CN114487184A - 一种测定2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷及其有关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种同时测定2β‑甲酯基‑3β‑(4‑氯苯基)托品烷及其有关物质的方法，属于药物分析领域，解决了现有分析方法不能将β‑CCT及其有关物质分离，无法对β‑CCT质量检测的缺陷。本发明同时测定2β‑甲酯基‑3β‑(4‑氯苯基)托品烷及其有关物质的方法，采用高效液相色谱法，所用的色谱柱为C18反相柱，流动相包括甲醇、水和酸性添加剂，甲醇、水和酸性添加剂的体积比为(25～40)：(60～75)：(0.05～1.5)；检测方法为紫外检测；所述有关物质为2α‑甲酯基‑3β‑(4‑氯苯基)托品烷和2β‑羧基‑3β‑(4‑氯苯基)托品烷。本发明的方法可使β‑CXCT、β‑CCT、α‑CCT在相同HPLC条件下基线分离。

Description

一种测定2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷及其有关物质的 方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种同时测定2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基) 托品烷及其有关物质的方法及2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷及其相关物质的含量分析方法。

背景技术

中枢神经系统的多巴胺转运体(dopamine transporter,简称DAT)是一种位于脑内多巴胺神经元突触前膜上的一种跨膜蛋白，在脑内神经递质的调控过程中起关键作用(German CL,et al.Pharmacol.Rev.2015,67:1005-1024；Ciliax B, etal.J.Neurosci.1995,15:1714-1723)。研究表明，多种神经系统疾病的病理改变都与DAT的变化有关，如帕金森病、药物成瘾、多动症、抑郁症、痴呆、焦虑症等(Palermo G,etal.Cells 2019,8:872；Zhu L,et al.Chem.Soc.Rev.2014,43: 6683-6691)。近年来，临床上采用正电子发射计算机断层(PET)或单光子发射计算机断层(SPECT)等技术，通过对脑内DAT的密度、分布以及功能进行成像分析，可以为DAT相关的疾病的早期诊断、病程分析、疗效监测等提供有效的分子影像手段(Strafella AP,et al.Mov.Disord.2017,32:181-192；Abbasi Gharibkandi N,et al.Eur J Med Chem 2019,166:75-89)。我们知道，临床上在使用PET和SPECT进行成像时，必须在显像前给病人注射一种具有特定体内示踪功能的放射性药物(又称放射性探针)。对于DAT显像而言，需要提前注射一种对DAT具有特异性体内结合性能的放射性药物。因此，用于DAT显像的放射性药物的研发与生产、质量控制等是神经科学领域、药学领域的重要研究内容。

目前，用于国际上已有一些用于DAT显像的放射性药物上市或正在进行临床研究。如，用于SPECT显像的锝[^99mTc]标记的^99mTc-TRODAT-1(Kung MP, etal.Eur.J.Nucl.Med.1997,24:372-380)已经在中国台湾省获得上市许可，并在巴西、伊朗、印度等国家获得了大范围的临床应用；用于PET显像的氟[¹⁸F]标记的[¹⁸F]FECNT，因其优良的体内外DAT结合特性，在动物和人体研究中都取得了优良的结果，具有临床推广应用价值(Xu S,et al.Psychiatry Res.2017,263: 121-126；Nye JA,et al.Nucl.Med.Biol.2014,41:217-222；Chen ZP,et al.Appl. Radiat.Isot.2008,26:1881-1885；Wang S,etal.Nucl.Sci.Techniques 2009,20: 11-16)；此外，[¹⁸F]FECNT的氘代结构[¹⁸F]FECNT-d₄除具有[¹⁸F]FECNT的优良外，还具有更好的体内靶向性和稳定性(Cao S,et al.Mol.ImagingBiol.2021, 23:733-744)，也具有极好的临床推广应用前景。我们从药物合成角度分析，这些用于DAT显像的放射性药物^99mTc-TRODAT-1、[¹⁸F]FECNT、[¹⁸F]FECNT-d₄等的合成方法，均是以可卡因(Cocaine)为起始原料，经多步合成反应而得。在药物合成过程中，需先制备出关键的药物中间体2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷(β-CCT)，并进行纯化，然后利用高纯度的β-CCT再分别经过多步反应制备^99mTc-TRODAT-1(Meegalla SK,etal.J.Med.Chem.1997,40:9-17；方平, et al.中国医药工业杂志2000,31:244-247)、[¹⁸F]FECNT(Chen ZP,et al.Appl. Radiat.Isot.2008,26:1881-1885；Murali D,et al.ApplRadiat Isot 2013,72: 128-132；Goodman MM,et al.Nucl.Med.Biol.2000,27:1-12)或[¹⁸F]FECNT-d₄ (Cao S,et al.Mol.Imaging Biol.2021,23:733-744)。

