7mV。
实施例6：
以质量百分含量计：
将0.1％九肽-1、0.2％六肽-2、2％肌肽、2％四氢甲基嘧啶羧酸、3％红景天提取物、10％月桂基葡糖苷、2％蔗糖棕榈酸酯与43.2％水在温度为40℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为40℃、压力为400bar条件下进行低压均质处理，循环5次，得到水相；
将5％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、5％大豆卵磷脂、5％羟基化卵磷脂、2.5％胆固醇、10％辛甘醇与10％甘油在温度为40℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以7滴/秒的速度加入水相中并在500rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为8000rpm的条件下高速剪切乳化4min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为40℃、压力为1100bar条件下进行高压均质处理，循环5次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物粒径为96.4nm，Zeta电位为-27.6mV。
实施例7：
以质量百分含量计：
将0.2％九肽-1、0.1％六肽-2、4％肌肽、6％四氢甲基嘧啶羧酸、3％山茶花提取物、2％维药牛舌草提取物、6％十六烷基葡糖苷、4％蔗糖油酸酯与45.7％水在温度为50℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为50℃、压力为500bar条件下进行低压均质处理，循环4次，得到水相；
将4％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、4％羟基化卵磷脂、4％氢化卵磷脂、2％胆固醇与10％1,2-己二醇、5％1,3-丙二醇在温度为50℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以9滴/秒的速度加入水相中并在600rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为10000rpm的条件下高速剪切乳化5min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为50℃、压力为1300bar条件下进行高压均质处理，循环4次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物的粒径为42.8nm，Zeta电位为-33.5mV。
实施例8：
以质量百分含量计：
将0.5％九肽-1、0.8％六肽-2、6％肌肽、4％四氢甲基嘧啶羧酸、3％三白草提取物、3％原花青素、3％聚甘油-10月桂酸酯、3％PEG-40甘油椰油酸酯与54.2％水在温度为60℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为60℃、压力为500bar条件下进行低压均质处理，循环7次，得到水相；
将1％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、5％氢化磷脂酰胆碱、1.5％胆固醇、10％1,2-戊二醇、5％1,3-丙二醇在温度为60℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以13滴/秒的速度加入水相中并在800rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为13000rpm的条件下高速剪切乳化8min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为60℃、压力为1600bar条件下进行高压均质处理，循环6次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物粒径为124.3nm，Zeta电位为-49.4mV。
实施例9：
以质量百分含量计：
将0.8％九肽-1、0.5％六肽-2、8％肌肽、8％四氢甲基嘧啶羧酸、5％茶叶提取物、3％桑白皮提取物、3％鲸蜡硬脂基葡糖苷与69.19％水在温度为60℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为60℃、压力为500bar条件下进行低压均质处理，循环7次，得到水相；
