CN114451304A

CN114451304A - 以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系用培养基及建立羊乳再生体系的方法

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Publication number: CN114451304A
Application number: CN202210143701.5A
Authority: CN
Inventors: 李冬玲; 顾永华; 汪琼
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2022-02-17
Filing date: 2022-02-17
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2042-02-17
Also published as: CN114451304B

Abstract

本发明涉及以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系用培养基及建立羊乳再生体系的方法，属于组织培养技术领域。本发明提供了一组以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系用培养基，包括：愈伤组织诱导增殖培养基、愈伤组织分化培养基、壮芽培养基和壮苗生根培养基。本发明所述培养基能够实现羊乳种苗的周年生产，克服羊乳种子繁殖困难的问题，繁殖系数高、繁殖速度快为实现对羊乳的分子生物学操作奠定了技术基础。

Description

以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系用培养基及建立羊乳再生体系的方法

技术领域

本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系用培养基及建立羊乳再生体系的方法。

背景技术

羊乳(Codonopsis lanceolata(Sieb.et Zucc.)Trautv.)为桔梗科党参属多年生草本植物，又名山胡萝卜、轮叶党参、羊奶参、四叶参等。植株全体光滑无毛或茎叶偶疏生柔毛。茎缠绕，叶细小在主茎上的互生，披针形或菱状狭卵形，叶片菱状卵形、狭卵形或椭圆形，花单生或对生于小枝顶端；花萼贴生至子房中部，花冠阔钟状，黄绿色或乳白色内有紫色斑；花盘肉质，深绿色；花丝钻状，子房下位。蒴果，果期7-8月。主要分布于我国东北、华北、华东和中南各省区。俄罗斯远东地区、朝鲜、日本也有分布。以根入药，味甘、辛、平，具有滋补强壮、补虚通乳、排脓解毒、祛痰的功效。用于血虚气弱、肺痈咯血、乳汁少、各种痈疽肿毒、带下病等病症的治疗。

药用植物羊乳种子卵形，有翼，但较细小，种子体积小，千粒重仅1.4g。目前，羊乳的繁殖以种子繁殖为主。王岳峰等(2011)¹、耿艳秋等(2011)²的研究表明，二年生轮叶党参植株比一年生植株所结种子的发芽率高19％；但种子寿命较短，且对贮存条件较为敏感，贮存1年后的种子发芽率只有10％；冬季自然温度条件(-30～10℃)下贮存，发芽率为51％，室内(10～20℃)贮存，其发芽率只有8％。庄旭生和奚广生(2011)的研究表明，赤霉素浸种加上变温处理可以提高羊乳种子的发芽率，最高也仅能达到49.33％³。因此，推测低温春化可能是羊乳种子萌发不可缺少的外界条件；且只有完成低温春化后，赤霉素处理才能一定程度提高种子的发芽率；除此之外，羊乳种胚在形态和生理上还存在后熟现象，致使其发芽周期长。尽管可以通过秋季播种来解决这一问题，但是幼苗越冬期间的管理成本较高。总之，种子发芽率较低，发芽速度慢，加上种子细小，造成羊乳繁殖、栽培的成本较高，不利于其大面积的栽培和推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系用培养基及建立羊乳再生体系的方法。本发明所述培养基能够实现羊乳种苗的周年生产，克服羊乳种子繁殖困难的问题，繁殖系数高、繁殖速度快为实现对羊乳的分子生物学操作奠定了技术基础。

本发明提供了一组以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系用培养基，所述培养基包括：愈伤组织诱导增殖培养基、愈伤组织分化培养基、壮芽培养基和壮苗生根培养基；

所述愈伤组织诱导增殖培养基以MS或B5为基础培养基，包括蔗糖30g/L、琼脂7.0～7.5g/L、KT 0.5～1.5mg/L、NAA 0.1～0.5mg/L和碳纳米管0.5～1.5mg/L；