目前的技术资料，β-CCT是以脱水爱岗宁甲酯为反应物，通过与对氯苯基溴化镁进行迈克尔加成反应制得。根据反应机理，反应过程中将生成另一种结构相似的副产物2α-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷(α-CCT)，其分子结构与β-CCT 十分相似，不同之处在于2-位的甲酯基(COOCH₃)的立体位置不同。这类α-CCT 结构分子及其衍生物对DAT的亲和性和选择性很低，基本上没有DAT活性，是合成过程中必须去除的杂质(Clarke RL,etal.J.Med.Chem.1973,16: 1260-1267；Xu L,et al.J.Heterocycl.Chem.1996,33:2037-2039)。早期报道的合成β-CCT的工艺中，反应产物中α-CCT与β-CCT的比例约为1:3(ClarkeRL, et al.J.Med.Chem.1973,16:1260-1267)，在后续改进工艺中提高到了1:7(Xu L,etal.J.Heterocycl.Chem.1996,33:2037-2039)。虽然如此，目前还没有一种工艺能够完全避免α-CCT的生成。因此，为保证DAT显像药物^99mTc-TRODAT-1、 [¹⁸F]FECNT、[¹⁸F]FECNT-d₄的质量，在药物合成或生产过程中，必须对关键中间体β-CCT进行质量控制，监测β-CCT产物中α-CCT的含量。另一方面，由于β-CCT结构中含有一个甲酯基，在合成、储存过程中有可能发生降解反应，生成母环结构相似的物质2β-羧基-3β-(4-氯苯基)托品烷(β-CXCT)。

由于反应副产物α-CCT和降解产物β-CXCT都将影响后续的药物合成制备过程，最终影响DAT显像药物质量，在药物分析领域称为有关物质。因此，在 DAT显像药物的合成与生产过程中，关键中间体β-CCT的质量对DAT显像药物的制备至关重要，迫切需要建立一种能够快速、准确分析关键中间体β-CCT 及其有关物质(副产物α-CCT和降解产物β-CXCT)含量的方法，然而，目前为止，尚无一种能够分析β-CCT、α-CCT和β-CXCT的方法的报道。

发明内容

因此，本发明解决了现有分析方法不能将β-CCT及其有关物质分离，无法对β-CCT质量检测的缺陷，从而提供一种同时测定2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基) 托品烷及其有关物质的方法。

为此，本发明提供了以下技术方案。

一方面，本发明提供了一种同时测定2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷及其有关物质的方法，采用高效液相色谱法，所用的色谱柱为C18反相柱，流动相包括甲醇、水和酸性添加剂，甲醇、水和酸性添加剂的体积比为(25～40)： (60～75)：(0.05～1.5)；洗脱方式为等度洗脱；

检测方法为紫外检测；

所述有关物质为2α-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷和2β-羧基-3β-(4-氯苯基) 托品烷。

