CN114456184B - 一种3-芳基异喹啉衍生物及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种3‑芳基异喹啉衍生物及其制备与应用。本发明3‑芳基异喹啉衍生物以6‑溴藜芦醛类化合物为起始原料，经过Sonogashira偶联、wittig反应、水解反应、还原胺化、上Boc、亲核取代反应、硝酸银催化的异喹啉合环以及脱Boc反应合成得到。本发明所制备的芳基异喹啉衍生物具有拓扑酶Ⅰ和拓扑酶Ⅱ抑制作用，同时具备良好的抗肝癌活性，阻滞细胞周期在G2/M期，通过抑制MMP‑9的表达抑制细胞侵袭和迁移，通过抑制PI3K/Akt/mTOR途径诱导细胞凋亡。明显抑制裸鼠异种移植肿瘤的生长且具有良好的药代动力学性能，可应用于制备肝癌治疗药物。

Description

一种3-芳基异喹啉衍生物及其制备与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种苯3-芳基异喹啉衍生物的制备；本发明同时还涉及3-芳基异喹啉衍生物在制备抗肝癌药物中的应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康的主要疾病之一，其死亡率仅次于心脑血管疾病。2020年全球癌症统计数据显示，肝癌在最普遍的癌症中排名第六(4.7%)，在癌症致死率中排名第三(8.3%)，5年生存率较低，为18%。且自1990年以来，全球肝癌发病率和死亡率一直在上升。其中原发性肝癌（HCC）占90%。在肝癌化疗方面，索拉非尼是全球首个获批的多靶点抗癌药物，也是治疗肝癌的一线药物。此外，几种酪氨酸激酶抑制剂也被用于治疗肝癌。近年来，联合策略(即阿替利珠单抗加贝伐单抗)已成为肝癌治疗的新的金标准。这些药物导致患者的临床给药顺序和不良反应的处理变得更加复杂。因此，研究开发抗肝癌药物仍是当务之急。
研究表明，拓扑酶基因在肝癌组织中高表达，这与肝癌的发生和发展密切相关。拓扑异构酶控制着DNA的拓扑状态，在各种细胞过程中都是必不可少的，在维持基因组稳定性和基因组的完整性方面也是必不可少的。哺乳动物细胞中存在拓扑异构酶I和拓扑异构酶II两种拓扑异构酶，拓扑异构酶II（TOP2）在哺乳动物细胞中又分为TOP 2α和TOP 2β。核拓扑异构酶I (TOP I)负责切割单链DNA。TOP 2α的表达是周期依赖性的，在S期增加，在G2/M期达到峰值，并且，拓扑异构酶II在复制过程中协助DNA双链的解链。由于癌细胞比正常细胞具有更高的复制率，相应地，拓扑酶在癌细胞中的活性也随之增加，拓扑酶已成为人类恶性肿瘤的重要药物靶点。拓扑酶抑制剂是迄今为止最有效的抗癌药物之一。代表性的拓扑异构酶I和拓扑异构酶II抑制剂分别是喜树碱衍生物和依托泊苷。这些药物具有很高的疗效，但它们可能导致肿瘤多药耐药，并经常产生危及生命的毒性作用，这些均限制了它们的应用。令人惊讶的是，研究表明TOP I和TOP2α的表达呈现代偿性效应。基于此，开发用于癌症治疗的拓扑异构酶I和拓扑异构酶II双抑制剂是必不可少的，这也为抗肝癌药物的研究提供了新的思路。
几个世纪以来，天然产物一直是生物活性分子的丰富来源。其中生物碱作为植物重要的次生代谢物，作为药物已使用数千年。在众多的生物碱中，结构多样的异喹啉生物碱是分布最广泛的类群，目前已知的异喹啉生物碱有4000多种。对于大多数异喹啉类生物碱而言，其主要药理作用体现在以下三个方面:抗肿瘤、抗微生物和参与信号分子的调控。研究证实，小檗碱等生物碱通过抑制DNA拓扑异构酶等靶点，显示细胞毒性，诱导细胞凋亡，从而达到抗肿瘤的目的。已有研究表明小檗碱类似物是拓扑异构酶I和拓扑异构酶II的双抑制剂，且在细胞水平上也表现出良好的毒性。同时，文献报道结构不同与本文的3-芳基异喹啉化合物具有拓扑异构酶I抑制。因此，以拓扑异构酶I和拓扑异构酶II为靶点，从3-芳基异喹啉类化合物中寻找抗肝癌药物是合理的。鉴于此，我们以刻叶紫堇胺，N-甲酰基刻叶紫堇胺，夏无碱，紫苏碱以及N-1作为基本骨架，通过合理修饰改造，设计合成了一系列3-芳基异喹啉衍生物，初步生物活性研究表明该类化合物具有良好的抗肝癌活性及拓扑酶（TOP I和TOP II）抑制活性，此外，体内实验表明化合物具有良好的药代动力学数据和抑制异种移植裸鼠肿瘤的生长。综上，以期找到能有效治疗肝癌的新型拓扑酶抑制剂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种3-芳基异喹啉衍生物及其制备方法；
本发明的另一个目的是提供3-芳基异喹啉衍生物在制备抗肝癌药物中的应用。
本发明一种3-芳基异喹啉色胺衍生物，其结构式为：
其中，R为甲胺，乙胺，甲基乙胺，甲基异丙胺，甲基丁胺，乙基乙胺，乙基异丙胺，乙基丁胺，杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，哌嗪，N-甲基哌嗪，N-乙基哌嗪，N-丙基哌嗪，N-异丙基哌嗪或N-羟乙基哌嗪。
本发明一种3-芳基异喹啉衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以6-溴藜芦醛和三甲基硅炔为原料，以碘化亚铜和四三苯基膦钯为催化剂，以四氢呋喃为溶剂，以三乙胺为碱和共溶剂，在氩气保护下，40~60 ℃下反应4~6 h，反应完成后，抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物1；
6-溴藜芦醛的结构式为：；
化合物1的结构式为：；
三甲基硅炔的用量为6-溴藜芦醛摩尔量的1.2~2.0倍；碘化亚铜的用量为6-溴藜芦醛摩尔量的0.1~0.2倍；四三苯基膦钯的用量为6-溴藜芦醛摩尔量的0.02~0.1倍。
（2）以化合物1和甲胺或乙胺为原料，以甲醇为溶剂，在氩气条件下，60~70 ℃下回流反应1~2 h，反应完成后，冷却至0 ℃，加入硼氢化钠，反应4~6 min，加入水淬灭，旋干溶剂，三氧化二铝碱性柱柱层析分离得到不稳定的中间体；将得到的中间体加入乙腈中，以三乙胺为碱，加入二碳酸二叔丁酯，室温反应4~6 min，旋干溶剂，柱层析得到化合物2；
化合物2的结构式为：，R2为甲基或乙基；
甲胺或乙胺的用量为化合物1摩尔量的5~10倍；硼氢化钠的用量为化合物1摩尔量的1.2~2.0倍；二碳酸二叔丁酯的用量为化合物1摩尔量的2.5~3.0倍。
（3）以化合物2和化合物3为原料，以三乙胺为碱和共溶剂，以碘化亚铜和四（三苯基膦）钯为催化剂，以四氢呋喃和乙腈为溶剂，在氩气保护下，80 ℃下反应4~6 h，反应完成后，抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物4；
化合物3的结构式为：；
化合物4的结构式为：，R2为甲基或乙基；
化合物2和化合物3的摩尔比为1：1.2~1：1.5；碘化亚铜的用量为化合物2摩尔量的0.1~0.2倍；四三苯基膦钯的用量为化合物2摩尔量的0.02~0.1倍。
化合物3的制备：以为原料，以二异丙基胺基锂为碱，以四氢呋喃为溶剂，在氩气条件下，于- 78 ℃反应1 h后，加入N,N-二甲基甲酰胺，于室温反应10~14 h，反应完成后，用饱和氯化铵淬灭，用乙酸乙酯萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物3；二异丙基胺基锂的用量为/>摩尔量的2.5~3.0倍；N,N-二甲基甲酰胺的用量为摩尔量的2.5~3.0倍。
（4）以化合物4为原料，以醋酸铵为氮源，以硝酸银为催化剂，以四氢呋喃和正丁醇为溶剂，在氩气保护下，25~35 ℃下反应4~6 h，反应完成后，加入碳酸氢钠固体淬灭反应，再搅拌0.5~1 h后，抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物5；
化合物5的结构式为：，R2为甲基或乙基；
醋酸铵的用量为化合物4摩尔量的2.5~3.0倍；硝酸银的用量为化合物4摩尔量的0.1~0.2倍。
（5）以化合物5为原料，以三氟甲磺酸三甲基硅酯为路易斯酸，以二氯甲烷为溶剂，在氩气条件下，于-40 ℃下反应10 min，再移至室温反应20~30 min，反应完成后，加入水淬灭反应，旋干溶剂，柱层析得到3-芳基异喹啉衍生物（二级胺）；
3-芳基异喹啉衍生物的结构式为：，R2为甲基或乙基；
三氟甲磺酸三甲基硅酯的用量为化合物5摩尔量的2.5~3.0倍。
（6）以上述得到的3-芳基异喹啉衍生物（二级胺）和卤代烷烃为原料，以碳酸钾为碱，以四丁基碘化胺为相转移催化剂，以乙腈为溶剂，在氩气条件下，于 60~120 ℃下反应6~18 h，反应完成后，抽滤，旋干溶剂，柱层析得到3-芳基异喹啉衍生物（三级胺）；
3-芳基异喹啉衍生物的结构式为：；R1为甲基乙胺，甲基异丙胺，甲基丁胺，乙基乙胺，乙基异丙胺，乙基丁胺中的一种；
碳酸钾的用量为3-芳基异喹啉衍生物（二级胺）摩尔量的2.5~3.0倍；四丁基碘化胺的用量为3-芳基异喹啉衍生物（二级胺）摩尔量的0.2~0.5倍；卤代烷烃为碘乙烷，碘异丙烷，溴丁烷；卤代烷烃的用量为3-芳基异喹啉衍生物（二级胺）摩尔量的2.5~3.0倍。
合成路线如下：
其中，R1为甲基乙胺，甲基异丙胺，甲基丁胺，乙基乙胺，乙基异丙胺，乙基丁胺的一种；R2为甲基或乙基。