将0.01％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、1％氢化溶血卵磷脂、0.5％胆固醇与1％双丙甘醇在温度为60℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以14滴/秒的速度加入水相中并在900rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为14000rpm的条件下高速剪切乳化9min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为60℃、压力为16000psi条件下进行高速微射流处理，循环7次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物粒径为165.7nm，Zeta电位为-52.3mV。
实施例10：
以质量百分含量计：
将0.4％九肽-1、0.4％六肽-2、5％肌肽、5％四氢甲基嘧啶羧酸、2％洋甘菊提取物、2％原花青素、3％聚甘油-10油酸酯、5％PEG-10油酸酯与47.2％水在温度为20℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为20℃、压力为300bar条件下进行低压均质处理，循环3次，得到水相；
将2％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、6％氢化卵磷脂、2％胆固醇、10％1,2-戊二醇、10％丁二醇在温度为20℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以5滴/秒的速度加入水相中并在400rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为6000rpm的条件下高速剪切乳化3min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在20℃、压力为5000psi条件下进行高速微射流处理，循环3次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物粒径为55.8nm，Zeta电位为-18.3mV。
实施例11：
以质量百分含量计：
将0.6％九肽-1、0.6％六肽-2、7％肌肽、7％四氢甲基嘧啶羧酸、4％三白草提取物、3％原花青素、5％蔗糖多硬脂酸酯与58.3％水在温度为40℃水浴条件下加热溶解，之后，溶解的混合物在温度为40℃、压力为400bar条件下进行低压均质处理，循环5次，得到水相；
将0.5％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、3％卵磷脂、1％胆固醇、10％甘油在温度为40℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以8滴/秒的速度加入水相中并在600rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为9000rpm的条件下高速剪切乳化5min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为40℃、压力为1200bar条件下进行高压均质处理，循环4次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物粒径为110.1nm，Zeta电位为-30.2mV。
实施例12：
以质量百分含量计：
将1％九肽-1、1％六肽-2、10％肌肽、10％四氢甲基嘧啶羧酸、6％三白草提取物、4％川芎提取物、1％聚氧乙烯氢化蓖麻油与61.3％水在温度为50℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为50℃、压力为400bar条件下进行低压均质处理，循环6次，得到水相；
将0.1％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、0.5％溶血卵磷脂、0.1％胆固醇、5％PEG-200在温度为50℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以12滴/秒的速度加入水相中并在700rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为12000rpm的条件下高速剪切乳化7min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为50℃、压力为1500bar条件下进行高压均质处理，循环7次，之后，冷却至室温，得到美白活性肽纳米组合物。