进一步的，甲醇和水和酸性添加剂的体积比为(30～35)：(65～70)： (0.05～1.5)。

进一步的，所述酸性添加剂为三氟乙酸、乙酸、甲酸中的至少一种。

进一步的，甲醇、水和酸性添加剂的体积比为30:70:0.1。

进一步的，所述紫外检测波长为200-230nm。

进一步的，所述紫外检测波长为220nm。

进一步的，所述流动相流速为0.5～1.5mL/min，优选为1.0mL/min。

进一步的，色谱柱温度为25～45℃。

进一步的，色谱柱温度为30℃。

另一方面，本发明提供了一种2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷及其相关物质的含量分析方法，包括：

(1)采用权利要求1-9任一项所述的方法分别获取2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷、2α-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷和2β-羧基-3β-(4-氯苯基)托品烷的浓度-峰面积标准曲线方程；

(2)检测样品，将样品的2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷、2α-甲酯基-3β-(4- 氯苯基)托品烷和2β-羧基-3β-(4-氯苯基)托品烷的峰面积分别代入对应的浓度- 峰面积标准曲线方程，获得各成分的浓度；

计算得到样品中2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷、2α-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷和2β-羧基-3β-(4-氯苯基)托品烷的含量。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的同时测定2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷及其有关物质的方法，采用高效液相色谱法，所用的色谱柱为C18反相柱，流动相包括甲醇、水和酸性添加剂，甲醇、水和酸性添加剂的体积比为(25～40)：(60～75)： (0.05～1.5)；检测方法为紫外检测；所述有关物质为2α-甲酯基-3β-(4-氯苯基) 托品烷和2β-羧基-3β-(4-氯苯基)托品烷。

本发明的方法可使β-CXCT、β-CCT、α-CCT在相同HPLC条件下基线分离，可同时对药物中间体β-CCT及其杂质(α-CCT和β-CXCT)含量进行分析，主成份与有关物质分离度好、专属性好、灵敏度高、准确度好、分析时间快、稳定性好，可应用于β-CCT的质量分析。本发明为托品烷衍生物有关药物的生产提供一种关键药物中间体β-CCT的质控分析技术。

2.本发明提供的2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷及其有关物质的检测方法，甲醇和水和酸性添加剂的体积比为(30～35)：(65～70)：(0.05～1.5)。在此范围内，不仅β-CXCT、β-CCT、α-CCT三者可以达到基线分离，且峰形对称，分离度好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是β-CCT、α-CCT和β-CXCT在200-400nm波长下的紫外全扫描图谱；

图2是流动相为甲醇-水-三氟乙酸＝25:75:0.1(v/v/v)的高效液相色谱图；

图3是流动相为甲醇-水-三氟乙酸＝30:70:0.1(v/v/v)的高效液相色谱图；

图4是流动相为甲醇-水-三氟乙酸＝35:65:0.1(v/v/v)的高效液相色谱图；

图5是流动相为甲醇-水-三氟乙酸＝40:60:0.1(v/v/v)的高效液相色谱图；

图6为β-CCT经酸、碱、氧化、加热、光照条件下处理过的样品溶液的高效液相色谱图；

图7为不含β-CCT样品，但使用图6空白溶剂经酸、碱、氧化、加热、光照条件下处理，所得空白溶剂对照图；

图8为经碱性条件处理后的β-CCT的高效液相色谱图和β-CXCT(纯)的高效液相色谱图；

图9为将β-CXCT(纯)和经碱性条件处理后的β-CCT混合后的高效液相色谱图；

图10为经氧化处理后的β-CCT的高效液相色谱图和β-CXCT(纯)的高效液相色谱图；

图11为将β-CXCT(纯)和经氧化处理后的β-CCT混合后的高效液相色谱图；

图12为对比例1流动相为甲醇-水的高效液相色谱图；

图13为对比例2流动相为甲醇-水-三乙胺的高效液相色谱图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