本发明一种3-芳基异喹啉衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以6-溴藜芦醛和三甲基硅炔为原料，以碘化亚铜和四三苯基膦钯为催化剂，以四氢呋喃为溶剂，以三乙胺为碱和共溶剂，在氩气保护下，40~60 ℃下反应4~6 h，反应完成后，抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物1；
6-溴藜芦醛的结构式为：；
化合物1的结构式为：；
三甲基硅炔的用量为6-溴藜芦醛摩尔量的1.2~2.0倍；碘化亚铜的用量为6-溴藜芦醛摩尔量的0.1~0.2倍；四三苯基膦钯的用量为6-溴藜芦醛摩尔量的0.02~0.1倍。
（2）以化合物1为原料，以硼氢化钠为还原剂，以甲醇为溶剂，在氩气条件下，0~4℃反应5~10 min，反应完成后，加水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取旋干，得到部分脱TMS保护基的混合物；将混合物加入四氢呋喃为中，加入四丁基氟化铵，加入四丁基氟化铵，室温反应5min，反应完成后，旋干溶剂，柱层析分离得到化合物6；
化合物6的结构式为：；
硼氢化钠的用量为化合物1摩尔量的1.2~2.0倍；四丁基氟化铵的用量为化合物1摩尔量的1.2~2.0倍。
（3）以化合物6和化合物3为原料，以三乙胺为碱和共溶剂，以碘化亚铜和四（三苯基膦）钯为催化剂，以四氢呋喃和乙腈为溶剂，在氩气保护下，80 ℃下反应4~6 h，反应完成后，抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到得到化合物7；
化合物3的结构式为：；
化合物7的结构式为：；
化合物3和化合物7的摩尔比为1：1.2~1：1.5；碘化亚铜的用量为化合物6摩尔量的0.1~0.2倍；四三苯基膦钯的用量为化合物6摩尔量的0.02~0.1倍。
（4）以化合物7和四溴化碳为原料，以二氯甲烷为溶剂，在氩气条件、0 ℃下加入三苯基膦，于室温下反应0.5~1 h，反应完成后，旋干溶剂，柱层析分离得到化合物8；
化合物8的结构式为：；
四溴化碳的用量为化合物7摩尔量的1.5~2.0倍；三苯基膦的用量为化合物7摩尔量的2.2~2.5倍。
（5）以化合物8和胺类化合物为原料，以三乙胺为碱，以四氢呋喃为溶剂，在氩气条件下，反应在25~45 ℃反应6~10 h，反应完成后，旋干溶剂，柱层析分离得到化合物9；
化合物9的结构式为：，R3为杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，哌嗪，N-甲基哌嗪，N-乙基哌嗪，N-丙基哌嗪，N-异丙基哌嗪，N-羟乙基哌嗪中的一种；
三乙胺的用量为化合物8摩尔量的3~5倍；胺类化合物为杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，哌嗪，N-甲基哌嗪，N-乙基哌嗪，N-丙基哌嗪，N-异丙基哌嗪，N-羟乙基哌嗪中的一种；胺类化合物的用量为化合物8摩尔量的2~4倍。
（6）以化合物9为原料，以醋酸铵为氮源，以硝酸银为催化剂，以四氢呋喃和正丁醇为溶剂，在氩气保护下，25~35 ℃下反应4~6 h，反应完成后，加入碳酸氢钠固体淬灭反应，再搅拌0.5~1 h后，抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到3-芳基异喹啉衍生物；
3-芳基异喹啉衍生物的结构式为：；R3为杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，哌嗪，N-甲基哌嗪，N-乙基哌嗪，N-丙基哌嗪，N-异丙基哌嗪，N-羟乙基哌嗪中的一种；
醋酸铵的用量为化合物9摩尔量的2.5~3.0倍；硝酸银的用量为化合物9摩尔量的0.1~0.2倍。
合成路线如下：
其中，R3为杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，哌嗪，N-甲基哌嗪，N-乙基哌嗪，N-丙基哌嗪，N-异丙基哌嗪，N-羟乙基哌嗪中的一种。
本发明还提供了一种上述3-芳基异喹啉衍生物在制备抗肝癌药物中的应用。本发明制备的化合物能够显著抑制拓扑异构酶I和拓扑异构酶Ⅱ的活性，能够呈浓度依赖地抑制肝癌LM9和HuH7细胞动态增殖，肝癌LM9和HuH7细胞克隆群落的形成和侵袭，能够诱导肝癌LM9和HuH7的凋亡。
综上所述，本发明3-芳基异喹啉衍生物以6-溴藜芦醛为起始原料，经过Sonogashira偶联、wittig反应、水解反应、还原胺化、上Boc、亲核取代反应、硝酸银催化的异喹啉合环以及脱Boc反应合成得到。本发明所制备的芳基异喹啉衍生物具有拓扑酶Ⅰ和拓扑酶Ⅱ抑制作用，同时具备良好的抗肝癌活性，阻滞细胞周期在G2/M期，通过抑制MMP-9的表达抑制细胞侵袭和迁移，通过抑制PI3K/Akt/mTOR途径诱导细胞凋亡。明显抑制裸鼠异种移植肿瘤的生长且具有良好的药代动力学性能，可应用于制备肝癌治疗药物。
附图说明
图1为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对拓扑异构酶Ⅰ抑制活性结果。
图2为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对拓扑异构酶Ⅱ抑制活性结果。
图3为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对拓扑异构酶Ⅰ机制的结果与化合物7对DNA损伤的影响。
图4为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌HuH7和LM9细胞EdU增殖的影响。
图5为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌HuH7和LM9细胞生长曲线和克隆的影响。
图6为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物在Transwell实验中对肝癌HuH7和LM9细胞迁移的影响。
图7为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物在Transwell实验中对肝癌HuH7和LM9细胞侵袭的影响。
图8为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌LM9细胞周期分布的影响。
图9为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌HuH7细胞周期分布的影响。
图10为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌HuH7和LM9细胞周期分布的柱状图。
图11为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌HuH7和LM9细胞Hoechst染色的情况。
图12为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌LM9细胞凋亡情况。
图13为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌HuH7细胞凋亡情况。
图14为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌LM9细胞线粒体膜（TMRE）电位的影响。
图15为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌HuH7细胞线粒体膜电位（TMRE）的影响。
图16为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌LM9细胞活性氧（ROS）电位的影响。
图17为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌HuH7细胞活性氧（ROS）的影响。
图18为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌HuH7和LM9细胞凋亡相关蛋白cleaved-casepase-3、cleaved-casepase-9、 Bcl-2、 Bax 和 Cytochrome c表达的影响。
图19为本发明制备3-芳基异喹啉衍生物对肝癌HuH7和LM9细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1
N-((6-([1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinolin-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)ethanamine (化合物C-01)
化合物C-01的结构式为：
（1）将6-bromobenzo[d][1,3]dioxole-5-carbaldehyde（21.83 mmol），碘化亚铜（2.2 mmol）和四三苯基膦钯（0.44 mmol）加入250 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入60mL干燥的四氢呋喃和21 mL干燥的三乙胺后，滴加三甲基硅炔（28.38 mmol），加热到50 ℃反应6 h。经TLC监测反应完成后，用砂芯漏斗抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物2-((trimethylsilyl)ethynyl)benzaldehyde (化合物1)，产率为98%。