对上述美白活性肽纳米组合物的粒径和Zeta电位进行检测，可得该美白活性肽纳米组合物粒径为89.2nm，Zeta电位为-45.2mV。
实施例13：
稳定性试验
将实施例1～12制备的美白活性肽纳米组合物分别在密闭容器、室温条件下放置6个月，对美白活性肽纳米组合物的粒径、Zeta电位进行检测，观察样品性状，并通过高效液相色谱HPLC测试各美白活性肽纳米组合物中九肽-1的含量，计算6个月后九肽-1剩余含量占九肽-1初始含量的百分比，综合评价美白活性肽纳米组合物的稳定性，具体检测结果如下表1所示。
表1
由表1的检测结果可知，本发明制备的美白活性肽纳米组合物的粒径在10～200nm之间，Zeta电位在-60～0mV之间，完全满足实际应用要求；美白活性肽纳米组合物在放置6个月后粒径、Zeta电位未发生显著性变化，外观未出现析出、团聚、分层现象，尤其在活性成分浓度高的情况下仍然较稳定；美白活性肽室温条件下放置6个月后含量没有出现显著性变化，仍然满足实际应用需求。因此，本发明提供的美白活性肽纳米组合物具有较好的稳定性。
对比例1：
以质量百分含量计：
将5％辛酸癸酸甘油三酯、5％白油、2％十六十八醇、2％硬脂醇聚醚-2、2％硬脂醇聚醚-21在温度为75℃水浴条件下加热熔融后得到油相；将5％丙二醇、0.15％卡波姆和余量的纯化水在温度为75℃水浴条件下加热溶解，得到水相；在温度为75℃条件下将油相以5滴/秒的速度滴加至水相中，滴加过程中控制搅拌速率为800rpm，混合完成后于10000rpm转速下剪切乳化3min，加入0.15％三乙醇胺，继续剪切2min，冷却后加入0.5％苯氧乙醇，搅拌均匀即得空白霜剂。
实施例14：
刺激性试验
将实施例1～12所制得的美白活性肽纳米组合物，分别与对比例1中的空白霜剂按照质量比为3:7进行复配，得相对应的复合霜剂，将复合霜剂进行皮肤刺激性试验：
取健康家兔78只，体重(2.0±0.2)kg，随机分为13组，其中12组为实施例组，1组为空白对照组，每组动物6只，于实验前24h将家兔背部皮肤两侧去毛，去毛后24h检查去毛皮肤是否受伤，受伤皮肤不宜做皮肤刺激性试验。实施例组每天分别涂抹使用实施例1～12得到的美白活性肽纳米组合物制备的复合霜剂3次，连续涂抹7天，空白对照组涂抹对比例1中的空白霜剂以进行对照，观察试验结果，试验结果如下表2所示。
表2
“+”家兔皮肤充血、红肿；“++”表示充血、红肿现象仍在，但有增加趋势；“—”表示无充血、红肿现象。
由表2的试验结果可以知，使用空白霜剂以及实施例1～12制得的美白活性肽纳米组合物复配成的复合霜剂涂抹于家兔皮肤后均无充血、红肿现象，说明本发明提供的美白活性肽纳米组合物对皮肤温和无刺激。
对比例2：
将实施例10制备的美白活性肽纳米组合物与对比例1中的空白霜剂按照质量比为1：9进行复配，即得到纳米复合霜剂。纳米复合霜剂中功效成分及含量分别为：0.04％九肽-1、0.04％六肽-2、0.5％肌肽、0.5％四氢甲基嘧啶羧酸、0.2％洋甘菊提取物、0.2％原花青素、0.2％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚。
对比例3：
以质量百分含量计：
将0.2％异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、5％辛酸癸酸甘油三酯、5％白油、2％十六十八醇、2％硬脂醇聚醚-2、2％硬脂醇聚醚-21于75℃水浴中加热熔融后得到油相；将0.04％九肽-1、0.04％六肽-2、0.5％肌肽、0.5％四氢甲基嘧啶羧酸、0.2％洋甘菊提取物、0.2％原花青素、5％丙二醇、0.15％卡波姆和余量的纯化水于75℃水浴溶解，得到水相；将油相滴加至水相搅拌混合，于10000rpm转速下剪切乳化3min，加入0.15％三乙醇胺，继续剪切2min，冷却后加入0.5％苯氧乙醇，搅拌均匀，即得与纳米复合霜剂中功效成分及含量相同的普通霜剂。
实施例15：
体外透皮实验
采用垂直式Franz扩散池法进行离体鼠皮的透皮实验：将SD雄性大鼠腹部皮肤固定于接收室和供给室之间，取对比例2制备的纳米复合霜剂和对比例3制备的普通霜剂各1g于供给室中，以质量分数15％丙二醇、5％吐温80和80％的生理盐水为接收液，37℃下搅拌扩散。于1，2，4，6，8，10，12h取0.5mL接收液，并即时补充等量恒温的新鲜接收液。HPLC分析，计算不同时间特定药物单位面积累积透过量。12h后，取下皮肤，洗净后剪碎，研磨成匀浆液，加适量接收液离心，取上清液HPLC分析，计算特定药物的单位面积皮肤滞留量。本实验中测定的药物为九肽-1。实验结果如图1、图2和表3所示。
表3
组别 纳米复合霜剂 普通霜剂
皮肤累积透过量(μg/cm2) 214.3 117.4