仪器设备：高效液相色谱仪(HPLC)，含进样器、紫外检测器和柱温箱。

色谱柱：C18色谱柱，4.6mm×150mm，5μm，

样品：

β-CCT：参照文献方法合成β-CCT粗品，并用硅胶柱层析法初步纯化(Xu L,etal.J.Heterocycl.Chem.1996,33:2037-2039)，产物用石油醚重结晶两次，方法为：将产物加于石油醚(5-10mL/g产物)中，于60℃加热，使样品溶解，冷却至室温，析出白色晶体，过滤出晶体。将所得晶体再用上方法重结晶一次，得白色针状β-CCT晶体，其结构验证有关数据如下：MS(ESI)m/z 294.37, 296.32；297.27.¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.27–7.14(m,4H),3.59– 3.54(m,1H),3.50(s,3H),3.36(s,1H),3.01–2.92(m,1H),2.87(t,J＝4.3Hz,1H), 2.55(td,J＝12.6,3.0Hz,1H),2.22(s,3H),2.20–2.12(m,1H),2.08(d,J＝24.1 Hz,1H),1.76–1.55(m,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ172.1,141.7,131.6, 128.8,128.1,65.4,62.3,52.8,51.3,42.1,34.1,33.5,26.0,25.3.

α-CCT：参照文献方法合成α-CCT粗品，并利用硅胶柱层析法初步纯化 (Xu L,etal.J.Heterocycl.Chem.1996,33:2037-2039)，产物再用石油醚重结晶两次，方法为将产物加于石油醚(10-15mL/g产物)中，于60℃加热，使样品溶解，冷却至室温，析出白色晶体，过滤出晶体。将晶体再同上方法重结晶一次，得白色α-CCT晶体。其结构验证有关数据如下：MS(ESI)m/z 294.25, 296.24.¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.19(dt,J＝10.9,5.7Hz,4H),3.53–3.45(m,3H),3.39(s,1H),3.22(s,1H),3.07(dt,J＝18.2,6.2Hz,2H),2.38(dd,J＝ 8.7,4.4Hz,3H),2.07(t,J＝11.1Hz,1H),1.95–1.87(m,2H),1.84–1.52(m,3H). ¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ173.2,142.3,132.0,129.1,128.5,63.6,61.1,51.5, 51.1,39.7,38.6,36.3,26.4,23.2.

β-CXCT：参照文献方法合成，产物再用甲醇-水溶液重结晶CXCT(Meegalla SK,etal.J.Med.Chem.1997,40:9-17)，得白色β-CXCT晶体。其结构验证有关数据如下：MS(ESI)m/z,280.25,282.21,¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ 7.33–7.27(m,3H),7.22–7.17(m,2H),3.60(d,J＝17.9Hz,2H),3.21–3.13(m, 1H),2.68(dd,J＝5.8,3.0Hz,1H),2.61(t,J＝13.6Hz,1H),2.54–2.51(m,3H), 2.36–2.26(m,2H),2.03–1.94(m,2H),1.82–1.74(m,2H).¹³C NMR(101MHz, CDCl₃)δ173.93,138.34,133.08,129.00,128.78,64.70,61.61,52.20,39.36,34.67, 34.29,25.54,24.53.

流动相制备：取500mL甲醇，加入0.5mL TFA，混匀后，用装有0.22μm 滤膜的过滤器过滤，得流动相A。再取500mL水，加入0.5mL TFA，混匀后，用装有0.22μm滤膜的过滤器过滤，得流动B。使用时按实施例中所述比例，将A、B两相混合均匀，即得相应的流动相。或将甲醇和水按比例混合，再加入酸性添加剂混合均匀，过滤，即得流动相。

一种同时测定2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷及其有关物质的方法，采用高效液相色谱法，所用的色谱柱为C18反相柱，流动相包括甲醇、水和酸性添加剂，甲醇、水和酸性添加剂的体积比为(25～40)：(60～75)：(0.05～1.5)；检测方法为紫外检测；所述有关物质为2α-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷和2β-羧基 -3β-(4-氯苯基)托品烷。