（2）以2-((trimethylsilyl)ethynyl)benzaldehyde (化合物1)（3.26 mmol）置于50 mL圆底烧瓶，加入甲醇（8 mL）溶解，加入乙胺（7 mL，30%的醇溶液）置换氩气，加热回流2h，反应完成后，冷却至0 ℃，加入硼氢化钠（6.52 mmol），反应5 min，反应完成后，缓慢加入水淬灭，旋干溶剂，三氧化二铝碱性柱柱层析分离得到不稳定的中间体；得到的中间体（1.95 mmol）置于50 mL圆底烧瓶，加入乙腈（10 mL）溶解，加入三乙胺（5.85 mmol）和加入二碳酸二叔丁酯（3.9 mmol），置换氩气，室温反应5 min，旋干溶剂，柱层析得到化合物tert-butyl ethyl((6-ethynylbenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)carbamate（化合物2）。
（3）将tert-butyl ethyl((6-ethynylbenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)carbamate（24.90 mmol）置于100 mL圆底烧瓶，加入25 mL四氢呋喃溶解并置换氩气，置于-78 °C缓慢滴入二异丙基胺基锂（16.2 mL）反应1 h。加入N,N-二甲基甲酰胺（4.6 mL）后移至室温反应过夜。经TLC监测反应完成后，缓慢加入饱和氯化铵淬灭，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物5-bromobenzo[d][1,3]dioxole-4-carbaldehyde(化合物3)。
（4）将化合物2（1.95 mmol），化合物3（2.15 mmol），碘化亚铜（0.39 mmol），四三苯基膦钯（0.20 mmol）置于50 mL圆底烧瓶，并置换成氩气，加入8 mL乙腈，3 mL四氢呋喃，3mL三乙胺，反应加热至80℃反应8 h。经TLC监测反应完成后，用砂芯漏斗抽滤，收集有机相旋干，柱层析得到化合物tert-butyl ethyl((6-((4-formylbenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethynyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)carbamate（化合物4）。
（5）将化合物4（1.60 mmol），硝酸银（0.32 mmol），醋酸铵（4.8 mmol）置于50 mL圆底烧瓶，并置换成氩气，加入8 mL四氢呋喃和4 mL正丁醇。反应6 h，经TLC监测反应完成后加入碳酸氢钠固体（4.8 mmol）继续搅拌1 h，反应完成后，用砂芯漏斗抽滤，收集有机相旋干，柱层析得到化合物tert-butyl ((6-([1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinolin-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)(ethyl)carbamate（化合物5）。
（6）将化合物5（1.44 mmol）置于50 mL圆底烧瓶，并置换成氩气，加入14 mL二氯甲烷溶解，反应置于- 40 ℃逐滴加入三氟甲磺酸三甲基硅酯（0.56 mL），低温反应10 min后移至室温反应20 min，经TLC监测反应完成后，旋干溶剂，柱层析得到化合物N-((6-([1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinolin-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)ethanamine (化合物C-01)，总产率26.85%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.30 (s, 1H), 7.74 (s, 1H),7.39 (s, 2H), 6.99 (s, 2H), 6.25 (s, 2H), 5.99 (s, 2H), 3.64 (s, 2H), 2.61(q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.30 (s, 1H), 1.09 (t, J = 7.1 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz,CDCl3) δ 150.93, 147.49, 146.60, 144.76, 144.67, 141.79, 134.36, 132.74,132.19, 120.49, 120.16, 115.16, 113.93, 110.59, 110.28, 102.54, 101.20,51.89, 43.45, 15.28.
实施例2
1-(6-([1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinolin-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-methylmethanamine (化合物C-02).
化合物C-02的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的乙胺替换为甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率35.80%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.33 (s, 1H), 9.10 (s, 1H), 8.17 (s, 1H),7.71 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.24 (s,1H), 6.37 (s, 2H), 6.16 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 2.65 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz,DMSO-d 6) δ 148.52, 148.39, 147.30, 144.99, 144.31, 141.35, 135.07, 131.97,123.94, 121.33, 120.75, 116.17, 113.17, 112.78, 110.03, 102.98, 102.03,50.70, 32.13.
实施例3
N-((6-([1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinolin-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)-N-methylethanamine (化合物C-03).
化合物C-03的结构式为：
将实施例1中得到的化合物C-02（0.14 mmol），碳酸钾（0.45 mmol），四丁基碘化胺（0.01 mmol），碘已烷（0.45 mmol）置于25 mL封管中，加入乙腈（5 mL），置换成氩气，反应在封管里在60 ℃反应12h，经TLC监测反应完成后，用砂芯漏斗抽滤，旋干溶剂，柱层析得到化合物C-03，收率80%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.32 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.72(d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.24 (s, 1H),6.38 (s, 2H), 6.16 (s, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.03 (s, 2H), 2.60 (s, 3H), 1.21(d, J = 7.6 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6) δ 148.44, 148.30, 147.43,145.01, 144.14, 141.35, 135.01, 131.92, 121.28, 121.05, 116.23, 113.14,112.59, 110.23, 102.97, 101.99, 57.25, 50.26, 9.65.
实施例4
N-((6-([1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinolin-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)-N-methylpropan-2-amine (化合物C-04).