皮肤滞留量(μg/cm2) 65.7 34.9
由图1、图2和表3的实验结果可知，对比例3制备的普通霜剂12h后皮肤累积透过量仅为117.4μg/cm2，而对比例2制备的纳米复合霜剂12h后皮肤累积透过量为214.3μg/cm2，表明美白活性成分经纳米包载后在皮肤中的累积透过量显著提高(**P<0.01)。而且，由于皮肤自有屏障功能，导致普通霜剂中的活性成分难以透过角质层到达基底层发挥作用，纳米复合霜剂中的活性成分经纳米包载后粒径小，比表面积大，与细胞之间具有更强的粘附性，纳米组合物的磷脂双分子层结构与皮肤有较好的生物相容性，能提高活性成分的经皮渗透量。
对比例3制备的普通霜剂12h后皮肤滞留量仅为34.9μg/cm2，而对比例2制备的纳米复合霜剂12h后皮肤滞留量为65.7μg/cm2，表明美白活性成分经纳米包载后在皮肤中的滞留量显著提高(**P<0.01)，延长了活性成分在皮肤中的滞留时间和作用时间，提升了活性成分的美白功效。
对比例4：
将实施例12中的美白活性成分去掉，制备相应的空白纳米组合物，制备方法如下：
以质量百分含量计：
将1％聚氧乙烯氢化蓖麻油与93.4％水在温度为50℃水浴条件下加热溶解，之后，将溶解的混合物在温度为50℃、压力为400bar条件下进行低压均质处理，低压均质的次数为6次，得到水相；
将0.5％溶血卵磷脂、0.1％胆固醇、5％PEG-200在温度为50℃水浴条件下加热溶解，得到脂质溶液；
将上述脂质溶液以12滴/秒的速度加入水相中并在700rpm的转率下不断搅拌，混合完成后，在转速为12000rpm的条件下高速剪切乳化7min，得到微米级分散体；
将上述微米级分散体在温度为50℃、压力为1500bar条件下进行高压均质处理，高压均质的次数为7次，之后，冷却至室温，得到空白纳米组合物。
实施例16：
酪氨酸酶活性抑制试验
测试样品：将实施例10、11、12所制得的美白活性肽纳米组合物用DMEM培养液稀释1000倍，用于加入相对应的美白活性肽纳米组合物组的细胞中；取九肽-1、六肽-2、肌肽、四氢甲基嘧啶羧酸、三白草提取物、川芎提取物、异丁酰胺基噻唑基间苯二酚作为游离活性原料，利用DMEM培养液稀释，直至各活性成分的百分含量与实施例12所制得的美白活性肽纳米组合物稀释后的相对应的活性成分的百分含量相同，用于加入游离对照组的细胞中；将对比例4所得的空白纳米组合物用DMEM培养液稀释1000倍，用于加入游离对照组的细胞中。
采用L-Dopa氧化法测定细胞内酪氨酸酶的活性。取B16F10细胞以1×105个/mL接种于12孔板中，每孔1mL，培养24h，将细胞分为空白对照组、模型组、游离对照组和美白活性肽纳米组合物组。每孔加入100nM的α-MSH进行诱导(除空白对照组外)，构建α-MSH诱导的黑色素高表达模型，再加入相对应的测试样品，每组设3个复孔。培养48h后，弃去上清液，用PBS清洗3次，每孔加入含1％TritonX-100的PBS缓冲液300μL，置于-80℃冰箱中冷冻1h，随后室温融化，将细胞裂解液在12000rpm离心20min，收集上清液。取上清液60μL于96孔板中，加入140μL的0.1％L-Dopa，37℃孵育1h，于490nm波长处测各孔的吸光度(A)，采用BCA法测定细胞裂解液中蛋白浓度(C)，计算酪氨酸酶活性，试验结果如图3和表4所示。
酪氨酸酶活性(％)＝(A样品/C样品)÷(A模型/C模型)×100％
表4
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由图3和表4的试验结果可知，与空白对照组相比，模型组酪氨酸酶活性显著上升，说明α-MSH诱导的黑素表达刺激了B16F10细胞内酪氨酸酶的合成。与模型组酪氨酸酶活性(100.00％)比较，实施例10、11、12制得的纳米组合物均能显著降低酪氨酸酶活性，酪氨酸酶活性分别为60.32％、54.17％和47.36％(**P<0.01)，说明本发明制备的纳米组合物能有效减少黑素细胞中酪氨酸酶的产生，从而抑制酪氨酸酶的活性；与游离对照组酪氨酸酶活性比较，实施例12制得的纳米组合物对酪氨酸酶活性的降低具有显著性差异(#P<0.05)，表明活性肽经纳米包载后能更有效地抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素的生成。
实施例17：
HaCaT氧化细胞模型胞内ROS含量的测定
测试样品与实施例16中的测试样品相同。