本发明的检测方法可使β-CXCT、β-CCT、α-CCT在相同HPLC条件下基线分离，同时对药物中间体β-CCT及其杂质(α-CCT和β-CXCT)含量进行分析。

紫外检测波长为200-230nm。精密称量β-CCT、α-CCT和β-CXCT，分别用甲醇溶解，配置成浓度分别为22μg/mL、8μg/mL、8μg/mL的溶液，将上述三种溶液分别在紫外分光光度计上进行200-400nm波长范围内扫描，如图1所示，在200～230nm范围内具有较大吸收，因此高效液相色谱仪的紫外检测波长设为 200～230nm。β-CCT在220nm有最大吸收，α-CCT和β-CXCT的最大吸收波长接近220nm，优选地高效液相色谱仪的紫外检测波长设为220nm。高效液相色谱法检测时，采用被测物有最大吸收的波长作为紫外检测波长，可以获得最好的检测灵敏度。

下述实施例中使用的甲醇、三氟乙酸、乙酸和甲酸均为色谱纯。

实施例1

采用β-CXCT、β-CCT、α-CCT配置成甲醇混合溶液，混合溶液中β-CXCT、β-CCT、α-CCT的浓度分别为42μg/mL、336μg/mL、66μg/mL。

将混合溶液在高效液相色谱仪上进行分离，色谱柱为C18柱(4.6mm×150 mm，5μm，

)，流动相为不同比例的甲醇-水-三氟乙酸的混合溶液，流速 1.0mL/min，检测波长为220nm，色谱柱温度设为30℃。

(1)流动相甲醇-水-三氟乙酸的比例为25:75:0.1(v/v/v)。如图2所示，β-CXCT、β-CCT、α-CCT的保留时间分别在5.9、11.3、18.4min，三者可以达到基线分离，不过β-CXCT的峰形偏宽。β-CCT与β-CXCT、α-CCT的分离度分别为4.1、8.3。

(2)当流动相甲醇-水-三氟乙酸的比例为30:70:0.1(v/v/v)时，如图3所示，β-CXCT、β-CCT、α-CCT的保留时间分别在7.4、11.1、20.2min，三者可以达到基线分离，峰形对称，分离度好。β-CCT与β-CXCT、α-CCT的分离度分别为5.9、9.8。

(3)当流动相甲醇-水-三氟乙酸的比例为35:65:0.1(v/v/v)时，如图4所示，β-CXCT、β-CCT、α-CCT的保留时间分别在5.1、7.1、11.7min，三者可以达到基线分离，峰形对称，分离度好。β-CCT与β-CXCT、α-CCT的分离度分别为3.5、6.5。

(4)当流动相甲醇-水-三氟乙酸的比例为40:60:0.1(v/v/v)时，如图5所示，β-CXCT、β-CCT、α-CCT的保留时间分别在3.8、4.8、7.1min，三者可以达到基线分离，但β-CXCT和β-CCT峰距离较近。β-CCT与β-CXCT、α-CCT 分离度分别为2.2、4.3。

实施例2专属性验证

为了考察本发明的方法用于β-CCT分析的专属性，即，验证本发明提供的方法能够分析出样品中可能存在的杂质，参照本专业常规采用的研究方法(即国际人用药品注册技术协调会(ICH)推荐方法)，对β-CCT纯品进行不同条件下的降解试验，分别在酸、碱、氧化、加热、光照条件下对样品进行处理。然后对试验后的样品进行高效液相色谱分析。

高效液相色谱分析条件为：色谱柱为C18柱(4.6mm×150mm，5μm，

)，流动相为甲醇-水-三氟乙酸(30:70:0.1，v/v/v)，流速1.0mL/min，紫外检测波长为220nm，色谱柱温度设为30℃。

酸性降解试验：称取2.0mgβ-CCT，加入100μL 0.10M HCl溶液，样品溶解后于室温下静置72小时，然后加入100μL0.10M的NaOH溶液中和，加入流动相4mL，混匀。用进样器取10μL样品溶液，注入HPLC分析。