化合物C-04的结构式为：
将实施例3中C-02（0.14 mmol）替换为化合物C-02（0.15 mmol），碘乙烷替换为2-碘异丙烷，其余步骤同实施例3制备而得，收率80%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.34(s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.8 Hz, 1H),7.43 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 6.40 (s, 2H), 6.19 (s, 2H), 4.28 – 4.07 (m, 2H),3.72 (s, 1H), 2.67 (s, 3H), 1.45 – 1.33 (m, 3H), 1.29 – 1.24 (m, 3H).13C NMR(101 MHz, DMSO-d 6) δ 148.83, 148.17, 147.58, 145.19, 144.12, 141.40, 135.16,132.06, 122.58, 121.45, 116.53, 113.48, 113.16, 110.46, 103.10, 102.24,55.95, 55.05, 33.59, 17.71, 14.86.
实施例5
N-((6-([1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinolin-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)-N-methylbutan-1-amine (化合物C-05).
化合物C-05的结构式为：
将实施例3步骤中的原料碘乙烷替换为溴丁烷，其余步骤同实施例3制备而得，收率72%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.34 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.43 (d, J = 9.8Hz, 3H), 6.96 (s, 1H), 6.25 (s, 2H), 6.04 (s, 2H), 4.33 – 4.13 (m, 2H), 3.13(s, 2H), 2.80 (s, 3H), 1.65 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 1.32 (q, J = 7.5 Hz, 2H),0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 149.08, 148.75, 148.13,145.37, 144.87, 141.98, 135.32, 132.12, 121.25, 120.76, 116.07, 113.78,112.92, 110.41, 102.86, 101.96, 57.69, 55.19, 39.19, 26.83, 20.01, 13.67.
实施例6
N-((6-([1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinolin-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)-N-ethylethanamine (化合物C-06).
化合物C-06的结构式为：
将实施例3步骤中的原料C-02替换为化合物C-01，其余步骤同实施例3制备而得，收率80%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.40 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.74 (d, J =8.7 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 6.40 (s,2H), 6.19 (s, 2H), 4.28 – 4.19 (m, 2H), 3.26 – 3.11 (m, 4H), 1.23 (s, 3H),1.21 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6) δ 148.78, 148.13, 147.65, 145.17,144.24, 141.46, 135.14, 132.05, 122.51, 121.43, 116.50, 113.17, 113.11,110.53, 103.09, 102.23, 54.28, 46.21, 45.74, 18.76, 8.67.
实施例7
N-((6-([1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinolin-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)-N-ethylpropan-2-amine (化合物C-07).
化合物C-07的结构式为：
将实施例3步骤中的原料C-02替换为化合物C-01，碘乙烷替换为2-碘异丙烷，其余步骤同实施例3制备而得，收率80%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.32 (s, 1H), 7.80 (s,1H), 7.63 (s, 1H), 7.49 (s, 2H), 7.04 (s, 1H), 6.30 (s, 2H), 6.08 (s, 2H),4.40 (d, J = 29.1 Hz, 2H), 3.76 (s, 1H), 3.29 (s, 2H), 1.41 (s, 6H), 1.32 (t,J = 6.5 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 149.28, 149.07, 148.62, 145.66,144.47, 142.11, 135.19, 132.29, 121.83, 121.76, 120.93, 116.44, 113.94,113.45, 110.81, 103.03, 102.19, 53.63, 51.97, 44.01, 17.48, 16.80, 11.38.
实施例8
N-((6-([1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinolin-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)-N-ethylbutan-1-amine (化合物C-08).
化合物C-08的结构式为：
将实施例3步骤中的原料化合物C-02替换为化合物C-01，碘乙烷替换为溴丁烷，其余步骤同实施例3制备而得，收率72%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.28 (s, 1H), 7.86(s, 1H), 7.51 (s, 2H), 7.19 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.31 (s, 2H), 6.10 (s,2H), 4.24 (s, 2H), 3.42 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.36 – 3.21 (m, 2H), 1.81 – 1.57(m, 4H), 1.38 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 0.89 (d, J = 7.3 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz,CDCl3) δ 149.68, 148.61, 148.31, 145.93, 144.36, 142.33, 134.86, 132.38,121.89, 121.83, 121.05, 116.83, 113.98, 113.74, 110.92, 103.19, 102.36,56.60, 51.24, 47.27, 26.53, 19.91, 13.53, 9.92.
实施例9
7-(6-(azetidin-1-ylmethyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-[1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinoline (化合物C-09).
化合物C-09的结构式为：
（1）将6-bromobenzo[d][1,3]dioxole-5-carbaldehyde（21.83 mmol），碘化亚铜（2.2 mmol）和四三苯基膦钯（0.44 mmol）加入250 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入60mL干燥的四氢呋喃和21 mL干燥的三乙胺后，滴加三甲基硅炔（28.38 mmol），加热到50 ℃反应6 h。经TLC监测反应完成后，用砂芯漏斗抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物2-((trimethylsilyl)ethynyl)benzaldehyde (化合物1)，产率为98%。
（2）将化合物1（2.0 mmol）置于50 mL圆底烧瓶中，加入15 mL甲醇为溶剂，反应置于0 ℃，缓慢硼氢化钠（2.4 mmol）为还原剂，在氩气条件下，反应5~10 min，经TLC监测反应完成后，加水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取旋干，得到部分脱TMS保护基的混合物；将混合物加入15 mL四氢呋喃中溶解，加入四丁基氟化铵（2.4 mmol），室温反应5 min，经TLC监测反应完成后，旋干溶剂，柱层析分离得到产物(6-ethynylbenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methanol（化合物6），产率为80%。
（3）将化合物6（2.0 mmol）和化合物3（2.4 mmol），碘化亚铜（0.4 mmol）和四（三苯基膦）钯（0.2 mmol）为催化剂，加入10 mL三乙胺作为碱和共溶剂，加入10 mL四氢呋喃和16mL乙腈为溶剂，在氩气保护下，80 ℃下反应4~6 h，经TLC监测反应完成后，抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到得到产物5-((6-(hydroxymethyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethynyl)benzo[d][1,3]dioxole-4-carbaldehyde（化合物7），产率为80%。
（4）将化合物7（2.0 mmol）置于50 mL圆底烧瓶中，加入15 mL二氯甲烷溶解，反应置于0 ℃，缓慢加入四溴化碳（3.0 mmol），再加入三苯基膦（5.0 mmol），并置换成氩气，反应移至室温继续反应0.5 h，经TLC监测反应完成后，旋干溶剂，柱层析得到5-((6-(bromomethyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethynyl)benzo[d][1,3]dioxole-4-carbaldehyde（化合物8）。
（5）将化合物8（0.2 mmol）置于25 mL圆底烧瓶中，加入5 mL四氢呋喃溶解，再加入三乙胺（0.6 mmol）和杂氮环丁胺（0.6 mmol），并置换成氩气，反应加热到45 ℃反应8h，经TLC监测反应完成后，旋干溶剂，柱层析得到化合物9。
（6）将化合物9（0.5 mmol）置于圆底烧瓶中，加入醋酸铵（1.5 mmol），硝酸银（0.05mmol），加入5 mL四氢呋喃和3 mL正丁醇，并置换成氩气，25~35 ℃下反应4~6 h，反应完成后，加入碳酸氢钠固体（1.5 mmol）淬灭反应，再搅拌0.5~1 h后，抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到3-芳基异喹啉衍生物，总收率24.6%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.42 (s,1H), 7.73 (s, 1H), 7.43 (d, J = 13.8 Hz, 3H), 6.99 (s, 1H), 6.29 (s, 2H),6.06 (s, 2H), 4.35 (s, 2H), 4.18 (s, 4H), 1.24 (s, 2H).13C NMR (101 MHz,methanol-d 4) δ 151.00, 150.04, 149.70, 147.12, 145.93, 143.39, 136.72,133.90, 123.41, 122.47, 122.30, 117.33, 115.22, 113.59, 111.71, 104.53,103.72, 58.83, 54.52, 16.85.