所述愈伤组织分化培养基以MS或B5为基础培养基，包括蔗糖30g/L、琼脂7.0～7.5g/L、6-BA0.5～1.0mg/L、NAA0.2～0.6mg/L和碳纳米管0.5～1.5mg/L；

所述壮芽培养基以MS为基础培养基，包括蔗糖40g/L、琼脂7.0～7.5g/L、6-BA0.3～0.8mg/L、NAA0.1～0.3mg/L和碳纳米管0.5～1.5mg/L；

所述壮苗生根培养基以MS为基础培养基，包括蔗糖40g/L、琼脂7.0～7.5g/L、IBA0.5～1.5mg/L和碳纳米管2.0～4.0mg/L。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述培养基的以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系的方法，包括以下步骤：

1)将消毒后的种子接种在愈伤组织诱导增殖培养基上进行愈伤诱导培养，得到愈伤组织，将愈伤组织在新的愈伤组织诱导增殖培养基上进行增殖培养，得到增殖后的愈伤组织；

2)将步骤1)得到的增殖后的愈伤组织切块，接种到愈伤组织分化培养基上进行分化培养，得到丛生小苗；

3)将步骤2)得到的丛生小苗转接到壮芽培养基上进行壮芽培养，分切，得到单株试管苗；

4)将步骤3)得到的单株试管苗转接到壮苗生根培养基上进行壮苗生根共培养，得到试管苗；

5)将步骤4)得到的试管苗进行炼苗和移栽，得到再生羊乳。

优选的是，所述消毒前，还包括对种子进行洗涤，所述洗涤包括震荡洗涤20～30min，再用流水冲洗1.5～2h。

优选的是，所述消毒包括使用乙醇水溶液和氯化汞水溶液进行消毒。

优选的是，所述愈伤诱导培养、增殖培养、分化培养、壮芽培养和壮苗生根培养的过程中，温度为25±1℃。

优选的是，所述愈伤诱导培养、增殖培养、分化培养、壮芽培养和壮苗生根培养的过程中，光照强度为100～300μmol·m^-2·s^-1。

优选的是，所述愈伤诱导培养、增殖培养、分化培养、壮芽培养和壮苗生根培养的过程中，光照时间为16h/d。

优选的是，步骤3)所述壮芽培养后，单株试管苗的高度为4～6cm、叶片4～6片以上。

优选的是，步骤4)所述壮苗生根培养后，试管苗的高度为6～7cm、叶片6片以上、根数目3～5条和根长度为0.8～1.2cm。

优选的是，步骤5)所述移栽的基质包括泥炭土、珍珠岩和田园土，所述泥炭土、珍珠岩和田园土的体积比为(1.0～2.0):(0.5～1.0):(0.5～1.0)。

本发明提供了以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系用培养基。本发明所述培养基能够实现羊乳种苗的周年生产，克服羊乳种子繁殖困难的问题，繁殖系数高、繁殖速度快为实现对羊乳的分子生物学操作奠定了技术基础。本发明还提供了一种以羊乳种子为外植体，诱导产生愈伤组织，通过愈伤组织的增殖和分化，获得大量丛生芽，通过对丛生芽的壮芽和生根培养，获得大量的羊乳组培苗的方法，本发明能够实现羊乳的快速、高效繁殖，降低羊乳的繁殖成本，推动羊乳的规模化栽培和推广应用。