碱性降解试验：称取2.0mgβ-CCT，加入100μL 0.10M的NaOH溶液，样品溶解后于室温下静置72小时，然后加入100μL 0.10M的HCl溶液中和，加入流动相4mL，混匀。

氧化试验：称取β-CCT 1.0mg，加3％的H₂O₂溶液0.1ml，静制72h后加流动相溶液4mL，混匀。

高温试验：取β-CCT固体1.0mg，置于药品稳定性试验箱中，温度设为 60℃，静置72小时，再加入流动相溶液2mL，混匀。

光照试验：取β-CCT固体1.0mg，静置于药品稳定性试验箱中，参照ICH 标准，在4500lx光照下照射10天，再加入流动相2mL，混匀。

将上述经酸、碱、氧化、加热、光照条件下处理过的样品溶液，分别进行 HPLC分析，进样量为10μL，各样品的检测结果与各自的空白溶剂(空白溶剂是指不加入β-CCT，其余处理条件(酸、碱、氧化、加热、光照处理条件)相同的溶剂)对照。结果如图6、图7所示，β-CCT在碱性条件和氧化条件处理后，出现杂质峰(图6中A、B)，空白溶剂对照未出现溶剂之外的吸收峰(图 7中A₀，B₀)。β-CCT在酸、加热、光照条件下稳定(如图6中C、D、E)，未见杂质峰，β-CCT样品回收率接近100％，相应的空白对照未见溶剂峰之外的吸收峰(图7中C₀，D₀，E₀)。

β-CCT在碱性条件下，出现少量降解产物峰，其保留时间与β-CXCT一致，如图8所示。收集该峰组份，进行质谱分析，采用的离子源为电喷雾离子源 (ESI)，测得其m/z(质荷比)值中含有280.2和282.2，与β-CXCT(理论M+H⁺值为280.2和282.2)一致。将β-CXCT纯品与碱性条件下降解产物混合，然后进行HPLC分析，降解产物对应的色谱峰变大，且未出现新峰，如图9所示。以上结果表明，β-CCT在碱性条件下的降解产物是β-CXCT。表明本方法不仅能分析出β-CCT的是否含有潜在杂质(降解产物一般是原料的潜在杂质)，还能对分析杂质的化学结构有启示作用。

β-CCT在氧化条件下，有明显的降解产物峰，其保留时间与β-CXCT一致如图10所示。收集该峰组份，进行质谱分析，其m/z值中含有280.2和282.2，与β-CXCT(理论M+H⁺值为280.2和282.2)一致。为进一步验证降解产物结构，将β-CXCT与氧化条件下的降解产物混合，然后进行HPLC分析，发现降解产物对应的色谱峰变大，且未出现新峰如图11所示。以上结果表明，β-CCT 在氧化条件下的降解产物是β-CXCT。表明本方法不仅能分析出β-CCT的是否含有潜在杂质(降解产物一般是原料的潜在杂质)，还能对分析杂质的化学结构有启示作用。

实施例3最低定量限

最低定量限度是指色谱峰信值号为噪音10倍时的样品浓度。首先分别配制1.0mg/mL的β-CCT、β-CXCT和α-CCT的甲醇标准溶液，然后稀释成不同浓度的样品溶液，注入HPLC分析，色谱柱为C18柱(4.6mm×150mm，5μm，

)，以甲醇-水-三氟乙酸的比例为30:70:0.1(v/v/v)为流动相，流速1.0 ml/mL，记录色谱图，直到样品峰高度为噪音的10倍，此浓度即为最低定量限。结果在β-CCT、β-CXCT和α-CCT的最低定量限分别为1.5μg/mL,1.2μg/mL和 1.5μg/mL。在最低定量限以上的浓度都可以准确测定，本发明的最低定量限较低，说明即使杂质含量较少时也可准确测定其含量。