实施例10
7-(6-(pyrrolidin-1-ylmethyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-[1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinoline (化合物C-10).
化合物C-10的结构式为：
将实施例9步骤中的氮杂环丁胺替换为四氢吡咯，其余步骤同实施例9制备而得，收率28%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.44 (s, 1H), 8.23 (d, J = 1.1 Hz, 1H),7.73 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 6.39 (s,2H), 6.18 (s, 2H), 4.29 – 4.15 (m, 4H), 3.56 (s, 0H), 3.19 (s, 3H), 2.10 –1.99 (m, 8H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6) δ 149.07, 148.67, 147.96, 145.49,145.03, 141.83, 135.38, 132.39, 124.02, 121.81, 121.47, 116.71, 113.55,113.00, 110.57, 103.42, 102.56, 57.04, 53.18, 23.31.
实施例11
7-(6-(piperidin-1-ylmethyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-[1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinoline (化合物C-11).
化合物C-11的结构式为：
将实施例9步骤中的氮杂环丁胺替换为哌啶，其余步骤同实施例9制备而得，收率28%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.25 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.47(s, 2H), 7.01 (s, 1H), 6.29 (s, 2H), 6.05 (s, 2H), 4.46 (s, 2H), 3.30 (s,4H), 1.89 (dd, J = 38.9, 20.9 Hz, 6H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 149.38,149.17, 148.44, 145.57, 144.52, 142.01, 135.74, 132.25, 121.62, 120.92,116.22, 113.90, 113.59, 110.56, 102.95, 102.06, 57.61, 51.72, 23.62, 21.99.
实施例12
7-(6-(azepan-1-ylmethyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-[1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinoline (化合物C-12).
化合物C-12的结构式为：
将实施例9步骤中的氮杂环丁胺替换为环己亚胺，其余步骤同实施例9制备而得，收率28%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.26 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.71 (s, 1H),7.49 (s, 2H), 7.02 (s, 1H), 6.31 (s, 2H), 6.07 (s, 2H), 4.51 (s, 2H), 3.57(s, 2H), 3.42 (s, 2H), 1.92 (s, 4H), 1.74 (s, 4H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ149.26, 149.22, 148.52, 145.59, 144.41, 141.99, 135.31, 132.28, 122.39,121.79, 120.95, 116.38, 113.85, 113.72, 110.51, 102.98, 102.13, 58.28, 53.01,26.76, 24.47.
实施例13
7-(6-(morpholinomethyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-[1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinoline (化合物C-13).
化合物C-13的结构式为：
将实施例9步骤中的氮杂环丁胺替换为吗啉，其余步骤同实施例9制备而得，收率28%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.33 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.40 (d, J = 8.6 Hz,1H), 7.37 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.07 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.25 (s, 2H), 6.00(s, 2H), 3.63 (s, 4H), 3.48 (s, 2H), 2.37 (s, 4H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ150.39, 147.34, 146.67, 144.94, 144.64, 141.80, 135.08, 131.97, 120.70,120.39, 115.14, 113.85, 110.41, 110.28, 102.53, 101.20, 67.06, 60.24, 53.19.
实施例14
7-(6-(piperazin-1-ylmethyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-[1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinoline (化合物C-14).
化合物C-14的结构式为：
将实施例9步骤中的氮杂环丁胺替换为哌嗪，其余步骤同实施例9制备而得，收率28%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.27 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.42 (d, J = 8.6 Hz,1H), 7.40 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.03 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.26 (s, 2H), 6.02(s, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.04 (s, 4H), 2.67 (s, 4H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ149.81, 147.72, 147.49, 145.06, 144.82, 141.95, 135.00, 132.02, 120.89,120.58, 115.65, 113.86, 110.83, 110.56, 102.72, 101.52, 59.65, 50.60, 44.68.
实施例15
1-((6-(2,3-dihydro-1H-cyclopenta[a]naphthalen-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)-4-methylpiperazine (化合物C-15).
化合物C-15的结构式为：
将实施例9步骤中的氮杂环丁胺替换为N-甲基哌嗪，其余步骤同实施例9制备而得，收率28%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.30 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.39 (d, J =8.6 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.25 (s,2H), 5.99 (s, 2H), 3.59 (s, 2H), 2.87 – 2.49 (m, 8H), 2.46 (s, 3H).13C NMR(101 MHz, CDCl3) δ 150.14, 147.47, 146.85, 144.98, 144.74, 141.81, 135.07,131.90, 120.58, 120.38, 115.22, 113.83, 110.35, 110.06, 102.55, 101.26,58.90, 54.07, 50.60, 44.46.
实施例16
7-(6-((4-ethylpiperazin-1-yl)methyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-[1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinoline (化合物C-16).
化合物C-16的结构式为：
将实施例9步骤中的氮杂环丁胺替换为N-乙基哌嗪，其余步骤同实施例9制备而得，收率28%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.31 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.40 (d, J =8.6 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.05 (s, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.26 (s,2H), 6.00 (s, 2H), 3.57 (s, 2H), 2.67 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 2.56 (s, 4H), 1.94(s, 2H), 1.16 (t, J = 7.3 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 150.21, 147.45,146.78, 145.01, 144.73, 141.83, 135.06, 131.93, 120.62, 120.40, 115.22,113.86, 110.38, 110.06, 102.56, 101.25, 59.07, 51.87, 51.80, 50.75, 10.39.
实施例17
7-(6-((4-propylpiperazin-1-yl)methyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-[1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinoline (化合物C-17).
化合物C-17的结构式为：
将实施例9步骤中的氮杂环丁胺替换为N-丙基哌嗪，其余步骤同实施例9制备而得，收率28%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.32 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.40 (d, J =8.6 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.26 (s,2H), 5.99 (s, 2H), 3.47 (s, 2H), 2.69 – 2.21 (m, 10H), 1.51 (q, J = 7.8 Hz,2H), 0.88 (t, J = 7.4 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 150.31, 147.30,146.66, 144.97, 144.61, 141.78, 135.16, 132.00, 120.87, 120.46, 115.09,113.86, 110.38, 102.51, 101.18, 60.53, 59.75, 53.18, 52.27, 29.74, 19.73,11.93.
实施例18
7-(6-((4-isopropylpiperazin-1-yl)methyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-[1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinoline (化合物C-18).
化合物C-18的结构式为：
将实施例9步骤中的氮杂环丁胺替换为N-异丙基哌嗪，其余步骤同实施例9制备而得，收率28%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.30 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.41 (d, J =8.6 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.26 (s,2H), 6.00 (s, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.35 – 3.12 (m, 3H), 2.80 (s, 6H), 1.33 (s,6H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 150.34, 147.61, 146.82, 145.09, 144.87, 141.92,135.05, 131.94, 120.37, 120.26, 115.30, 113.92, 110.39, 109.65, 102.60,101.32, 58.44, 57.30, 49.15, 47.77, 16.89.
实施例19
2-(4-((6-([1,3]dioxolo[4,5-h]isoquinolin-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)piperazin-1-yl)ethan-1-ol (化合物C-19).
化合物C-19的结构式为：
将实施例9步骤中的氮杂环丁胺替换为N-羟乙基哌嗪，其余步骤同实施例9制备而得，收率28%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.31 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.41 (d, J =8.6 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.10 (s, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.26 (s,2H), 6.00 (s, 2H), 3.72 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.62 (s, 2H), 2.88 – 2.54 (m,10H).13C NMR (101 MHz, methanol-d 4 ) δ 150.24, 149.96, 149.59, 147.06, 145.54,143.35, 136.41, 133.67, 122.89, 122.35, 117.44, 115.02, 113.16, 111.76,104.57, 103.52, 60.09, 60.02, 58.86, 52.49, 51.21.