取对数生长期的HaCaT细胞，以每孔2×105个细胞的密度接种于24孔板培养24h后，将细胞分为空白对照组、模型组、游离对照组和美白活性肽纳米组合物组，每组3个复孔。除了空白对照组外，每孔分别加入含有1mmol/L H2O2和相对应的测试样品继续培养，每组设3个复孔。孵育24h后，用DMEM培养基将细胞洗涤3次，加入含有20μmol/L DCFH-DA的DMEM培养基继续孵育20min。然后弃去培养液，细胞用PBS洗涤3次，用含有1％TritonX-100(V％)的细胞裂解液，然后置于-80℃冷冻裂解30min，随后在室温条件下解冻，收集细胞裂解液离心，取上清液用酶标仪检测荧光强度。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定每组细胞的蛋白质水平。每组的ROS水平用平均荧光强度除以蛋白质质量表示。实验结果如图4和表5所示。
表5
由图4和表5的实验结果可知，与空白对照相比，模型组HaCaT细胞内ROS水平明显升高，说明H2O2诱导的氧化应激刺激了HaCaT细胞内ROS的产生。与模型组ROS的平均荧光强度(2671)比较，实施例10、11、12制得的纳米组合物均能显著降低ROS的平均荧光强度，ROS的平均荧光强度分别为1719、1598、1386(**P<0.01)，说明发明制备的纳米组合物能有效减少ROS的产生，从而减少ROS水平过高导致的病理性皮肤色素沉着；与游离对照组ROS的平均荧光强度(1865)比较，实施例12制得的纳米组合物对ROS平均荧光强度的降低具有显著性差异(#P<0.05)，表明美白活性成分经纳米包载后抗氧化、抗自由基效果显著提升，能更有效减少皮肤色素沉着的形成。
实施例18：
成纤维细胞UVB损伤模型细胞活性的测定
测试样品与实施例16中的测试样品相同。
将成纤维细胞以每孔3×104个细胞的密度接种到96孔板中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h，将细胞分为空白对照组、模型组、游离对照组和美白活性肽纳米组合物组。吸出细胞板中的培养基，空白对照组和模型组各加入500μL的无血清培养基，空白对照组避光培养，模型组用15W的UVB灯管，水平放置在距离细胞培养瓶底20cm的正上方进行照射，辐照时间30min，强度60J/min，游离对照组和美白活性肽纳米组合物组加入相对应的测试样品后在同样条件下进行UVB照射处理，每次照射完成后将细胞放入培养箱中继续培养。培养24h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，在培养箱中孵育2h，使用酶标仪在450nm处测定OD值，计算细胞存活率(％)。实验结果如图5和表6所示。
表6
由图5和表6的实验结果可知，与空白对照比较，模型组细胞存活率明显降低，说明UVB产生的紫外损伤使细胞存活率下降。与模型组细胞存活率(45.32％)比较，实施例10、11、12制得的纳米组合物对细胞存活率的提高具有显著性差异，细胞存活率分别为66.35％、72.54％、81.20％(**P<0.01，*P<0.05)，说明发明制备的纳米组合物能有效修复紫外线导致的细胞DNA损伤，防止细胞膜结构受到伤害，减少晒伤细胞的生成；与游离对照组细胞存活率(60.50％)比较，实施例12制得的纳米组合物对细胞存活率的提高具有显著性差异(#P<0.05)，表明活性成分经纳米包载后抑制紫外线导致的细胞损伤和色素沉着效果显著提升。
对比例5：
与实施例10的区别在于：九肽-1质量百分含量为8.4％，六肽-2的质量百分含量为8.4％，不含肌肽、四氢甲基嘧啶羧酸、洋甘菊提取物、原花青素、异丁酰胺基噻唑基间苯二酚。
对比例6：
与实施例10的区别在于：肌肽质量百分含量为16.8％，不含九肽-1、六肽-2、四氢甲基嘧啶羧酸、洋甘菊提取物、原花青素、异丁酰胺基噻唑基间苯二酚。
对比例7：
与实施例10的区别在于：四氢甲基嘧啶羧酸质量百分含量为16.8％，不含九肽-1、六肽-2、肌肽、洋甘菊提取物、原花青素、异丁酰胺基噻唑基间苯二酚。
对比例8：
与实施例10的区别在于：洋甘菊提取物质量百分含量为8.4％，原花青素质量百分含量为8.4％，不含九肽-1、六肽-2、肌肽、四氢甲基嘧啶羧酸、异丁酰胺基噻唑基间苯二酚。
对比例9：
与实施例10的区别在于：异丁酰胺基噻唑基间苯二酚质量百分含量为16.8％，不含九肽-1、六肽-2、肌肽、四氢甲基嘧啶羧酸、洋甘菊提取物、原花青素。
实施例19：
人体美白功效评价
测试样品：将实施例10～12制得的美白活性肽纳米组合物以及对比例5～9所制得的纳米组合物分别与对比例1中的空白霜剂按照质量比1：9进行复配，得到纳米复合霜剂，实施例10～12样品为实施例组，对比例5～9样品分别为美白活性肽组、肌肽组、四氢甲基嘧啶羧酸组、植物提取物组、异丁酰胺基噻唑基间苯二酚组；对比例3制备的普通霜剂作为游离对照组。