实施例4稳定性试验

分别对β-CCT(0.3mg/mL)、β-CXCT(6μg/mL)和α-CCT(6μg/mL)的甲醇溶液在室温下储存0，4，8，12，24，36，72h，分别进行HPLC分析。分析其峰面积，保留时间和拖尾因子，结果表明在72小时内，峰面积，保留时间和拖尾因子均无显著变化。这些实验结果验证了样品溶液在室温下的稳定时间至少72小时。表明本方法采用甲醇溶解样品，可以满足药物生产过程中对β-CCT 的有关物质分析的稳定性要求。

实施例5

本实施例提供了一种2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷及其相关物质的含量分析方法，包括：

(1)分别获取β-CCT、β-CXCT和α-CCT的浓度-峰面积标准曲线方程：

以最低定量限为最低浓度，分别配制6个不同浓度的β-CCT、β-CXCT和α-CCT甲醇溶液。β-CCT的浓度分别为1.5μg/mL、50μg/mL、150μg/mL、 250μg/mL、350μg/mL、450μg/mL，β-CXCT的浓度分别为1.2μg/mL，5.5μg/mL、 7.5μg/mL、9.5μg/mL、13.5μg/mL、15μg/mL，α-CCT的浓度分别1.5μg/mL， 5.5μg/mL、7.5μg/mL、9.5μg/mL、13.5μg/mL、15μg/mL。各浓度的样品分别进行HPLC分析，进样量为10μL，色谱柱为C18柱(4.6mm×150mm，5μm，

)，流动相为甲醇-水-三氟乙酸(30:70:0.1，v/v/v)，检测波长为220nm，柱温30℃。记录色谱图，以峰面积为纵坐标，样品浓度为横坐标，对数据进行线性回归分析，所得曲线方程即为标准曲线方程。结果β-CCT的标准曲线方程为 y＝19735x–4631，相关系数r＝0.9999；β-CXCT的标准曲线方程y＝22919x+2283，相关系数r＝0.9997；α-CCT的标准曲线方程y＝23268x–6681，相关系数r＝0.9997。

(2)取根据文献方法(Xu L,et al.J.Heterocycl.Chem.1996,33:2037-2039) 合成的β-CCT样品5批次。第1、2批次没有进行过重结晶纯化，第3、4批次进行重结晶纯化，方法为：将产物加于石油醚中(5-10mL/g产物)，于60℃加热，使样品溶解，冷却至室温，析出白色晶体，过滤出晶体，将晶体再同上方法重结晶一次，得白色针状β-CCT晶体。第5批次样品在如上所述重结晶两次后，于室温中放置2.5年。将五批样品分别精密称重，用甲醇配制成样品浓度为300μg/mL的溶液，各批样品分别进行HPLC分析，进样量为10μL，色谱柱为C18柱(4.6mm×150mm，5μm，

)，流动相为甲醇-水-三氟乙酸 (30:70:0.1，v/v/v)，检测波长为220nm，柱温30℃。记录色谱图。分别将β-CCT、β-CXCT和α-CCT的峰面积代入各自的标准曲线方程，计算出β-CCT、β-CXCT 和α-CCT的浓度，再换算成百分含量(计算公式为：测定的样品浓度/称重配制的样品浓度×100％)。结果如表1所示。五批样品中批次1、2中分别含有0.59％和0.66％的α-CCT，但不含有β-CXCT；批次3、4未检测到β-CXCT和α-CCT，也未见有其它杂质，纯度高。批次5中含有0.15％的氧化产物β-CXCT，表明β-CCT在长期存放过程中应在避免接触空气，宜在密封条件下室温或低温储存。