实施例20体外抗增殖活性
实验方法：
（人结肠癌细胞）RKO、SW480、HT-29 和HCT-116，（人胃癌细胞）HGC-27、BGC-823 和SGC-7901、MGC-803，（HCC 细胞）HuH7、LM9 和HepG2，（人胶质瘤细胞）U251、U87、C6，人类正常肝细胞LO2均来自CCTCC（中国）。 细胞在 MEM/DMEM/RPMI 1640 中培养，另外添加 10%胎牛血清、1% 青霉素-链霉素（双抗）并在 5% CO2 的湿润气氛和温度维持在 37 oC的环境中生长。
将测试的细胞（8×103 个细胞/孔）接种到 96 孔板中并孵育过夜。 细胞贴壁后，将不同浓度的受试化合物与细胞一起培养 72 小时。 之后，将受干预的细胞与 MMT（PBS中 5 mg/mL）再孵育 4 小时。 然后去除上清液，加入 100 μL DMSO 溶解甲臜。 通过酶标仪（Tecan，Switzerland）在 570 nm 波长下测量溶液的吸光度。抑制率% = 1-(OD570加药孔 -OD570背景孔)/(OD570对照孔 - OD570 背景孔) ×100%。本发明通过SPSS25.0计算IC50值，数据重复3次，用表示。
表1 本发明制备的所有化合物在人肝细胞系（LM9、HuH7和HepG2、人结肠癌细胞（HT-29、HCT-116、RKO和SW480）和人胃细胞系（HGC-27）对应的值：
α每个带有标准偏差 (SD) 的值代表三个独立实验的平均值；每种化合物与细胞的孵育时间为 72 小时；MTT法测定细胞毒性；IBM SPSS Statistics 软件用于统计分析；NTβ：未测试。
表2 本发明制备的所有化合物在人胃细胞系（SGC-7901、BGC-823 和 MCG-803）、人神经胶质瘤细胞系（C6 和 U87）、人肺泡基底上皮细胞系（A549）、人类正常肝细胞（LO2）对应的值：/>
α每个带有标准偏差 (SD) 的值代表三个独立实验的平均值；每种化合物与细胞的孵育时间为 72 小时；MTT法测定细胞毒性；IBM SPSS Statistics 软件用于统计分析；NTβ：未测试。
实验结果表明本发明制备的化合物对于肝癌细胞株毒性最佳，可用于制备抗肝癌药物。
实施例21拓扑异构酶Ⅰ抑制活性
实验方法：
加入2 μL 拓扑异构酶Ⅰ缓冲液（350 mM Tris-HCl （pH 8.0），720 mM KCl，50 mMMgCl2，50 mM DTT，50 mM亚精胺），2 μL 0.1%牛血清白蛋白，250 ng的pBR322质粒DNA ，0.5U拓扑异构酶Ⅰ，0.2 μL的化合物C-12，用超纯水补至终体积为20 μL。37℃孵育0.5 h。而后，加入20μ L苯酚-氯仿萃取液（体积比为1:1），搅拌后于1000 g离心，取上清液。取10 μL上清，加入2 μL DNA 6×的上样缓冲液终止反应，将混合的DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶上以110 V电压电泳1 h。DNA条带用溴化乙锭水溶液显色（0.5μg/mL），室温放置30 min，在紫外光下观察。
实验结果：
图1为化合物C-12对拓扑异构酶Ⅰ的抑制活性结果。图中显示：化合物C-12抑制拓扑异构酶Ⅰ活性最佳，并能够浓度依赖性地显著抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性。
实施例22拓扑异构酶Ⅱ抑制活性
实验方法：
加入3 μL 拓扑异构酶Ⅱ缓冲液（350 mM Tris-HCl （pH 8.0），720 mM KCl，50 mMMgCl2，50 mM DTT，50 mM亚精胺），1 μL ATP，250 ng的pBR322质粒DNA ，0.5 U拓扑异构酶Ⅱ，0.3 μL的化合物C-12，用超纯水补至终体积为30 μL。37℃孵育0.5 h。加入6 μL DNA 6× 的上样缓冲液终止反应，将混合的DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶上以110 V电压电泳1 h。DNA条带用溴化乙锭水溶液显色（0.5μg/mL），室温放置30 min，在紫外光下观察。
实验结果：
图2为化合物C-12对拓扑异构酶Ⅱ的抑制活性结果。图中显示：化合物C-12抑制拓扑异构酶Ⅱ活性最佳，并能够浓度依赖性地显著抑制拓扑异构酶Ⅱ的活性。
结合体外细胞增殖抑制实验筛选出化合物C-12进行进一步的抗肝癌活性研究以及作用机制研究。
实施例23彗星实验
实验方法:
（1）制样：LM9和HuH7细胞接种于6孔板中，37℃、 5%CO2培养箱中培养过夜后，用不同浓度的化合物C-12孵育，之后用PBS洗细胞2次，收集细胞。用冷的 1×PBS 缓冲液(不含钙镁)重悬细胞，调整细胞密度为 4×105个/ml。
（2）铺胶：按照 1:10 (v/v) 将细胞悬液与熔化后的 Comet Agarose (37℃)在EP 管中充分混合，迅速吸取 20 μl 混合液滴加至 6-Well Comet Slide 上的圆孔内，轻轻盖上盖玻片使胶铺平，4℃避光固化 15 min。
（3）裂解：胶凝固后，将盖玻片推开，并将载玻片转移至装有预冷的LysisSolution 的容器中，4 ℃裂解30 min，取出载玻片并沥去多余液体，蒸馏水浸洗 2 次，每次 2 min。
（4）解旋：将载玻片转移至装有新鲜配制的解旋液的容器中，室温解旋 20min。
（5）电泳：水平电泳仪中倒入 4℃预冷的电泳液，将载玻片轻柔浸没其中，按照1V/cm 设定电压，
（6）电流 300 mA 条件下电泳 15-30 min。
（7）中和及烘干：取出载玻片并沥去多余液体，蒸馏水浸洗 2 次，每次 2 min。转移载玻片至 70%酒精溶液中，室温放置 5 min 后取出沥干，37℃烘干。
（8）染色：每孔滴加 40 μl 染色液，室温避光染色 10 min，蒸馏水浸洗 2 次，每次 2 min。
（9）观察及分析：荧光显微镜下观察，并进行图片采集。
图3为化合物C-12是对DNA损伤的影响。图中显示：化合物C-12在14 μM时对HuH7细胞和LM9细胞的DNA有一定程度的损伤。
实施例24本发明化合物对肝癌LM9和HuH7细胞增殖的影响
实验方法：
（1）平板克隆实验
取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种500个细胞。贴壁后加入化合物C-12。实验组加入不同浓度的化合物C-12。对照组则加等量不含化合物C-12的培养液。每组3个复孔。在37℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养两周。期间3天换1次药液。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加甲醇固定细胞，15 min后去除固定液。加适量0.5%结晶紫染色，30 min后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
（2）EdU实验
取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。96孔板每孔种5000个细胞。贴壁后加药处理。实验组加入不同浓度的药物。对照组则加等量不含药物的培养液。每组3个复孔。在37℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h，弃去上清液，加入100 μL含有50 μM EdU的完全培养基，37℃孵育2 h。4%的多聚甲醛固定后加入0.5%的曲拉通透膜。PBS洗两次后，先后加入Apollo染液和Hoechst 33342染液，PBS清洗后，在显微镜下观察。
实验结果：
图4显示化合物C-12经EdU实验测定，能够呈浓度依赖地抑制肝癌LM9和HuH7细胞动态增殖，且经统计具有显著性差异。
图5为化合物C-12对肝癌LM9和HuH7细胞生长曲线的影响以及对细胞克隆群落形成的影响。图中显示化合物C-12能够呈浓度依赖地抑制肝癌LM9和HuH7细胞克隆群落的形成。