选取符合条件的受试志愿者20人，男女各半，年龄在25～45岁，分别在每位志愿者的左、右手臂内侧划定区域标记受测部位(4cm×4cm)，同一手臂可同时标记多个区域，区域间隔1cm，测试样品均随机分布在左、右手臂上，每天涂抹2次，9:00和20:00各1次，实验期间，志愿者在实验部位不能涂抹任何其他化妆品。测试前和连续使用测试样品4周后，志愿者将涂抹部位用清水洗净，由测试者使用皮肤黑色素和血红素测试仪Mexameter MX18测定皮肤黑色素指标MI值，测量数值越高，说明皮肤中黑色素含量越高。同一个志愿者的测试由同一个测量人员完成，以减小误差。计算受试者黑色素MI值变化率(即相对起始值变化)，用SPSS系统进行t检验，实验结果如图6和表7所示。
表7
由图6和表7的试验结果可知，与空白对照组相比，实施例10、11、12制得的美白活性肽纳米组合物对黑色素MI值的降低具有显著性差异(##P<0.01)，4周后黑色素MI值分别降低了20.5％、24.5％、29.3％，黑色素含量显著下降，说明发明制备的纳米组合物能有效抑制黑色素生成，具有优异的美白功效；实施例10制备的纳米复合霜剂和游离对照组制备的普通霜剂活性成分及含量相同，与游离对照组相比，实施例10制备的纳米复合霜剂对黑色素MI值的降低具有显著性差异(fP<0.05)，表明活性成分经纳米包载后美白亮肤功效更优。
美白活性肽组、肌肽组、四氢甲基嘧啶羧酸组、植物提取物组、异丁酰胺基噻唑基间苯二酚组与实施例10制备的纳米复合霜剂活性成分总浓度相同，由表7可知，与美白活性肽组、肌肽组、四氢甲基嘧啶羧酸组、植物提取物组、异丁酰胺基噻唑基间苯二酚组相比，实施例10制备的纳米复合霜剂对黑色素MI值的降低具有显著性差异(与美白活性肽组相比，aP<0.05；与肌肽组相比，bP<0.05；与四氢甲基嘧啶羧酸组相比，cP<0.05；与植物提取物组相比，ddP<0.01；与异丁酰胺基噻唑基间苯二酚组相比，eP<0.05)，表明美白活性肽、肌肽、四氢甲基嘧啶羧酸、植物提取物、异丁酰胺基噻唑基间苯二酚具有协同作用，低浓度搭配使用比高浓度单独使用时美白功效更优。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种美白活性肽纳米组合物，其特征在于，按质量百分比计，其原料组成包括：
九肽-1 0.001～1%，
六肽-2 0.001～1%，
肌肽 0.01～10%，
四氢甲基嘧啶羧酸 0.01～10%，
异丁酰胺基噻唑基间苯二酚 0.01～10%，
植物提取物 0.01～10%，
磷脂 0.5～20%，
胆固醇 0.1～5%，
乳化剂 1～20%，
多元醇 1～40%，
余量的水；所述植物提取物为洋甘菊提取物和原花青素；所述磷脂为大豆卵磷脂、羟基化卵磷脂、氢化卵磷脂、氢化溶血卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、氢化磷脂酰胆碱中的至少一种；所述乳化剂为聚甘油类乳化剂、聚氧乙烯类乳化剂、葡糖苷类乳化剂、蔗糖类乳化剂中的至少一种；
其由下述顺序的步骤制备得到：
S1、将所述九肽-1、六肽-2、肌肽、四氢甲基嘧啶羧酸、植物提取物、乳化剂、水混合，之后，进行低压均质处理，得到水相；
S2、将所述异丁酰胺基噻唑基间苯二酚、磷脂、胆固醇、多元醇混合，得到脂质溶液；
S3、将所述步骤S1中的水相与所述步骤S2中的脂质溶液进行混合乳化：在温度为20～70℃并伴随搅拌的条件下将所述脂质溶液滴加至所述水相中，之后，进行微米化处理，得到微米级分散体；
S4、经所述步骤S3中的微米级分散体进行纳米化处理，得到所述美白活性肽纳米组合物。
2.根据权利要求1所述的美白活性肽纳米组合物，其特征在于，所述多元醇为丙二醇、辛甘醇、1,2-戊二醇、丁二醇、1,2-己二醇、1,3-丙二醇、双丙甘醇、甘油、PEG-200中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的美白活性肽纳米组合物，其特征在于，所述美白活性肽纳米组合物的粒径为10～200nm，Zeta电位为-60～0mV。
4.根据权利要求1所述的美白活性肽纳米组合物，其特征在于，
所述步骤S1中，混合的温度为20～70℃，所述低压均质的压力为200～600bar，所述低压均质的温度为20～70℃，所述低压均质的次数为1～8次；
所述步骤S2中，混合的温度为20～70℃；
所述步骤S3中，所述微米化处理为高速剪切乳化；
所述步骤S4中，纳米化处理为高压均质处理或高速微射流处理。
5.根据权利要求4所述的美白活性肽纳米组合物，其特征在于，所述步骤S3中，所述搅拌的速率为200～1000rpm，滴加的速度为1～15滴/秒。
6.一种如权利要求1至5任一所述的美白活性肽纳米组合物在制备化妆品中的应用。
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