表1.β-CCT含量及有关物质分析结果

注：-为未检测到有关物质

对比例1

采用不同比例甲醇和水为流动相(不含三氟乙酸)，对β-CXCT、β-CCT、α-CCT进行分析，方法与结果如下。

采用β-CXCT、β-CCT、α-CCT纯品配置成甲醇混合溶液，混合溶液中β-CXCT、β-CCT、α-CCT的浓度分别为300μg/mL、360μg/mL、340μg/mL。将混合溶液在高效液相色谱仪上进行分离，色谱柱为C18柱(4.6mm×150mm， 5μm，

)，流动相为不同比例的甲醇-水，流速1.0mL/min，检测波长为220 nm，色谱柱温度设为30℃。

(1)流动相甲醇-水比例为25:75(v/v)时，如图12中A所示，色谱峰互相重叠，分离效果差。

(2)流动相甲醇-水比例为30:70(v/v)时。如图12中B所示，色谱峰互相重叠，分离效果差。

(3)流动相甲醇-水比例为35:65(v/v)时，如图12中C所示，色谱峰的保留时间小于10min，并且互相重叠，分离效果差。

(4)流动相甲醇-水比例为40:60(v/v)时，如图12中D所示，互相重叠，分离效果差。

对比例2

采用不同比例甲醇-水-三乙胺为流动相，对β-CXCT、β-CCT、α-CCT进行分析，方法与结果如下。

采用β-CXCT、β-CCT、α-CCT纯品配置成甲醇混合溶液，混合溶液中β-CXCT、β-CCT、α-CCT的浓度分别为300μg/mL、360μg/mL、340μg/mL。将混合溶液在高效液相色谱仪上进行分离，色谱柱为C18柱(4.6mm×150 mm，5μm，

)，流动相为不同比例的甲醇-水-三乙胺，流速1.0mL/min，检测波长为220nm，色谱柱温度设为30℃。

(1)流动相甲醇-水-三乙胺比例为30:70:0.1(v/v/v)时，如图13中A所示，在保留时间2min，9.2min出现两个信号峰，但14.6min附近呈现倒峰，不利于分析检测。

(2)流动相甲醇-水-三乙胺比例为35:65:0.1(v/v/v)时，如图13中B所示，在保留时间2min，9.2min分别出现信号峰，在14.2min附近呈现倒峰，不利于分析检测。

(3)流动相甲醇-水-三乙胺比例为40:60:0.1(v/v/v)时，如图13中C所示，在保留时2min，5min分别出现信号峰，但在9.2-10.5min之间出现倒峰信号，不利于分析检测。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种同时测定2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷及其有关物质的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，所用的色谱柱为C18反相柱，流动相包括甲醇、水和酸性添加剂，甲醇、水和酸性添加剂的体积比为(25～40)：(60～75)：(0.05～1.5)；洗脱方式为等度洗脱；

检测方法为紫外检测；

所述有关物质为2α-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷和2β-羧基-3β-(4-氯苯基)托品烷。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，甲醇和水和酸性添加剂的体积比为(30～35)：(65～70)：(0.05～1.5)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸性添加剂为三氟乙酸、乙酸和甲酸中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，甲醇、水和酸性添加剂的体积比为30:70:0.1。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述紫外检测波长为200-230nm。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述紫外检测波长为220nm。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.5～1.5mL/min，优选为1.0mL/min。

8.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，色谱柱温度为25～45℃。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，色谱柱温度为30℃。

10.一种2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷及其相关物质的含量分析方法，其特征在于，包括：

(1)采用权利要求1-9任一项所述的方法分别获取2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷、2α-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷和2β-羧基-3β-(4-氯苯基)托品烷的浓度-峰面积标准曲线方程；

(2)检测样品，将样品的2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷、2α-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷和2β-羧基-3β-(4-氯苯基)托品烷的峰面积分别代入对应的浓度-峰面积标准曲线方程，获得各成分的浓度；

计算得到样品中2β-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷、2α-甲酯基-3β-(4-氯苯基)托品烷和2β-羧基-3β-(4-氯苯基)托品烷的含量。

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