实施例25 本发明化合物对肝癌LM9和HuH7细胞迁移、侵袭的影响
实验方法：
（1）Transwell迁移实验
取出transwell小室(Corning 3422) 放入24孔板各孔中。每孔加600μL含有20%血清的培养基。消化细胞，得细胞悬液，按每毫升2 × 105个细胞接入上室。上室加2ⅹ浓度药物，加无血清培养基并使上室终体积为400 μL。放入细胞培养箱培养24 h。取出小室，用棉签擦去上室内侧未穿过的细胞，下室加甲醇，并将上室浸入，室温固定10min，PBS清洗，移去小室，倒置，风干。用PBS配制浓度为0.1%结晶紫溶液，每小室加700 μL，将上室浸入其中，置于37℃培养箱中染色30 min；取出小室，用PBS清洗，并在显微镜下观察，在膜上相互垂直的直径上取5个不同视野，计透膜细胞数。
（2）Transwell侵袭实验
从-20℃冰箱取出matrigel于4℃过夜融化，将EP管于冰上预冷，并将融化后的matrigel与预冷无血清无双抗培养基按体积比1:8混合，轻轻混匀。每个transwell板小室上层加40 μL混合后的matrigel混合液，轻轻混匀，并置于培养箱中1 h。取出transwell板，轻轻吸弃小室中多余液体，于小室上层加100 μL无血清无双抗培养基并将transwell板放入培养箱中1 h，水化基底膜。取出transwell小室，下室每孔加600 μL含有20%血清培养基。消化细胞，得细胞悬液，按每毫升3 × 105个细胞接入上室，上室加 2ⅹ浓度药物，加无血清培养基并使上室终体积为400 μL，放入细胞培养箱培养24 h。取出小室，用棉签擦去上室内侧未穿过的细胞，下室加甲醇，并将上室浸入，室温固定10 min，PBS清洗，移去小室，倒置，风干。用PBS配制浓度为0.1%结晶紫溶液，每小室加700 μL，将上室浸入其中，置于37℃培养箱中染色30min；取出小室，用PBS清洗，并在显微镜下观察，在膜上相互垂直的直径上取5个不同视野，计透膜细胞数。
图6为化合物C-12在Transwell实验中对肝癌LM9和HuH7细胞迁移的影响。图中显示：所选化合物经Transwell迁移实验证实能够呈浓度依赖性地抑制肝癌LM9和HuH7细胞迁移，且具有统计学差异。
图7为化合物C-12在Transwell实验中对肝癌LM9和HuH7细胞侵袭的影响。图中显示：所选化合物经Transwell侵袭实验证实能够呈浓度依赖性地抑制肝癌LM9和HuH7细胞侵袭，且具有统计学差异。
实施例26本发明化合物对肝癌LM9和HuH7细胞周期分布的影响
实验方法：
取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种20×104个细胞。在37℃、含5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入不同浓度药物处理48 h。每组3个复孔。培养48 h后收集细胞，用预冷的PBS 3次洗涤收集的细胞，离心沉淀细胞，弃上清。用500μL PBS重悬细胞，迅速打入预冷的无水乙醇中，吹打均匀，4 °C储存过夜。离心乙醇固定过的细胞，弃上清， PBS洗涤细胞3次。用RNase A于37°C重悬细胞，15min后，加入PI染色液避光染色15 min。流式细胞仪测定细胞周期。用ModfitLT软件分析流式周期结果，统计G0/G1期、S期、G2/M期各组所占百分比。
实验结果：
图8为化合物C-12对肝癌LM9细胞周期分布的影响。结果显示化合物C-12对肝癌LM9细胞周期阻滞不明显。
图9为化合物C-12对肝癌HuH7细胞周期分布的影响。结果显示化合物C-12对肝癌HuH7细胞周期阻滞不明显。图10为化合物C-12对肝癌LM9和HuH7细胞周期分布的柱状图。
实施例27本发明化合物对肝癌LM9和HuH7细胞凋亡的影响
实验方法：
（1）Hoechst 33342染色
取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种5×104个细胞。贴壁后加药处理。实验组加入不同浓度的药物。对照组则加等量不含药物的培养液。每组3个复孔。在37 ℃、含5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养24h，弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞，10 min后去除固定液。加10 μg/mL Hoechst 33342染液染色，30 min后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
（2）流式细胞术
取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种15×104个细胞。在37 ℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入不同浓度药物处理48 h。每组3个复孔。培养48 h后收集细胞，用Annexin-V FITC/PI凋亡试剂盒对细胞染色，用流式细胞仪分析细胞凋亡。
（3）线粒体膜电位（TMRE）检测
取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种2×106个细胞。在37 ℃、含5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入不同浓度药物处理。每组3个复孔。随后，胰蛋白酶消化收集细胞，加入1 mL 含TMRE的培养基，在37 ℃下孵育30 min，而后离心（1000 rpm，5 min），用培养基冲洗两次。用500 μL培养基悬浮细胞，然后用流式细胞仪检测。
（4）活性氧（ROS）检测
取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种2×106个细胞。在37 ℃、含5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入不同浓度药物处理。每组3个复孔。随后，胰蛋白酶消化收集细胞，加入1 mL 含ROS的培养基，在37 ℃下孵育30 min，而后离心（1000 rpm，5 min），用培养基冲洗两次。用500 μL培养基悬浮细胞，然后用流式细胞仪检测。
（5）凋亡相关蛋白cleaved-casepase-3、 cleaved-casepase-9、 Bcl-2、 Bax 和cytochrome c的检测。
LM9和HuH7细胞接种于6孔板中，37℃、 5% CO2培养箱中培养过夜后，用不同浓度的化合物1作用24 h，之后用PBS洗细胞2次，使用索莱宝高效RIPA裂解液300 μL于冰上裂解10min, 收集样品，样品液加SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，涡旋混匀后于95 °C 水浴中变性10 min，冷却后置于-20 °C待测。用保鲜膜密封凝胶玻璃板，根据待测蛋白分子量大小配制相应浓度的SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶，之后插入梳子，向上垂直放置并静置数分钟，充分凝固后拆去保鲜膜和梳子。将制好的胶板插入电泳槽，每个上样孔加入等体积的样品和marker。在梯度电泳条件下跑电泳。电泳结束后，剥离凝胶，将0.45 μM PVDF 膜于甲醇中活化10 min，使用湿转转印法电泳槽将分离后的蛋白样品转印至活化后的PVDF 膜上。待转印结束，将PVDF 膜置于5%脱脂奶粉的TBST 封闭液中室温封闭1.5 h。用TBST 缓冲液洗膜3次，各10 min。将PVDF 膜置于适当比例稀释的对应一抗中，于4 ℃孵育过夜。用TBST 缓冲液洗膜3 次，各10 min。加入适当比例稀释的HRP标记的IgG 二抗，室温摇床孵育1.5 h。抗体孵育结束后，再次用TBST 缓冲液洗膜3次，各10 min。加入ECL 化学发光液，采用多功能成像仪进行化学发光成像测定。
实验结果：