附图说明

图1为本发明提供的以羊乳种子为外植体的接种；

图2为本发明提供的愈伤的诱导；

图3为本发明提供的愈伤组织的增殖培养；

图4为本发明提供的愈伤组织的分化；

图5为本发明提供的愈伤组织分化苗的壮苗培养。

具体实施方式

在本发明中，所述碳纳米管优选为多壁碳纳米管，更优选购自江苏先丰纳米科技材料有限公司，货号：100320。

5)将步骤4)得到的试管苗进行炼苗和移栽，得到再生羊乳。

本发明将消毒后的种子接种在愈伤组织诱导增殖培养基上进行愈伤诱导培养，得到愈伤组织，将愈伤组织在新的愈伤组织诱导增殖培养基上进行增殖培养，得到增殖后的愈伤组织。本发明对所述种子的获得方法没有特殊限定，优选采集成熟的羊乳蒴果，去掉果皮，得到新鲜的羊乳种子。在本发明中，所述消毒前，优选还包括对种子进行洗涤，所述洗涤优选包括震荡洗涤20～30min，再用流水冲洗1.5～2h。在本发明中，所述震荡洗涤的转速优选为100～150rpm，更优选为120rpm。在本发明中，所述震荡洗涤优选为在洗涤剂中进行，本发明对所述洗涤剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的液体洗涤剂即可，如洗洁精。在本发明中，所述消毒包括使用乙醇水溶液和氯化汞水溶液进行消毒。在本发明中，所述消毒的操作优选在超净台上进行。在本发明中，所述乙醇水溶液优选为乙醇的体积百分含量为75％的乙醇水溶液，本发明使用乙醇水溶液进行消毒的时间优选为30～45s，之后优选用无菌水冲洗2～3次。在本发明中，所述氯化汞水溶液中氯化汞的质量百分含量优选为0.1％。氯化汞水溶液处理的时间优选6～10min，处理后，优选使用无菌水清洗4～5次。在本发明中，所述愈伤诱导培养的温度优选为25±1℃。在本发明中，所述愈伤诱导培养的光照强度优选为100～300μmol·m^-2·s^-1。在本发明中，所述愈伤诱导培养的光照时间优选为16h/d。本发明所述愈伤诱导培养20～25d后，即自接种起，培养20～25d后，在种子的周围会产生白色或淡绿色的愈伤组织；自接种起，35～40d后，优选使用愈伤组织诱导增殖培养基进行增殖培养，使愈伤组织膨大、增殖。在本发明中，所述继代培养的温度优选为25±1℃。在本发明中，所述继代培养的光照强度优选为100～300μmol·m^-2·s^-1。在本发明中，所述继代培养的光照时间优选为16h/d。

得到增殖后的愈伤组织后，本发明将增殖后的愈伤组织切块，接种到愈伤组织分化培养基上进行分化培养，得到丛生小苗。在本发明中，所述切块优选为切分成提及0.5～0.8cm³的小块。所述分化培养能够诱导丛生芽的产生。在本发明中，所述分化培养的温度优选为25±1℃。在本发明中，所述分化培养的光照强度优选为100～300μmol·m^-2·s^-1。在本发明中，所述分化培养的光照时间优选为16h/d。经过25～35d的分化培养，在深绿色的愈伤组培表面产生淡黄色的芽点；继续培养25～30d，芽点慢慢长大，直至分化成丛生小苗。

得到丛生小苗后，本发明将丛生小苗转接到壮芽培养基上进行壮芽培养，分切，得到单株试管苗。本发明优选不对丛生小苗进行分切，直接转接到壮芽培养基上进行壮芽培养。在本发明中，所述壮芽培养的温度优选为25±1℃。在本发明中，所述壮芽培养的光照强度优选为100～300μmol·m^-2·s^-1。在本发明中，所述壮芽培养的光照时间优选为16h/d。在本发明中，经过50～70d的壮芽培养，单株试管苗的高度为4～6cm、叶片4～6片以上。本发明在壮芽培养期间，随着小苗的长大，优选切分成单株。

得到单株试管苗后，本发明将单株试管苗转接到壮苗生根培养基上进行壮苗生根共培养，得到试管苗。在本发明中，所述壮苗生根培养的温度优选为25±1℃。在本发明中，所述壮苗生根培养的光照强度优选为100～300μmol·m^-2·s^-1。在本发明中，所述壮苗生根培养的光照时间优选为16h/d。在本发明中，所述壮苗生根培养后，试管苗的高度为6～7cm、叶片6片以上、根数目3～5条和根长度为0.8～1.2cm。