图11为化合物C-12对肝癌LM9和HuH7细胞Hoechst染色的情况，从图中可以看出化合物C-12经Hoechst染色后，其能够呈浓度依赖地诱导肝癌LM9和HuH7的凋亡。
图12为化合物C-12对肝癌LM9细胞凋亡的影响，从图中可以看出化合物C-12经流式细胞术测定，其能够呈浓度依赖地诱导肝癌LM9的凋亡。
图13为化合物C-12对肝癌HuH7细胞凋亡的影响，从图中可以看出化合物C-12经流式细胞术测定，其能够呈浓度依赖地诱导肝癌HuH7的凋亡。
图14为化合物C-12对肝癌LM9细胞线粒体膜电位的影响，从图中可以看出化合物C-12经流式细胞术测定，其能够呈浓度依赖地降低肝癌LM9细胞的细胞线粒体膜电位的水平。
图15为化合物C-12对肝癌HuH7细胞线粒体膜电位的影响，从图中可以看出化合物C-12经流式细胞术测定，其能够呈浓度依赖地降低肝癌HuH7细胞的细胞线粒体膜电位的水平。
图16为化合物C-12对肝癌LM9细胞活性氧的影响，从图中可以看出化合物C-12经流式细胞术测定，其能够呈浓度依赖地诱导肝癌LM9细胞活性氧的爆发。
图17为化合物C-12对肝癌HuH7细胞活性氧的影响，从图中可以看出化合物C-12经流式细胞术测定，其能够呈浓度依赖地诱导肝癌HuH7细胞活性氧的爆发。
图18为化合物C-12对肝癌LM9和HuH7细胞线粒体相关凋亡蛋白的影响。图中显示化合物C-12对肝癌LM9和HuH7细胞凋亡相关蛋白cleaved-casepase-3、 cleaved-casepase-9、Bcl-2、 Bax 和 cytochrome c表达的影响。图中显示：化合物C-12能够呈浓度依赖性地下调抗凋亡蛋白 (Bcl-2) 的表达，上调促凋亡蛋白(caspase-9、caspase-3、Bax以及 cytochrome c) 的表达，且具有统计学显著性。
实施例28Western blot 法测定肝癌LM9和HuH7细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达
实验方法：
（1）制样：LM9和HuH7细胞接种于6孔板中，37℃、 5% CO2培养箱中培养过夜后，用不同浓度的化合物C-12孵育，之后用PBS洗细胞2次，使用索莱宝高效RIPA裂解液300 μL于冰上裂解10 min, 收集样品，样品液加SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，涡旋混匀后于95℃水浴中变性10 min，冷却后置于-20℃待测。
（2）制胶：用保鲜膜密封凝胶玻璃板，根据待测蛋白分子量大小配制相应浓度的SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶，之后插入梳子，向上垂直放置并静置数分钟，充分凝固后拆去保鲜膜和梳子。
（3）上样：将制好的胶板插入电泳槽，每个上样孔加入等体积的样品和marker。在梯度电泳条件下跑电泳。
（4）转印：电泳结束后，剥离凝胶，将0.45 μM PVDF 膜于甲醇中活化10 min，使用湿转转印法电泳槽将分离后的蛋白样品转印至活化后的PVDF 膜上。
（5）封闭：待转印结束，将 PVDF 膜置于 5% 脱脂奶粉的TBST 封闭液中室温封闭1.5 h。用TBST 缓冲液洗膜3 次，各10 min。
（6）一抗孵育：将PVDF 膜置于适当比例稀释的相应一抗中，于4℃孵育过夜。
（7）二抗孵育：用TBST 缓冲液洗膜3 次，各10 min。加入适当比例稀释的HRP标记的IgG 二抗，室温摇床孵育1.5 h。
（8）化学发光：抗体孵育结束后，再次用TBST 缓冲液洗膜3次，各10 min。加入ECL化学发光液，采用天能多功能成像仪化学发光模块成像。
实验结果：
图19为化合物C-12对肝癌LM9和HuH7细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。图中显示：化合物C-12能够呈浓度依赖性地下调p-PI3K、p-AKT 和 p-mTOR的表达，且具有统计学显著性，表明化合物C-12可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路从而诱导肝癌细胞凋亡。

Claims (5)

1.一种3-芳基异喹啉衍生物，其结构式为：
。
2.如权利要求1所述一种3-芳基异喹啉衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以6-溴藜芦醛和三甲基硅炔为原料，以碘化亚铜和四（三苯基膦）钯为催化剂，以四氢呋喃为溶剂，以三乙胺为碱和共溶剂，在氩气保护下，40~60 ℃下反应4~6 h，反应完成后，抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物1；
6-溴藜芦醛的结构式为：；
化合物1的结构式为：；
三甲基硅炔的用量为6-溴藜芦醛摩尔量的1.2~2.0倍；碘化亚铜的用量为6-溴藜芦醛摩尔量的0.1~0.2倍；四（三苯基膦）钯的用量为6-溴藜芦醛摩尔量的0.02~0.1倍；
（2）以化合物1为原料，以硼氢化钠为还原剂，以甲醇为溶剂，在氩气条件下，0~4 ℃反应5~10 min，反应完成后，加水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取旋干，得到部分脱TMS保护基的混合物；将混合物加入四氢呋喃为中，加入四丁基氟化铵，室温反应5 min，反应完成后，旋干溶剂，柱层析分离得到化合物6；
化合物6的结构式为：；
硼氢化钠的用量为化合物1摩尔量的1.2~2.0倍；四丁基氟化铵的用量为化合物1摩尔量的1.2~2.0倍；
（3）以化合物6和化合物3为原料，以三乙胺为碱和共溶剂，以碘化亚铜和四（三苯基膦）钯为催化剂，以四氢呋喃和乙腈为溶剂，在氩气保护下，80 ℃下反应4~6 h，反应完成后，抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到得到化合物7；
化合物3的结构式为：；
化合物7的结构式为：；
化合物6和化合物3的摩尔比为1:1.2~1:1.5；碘化亚铜的用量为化合物6摩尔量的0.1~0.2倍；四（三苯基膦）钯的用量为化合物6摩尔量的0.02~0.1倍；
（4）以化合物7和四溴化碳为原料，以二氯甲烷为溶剂，在氩气条件下，0 ℃下加入三苯基膦，于室温下反应0.5~1 h，反应完成后，旋干溶剂，柱层析分离得到化合物8；
化合物8的结构式为：；
四溴化碳的用量为化合物7摩尔量的1.5~2.0倍；三苯基膦的用量为化合物7摩尔量的2.2~2.5倍；
（5）以化合物8和胺类化合物为原料，以三乙胺为碱，以四氢呋喃为溶剂，在氩气条件下，反应在25~45 ℃反应6~10 h，反应完成后，旋干溶剂，柱层析分离得到化合物9；
化合物9的结构式为：，R3为环己亚胺基；
胺类化合物为环己亚胺；
（6）以化合物9为原料，以醋酸铵为氮源，以硝酸银为催化剂，以四氢呋喃和正丁醇为溶剂，在氩气保护下，25~35 ℃下反应4~6 h，反应完成后，加入碳酸氢钠固体淬灭反应，再搅拌0.5~1 h后，抽滤，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标产物3-芳基异喹啉衍生物；
3-芳基异喹啉衍生物的结构式为：，R3为环己亚胺基。
3.如权利要求2所述一种3-芳基异喹啉衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，三乙胺的用量为化合物8摩尔量的3~5倍；胺类化合物的用量为化合物8摩尔量的2~4倍。
4.如权利要求2所述一种3-芳基异喹啉衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（6）中，醋酸铵的用量为化合物9摩尔量的2.5~3.0倍；硝酸银的用量为化合物9摩尔量的0.1~0.2倍。
5.根据权利要求1所述一种3-芳基异喹啉衍生物在制备抗肝癌药物中的应用。
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