得到试管苗后，本发明将试管苗进行炼苗和移栽，得到再生羊乳。在本发明中，所述炼苗优选在室内进行。在本发明中，所述炼苗优选为将培养瓶松盖后，置于组培室缓冲间，放置2～3d，之后移入室内房间，置于自然散射光下，放置2～3d。炼苗完成后，本发明优选使用镊子将试管苗取出，用多菌灵浸泡，洗去根部的培养基后，移栽到穴盘中。在本发明中，所述多菌灵浸泡优选使用800倍多菌灵浸泡5～10min。在本发明中，所述穴盘的规格优选为10孔×10孔。在本发明中，所述移栽的基质优选包括泥炭土、珍珠岩和田园土，所述泥炭土、珍珠岩和田园土的体积比优选为(1.0～2.0):(0.5～1.0):(0.5～1.0)，更优选为1:1:1。在本发明中，所述基质优选也使用800倍多菌灵进行消毒处理。移栽后，本发明优选进行正常的水肥管理。

本发明所述方法以羊乳种子为外植体，经由愈伤组织的诱导、增殖、分化，获得丛生芽，通过壮芽、壮苗和生根培养，获得大量的羊乳无菌苗，从而建立羊乳种苗的组培快繁技术体系。一方面繁殖系数高、繁殖速度快，可进行羊乳种苗的周年生产，克服了羊乳种子繁殖困难的问题，同时也为实现对羊乳的分子生物学操作奠定了技术基础。文献报道中，以羊乳种子获得无菌苗后，以无菌叶器官为外植体亦可建立起再生体系，本发明与此相比，直接以种子为外植体，基于愈伤组织的诱导，建立起快繁技术体系，繁殖的周期更短，成本更低，效率更高。

下面结合具体实施例对本发明所述的以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系用培养基及建立羊乳再生体系的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

(1)外植体的获取2020年10月，在晴朗的天气条件下，于南京中山植物园药用植物种质资源圃采集成熟的羊乳蒴果10个，去掉果皮，获得新鲜的种子若干。将种子放入100mL的玻璃三角瓶中，加入2滴洗涤剂，120rpm震荡洗涤25min后，再用流水冲洗100min，备用。

(2)外植体的消毒：于超净台上用75％的酒精将洗涤干净的羊乳种子消毒40s，之后无菌水冲洗2次；再用0.1％的HgCl₂处理8min，无菌水清洗4～5次，备用。

(3)愈伤组织的诱导将消毒后的种子3～4粒一组，直接接种到愈伤组织诱导增殖培养基上，每瓶10～12粒，如图1所示，培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L+B5+1.0mg/LKT+0.2mg/L NAA+1.0mg/L多壁碳纳米管(江苏先丰纳米科技材料有限公司，货号：100320)。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m^-2·s^-1，光照时间16h/d。接种22d后，在种子的周围会产生白色或淡绿色的愈伤组织，如图2所示；接种36d后，按照原配方(愈伤组织诱导增殖培养基)继续增殖培养，愈伤组织继续膨大、增殖，如图3所示。实施结果表明，若事先对种子进行筛选，去除发育不良的瘪粒种子，愈伤的诱导率可达100％。

(4)愈伤组织的分化将愈伤组织切分成体积0.5～0.8cm³的小块，接种到愈伤组织的分化培养基上，进行分化培养，诱导丛生芽的产生，如图4所示。培养基的配方为：蔗糖30g/L+琼脂7.25g/L+B5+0.8mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+1.0mg/L多壁碳纳米管。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m^-2·s^-1，光照时间16h/d。经由成熟种子诱导产生的愈伤，分化率可达100％。但由于愈伤组织的状态不同，分化培养所需的时间不同。本发明中，愈伤组织分化的最短时间25d，最长为35d。愈伤组织分化时，在深绿色的愈伤组培表面产生淡黄色的芽点；继续培养，芽点慢慢长大，直至分化的丛生小苗。从繁殖效率看，每块0.8cm³愈伤组织可分化芽120～150个。

(5)壮芽培养丛生小苗不分切，直接转接到壮芽培养基上进行壮芽培养，如图5所示。培养基配方为：蔗糖40g/L+琼脂7.35g/L+MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+1.0mg/L多壁碳纳米管。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m^-2·s^-1，光照时间16h/d。经过50～70d的培养，小苗长成高度4～6cm、叶片4～6片以上的试管苗。期间随着小苗的长大，将其分切成单株。

(6)壮苗和生根培养将单株试管苗转接到壮苗生根培养基上进行壮苗生根共培养。培养基配方为：蔗糖40g/L+琼脂7.25g/L+MS+1.0mg/L IBA+2.5mg/L多壁碳纳米管。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m^-2·s^-1，光照时间16h/d，直至小苗长成高度6～7cm、叶片6片以上、根数目3～5条，根长度0.8～1.2cm的试管苗。

(7)炼苗和移栽炼苗在室内进行。将组培瓶松盖后，置于组培室缓冲间，放置2～3d，之后移入室内房间，置于自然散射光下，再放置3d。炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，800倍多菌灵浸泡6min，洗去根部的培养基后，移栽到10×10的穴盘中。栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土＝1:1:1，栽培基质亦须经800倍多菌灵消毒处理。之后进行正常的水肥管理。

对比例1

其它操作方法和条件同实施例1，将1.0mg/LKT改为1.0mg/L 6-BA。结果表明，愈伤组织的诱导率仅为68.5％，愈伤组织产生的时间延长到35d。

对比例2

其它操作方法和条件同实施例1，将基本培养基由B5改为MS。结果表明，愈伤组织的诱导率能达到88.1％，愈伤组织增殖的速度与以B5为基本培养基的愈伤组织相比，也有较明显的降低。

对比例3

其它操作方法和条件同实施例1，不添加多壁碳纳米管。结果表明，与添加多壁碳纳米管的培养基相比，愈伤组织的诱导率几乎相同，但出愈时间和增殖速度明显滞后，平均比实施例晚4～6d。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一组以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系用培养基，其特征在于，所述培养基包括：愈伤组织诱导增殖培养基、愈伤组织分化培养基、壮芽培养基和壮苗生根培养基；

所述愈伤组织分化培养基以MS或B5为基础培养基，包括蔗糖30g/L、琼脂7.0～7.5g/L、6-BA 0.5～1.0mg/L、NAA 0.2～0.6mg/L和碳纳米管0.5～1.5mg/L；

所述壮芽培养基以MS为基础培养基，包括蔗糖40g/L、琼脂7.0～7.5g/L、6-BA 0.3～0.8mg/L、NAA 0.1～0.3mg/L和碳纳米管0.5～1.5mg/L；

所述壮苗生根培养基以MS为基础培养基，包括蔗糖40g/L、琼脂7.0～7.5g/L、IBA 0.5～1.5mg/L和碳纳米管2.0～4.0mg/L。

2.一种基于权利要求1所述培养基的以羊乳种子为外植体建立羊乳再生体系的方法，包括以下步骤：

5)将步骤4)得到的试管苗进行炼苗和移栽，得到再生羊乳。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消毒前，还包括对种子进行洗涤，所述洗涤包括震荡洗涤20～30min，再用流水冲洗1.5～2h。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消毒包括使用乙醇水溶液和氯化汞水溶液进行消毒。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养、增殖培养、分化培养、壮芽培养和壮苗生根培养的过程中，温度为25±1℃。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养、增殖培养、分化培养、壮芽培养和壮苗生根培养的过程中，光照强度为100～300μmol·m^-2·s^-1。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养、增殖培养、分化培养、壮芽培养和壮苗生根培养的过程中，光照时间为16h/d。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述壮芽培养后，单株试管苗的高度为4～6cm、叶片4～6片以上。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)所述壮苗生根培养后，试管苗的高度为6～7cm、叶片6片以上、根数目3～5条和根长度为0.8～1.2cm。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5)所述移栽的基质包括泥炭土、珍珠岩和田园土，所述泥炭土、珍珠岩和田园土的体积比为(1.0～2.0):(0.5～1.0):(0.5～1.0)。