CN114441688B - 一种原料药中叔丁胺残留量的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化学原料药中叔丁胺残留量的分析方法，采用反向液相色谱‑紫外检测器对叔丁胺衍生物进行检测，通过此方法可以准确测定化学原料药中叔丁胺的残留量，可定量检出化学原料药中10ppm以上的叔丁胺残留。更好的保证化学原料药的质量，具有操作简单，灵敏度高，重现性好的优点。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析方法领域，具体涉及一种化学原料药中叔丁胺残留量的分析方法。
背景技术
叔丁胺是一种重要的有机合成原料，用以合成医药、橡胶硫化促进剂、杀虫剂、杀菌剂和染料着色剂，也可用作溶剂。可用于生产利福平、N-特丁基-2-苯并噻唑次磺酰胺、特丁氨基乙醇甲基丙烯酸酯、盐酸阿罗洛尔、培哚普利叔丁胺片等原料药。由于叔丁胺对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有强烈的刺激作用，具有一定的毒性，吸入、口服或经皮吸收可能有致死风险，故在原料药中需进行严格的检测并控制其残留量。
一般的胺类物质，由于其沸点较低，本领域技术人员通常采用气相色谱法进行检测，但由于原料药中的有机溶剂的残留量较低，采用气相色谱法常常有响应低、峰形较差、重现性差等缺点，且容易出现色谱系统污染等现象。
发明内容
本申请针对上述气相色谱检测方法的缺陷开发了一种衍生化反向液相色谱法来对原料药中的叔丁胺进行定量分析，实现用反向液相色谱法-紫外检测器检测的目的，且解决了现有胺类溶剂残留检测方法灵敏度低、重现性差等问题。
本发明提供了一种化学原料药中叔丁胺胺残留量的分析方法，该分析方法包含以下步骤：
第一步：将供试品加适宜的溶剂A溶解；取上述溶液置容量瓶中，加入溶剂A、溶液B和衍生剂进行衍生化反应，置水浴中保温，取出放冷后，用溶剂A稀释至所需浓度；
第二步：取叔丁胺对照品，用溶剂A稀释至所需浓度后，照第一步“取上述溶液置容量瓶中，”开始，同法处理；
第三步：取上述两种溶液，分别精密量取适量，注入高效液相色谱仪中；
第四步：记录色谱图中叔丁胺衍生物的峰面积，按外标法计算供试品中叔丁胺的残留，所述计算公式为：
式中：
A样-----供试品溶液的色谱图中叔丁胺衍生物的峰面积；
A对-----对照品溶液的色谱图中叔丁胺衍生物的峰面积；
M对-----对照品称样量(mg)；
M样-----供试品称样量(mg)。
优选地，所述化学原料药为含有酸根结构的化学原料药。
更优选地，所述化学原料药为盐酸阿罗洛尔。
优选地，所述溶剂A选自甲醇、乙腈或二甲亚砜。
更优选地，所述溶剂A为甲醇。
优选地，所述溶液B选自氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸氢钠。
更优选地，所述溶液B为氢氧化钠。
优选地，所述溶液B摩尔浓度为0.05mol/L～1mol/L。
更优选地，所述溶液B摩尔浓度为0.1mol/L。
优选地，所述衍生剂选自邻苯二甲醛、水杨醛。
更优选地，所述衍生剂为水杨醛。
优选地，所述衍生化反应时间为20～40min。
更优选地，所述衍生化反应时间为30min。
优选地，第一步中供试品溶液浓度为0.5mg/ml～5mg/ml。
更优选地，第一步中供试品溶液浓度为2mg/ml。
优选地，第二步中对照品溶液浓度为0.5μg/ml～5μg/ml。
更优选地，第二步中对照品溶液浓度为2μg/ml。
优选地，第三步中，所述高效液相条件的检测波长为274nm或348nm。
更优选地，第三步中，所述高效液相条件的检测波长为348nm。
优选地，第三步中，所述高效液相条件的流动相ApH值为2.0～5.0。
更优选地，第三步中，所述高效液相条件的流动相ApH值为3.0。
本发明还提供了一种盐酸阿罗洛尔原料药中叔丁胺残留量的分析方法，该分析方法包括以下步骤：
第一步：盐酸阿罗洛尔样品用甲醇溶解后置容量瓶中，加入甲醇、氢氧化钠和10％水杨醛-甲醇进行衍生化反应，置水浴中保温，取出放冷后，用甲醇稀释至所需浓度；
第二步：取叔丁胺对照品，用甲醇稀释至所需浓度后，照第一步“取上述溶液置容量瓶中，”开始，同法处理；
第三步：取上述两种溶液，分别精密量取适量，注入高效液相色谱仪中，色谱条件为：以0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0±0.1)为流动相A，乙腈为流动相B，进行线性梯度洗脱，检测波长为348nm。
第四步：记录色谱图中叔丁胺胺衍生物的峰面积，按外标法计算供试品中叔丁胺衍生物的残留量。
优选地，该分析方法包括以下步骤：
第一步：取盐酸阿罗洛尔样品50mg至25ml容量瓶，加甲醇10mL溶解，加0.1mol/L氢氧化钠0.5ml和10％水杨醛-甲醇1ml，在60℃水浴中衍生30min，取出放冷，加甲醇稀释至刻度；
第二步：取叔丁胺对照品适量，加甲醇稀释制成50μg/ml溶液；取上述溶液1ml置25ml 容量瓶，加甲醇10mL、0.1mol/L氢氧化钠0.5ml和10％水杨醛-甲醇1ml，在60℃水浴中衍生30min，取出放冷，加甲醇稀释至刻度；
第三步：取上述两种溶液，分别精密量取20μl，注入液相色谱仪中，以十八烷基键合硅胶(WELCH Ultimate AQ-C18，5μm，4.6×250mm)为填料，柱温为30℃，检测波长为348nm， 0.02mol/L KH2PO4(磷酸调pH3.0±0.1)为流动相A，乙腈为流动相B，按下表梯度洗脱，流速为1.0ml/min。
| T(min) | A％ | B％ |
| 0 | 75 | 25 |
| 20 | 75 | 25 |
| 21 | 20 | 80 |
| 30 | 20 | 80 |
| 31 | 75 | 25 |
| 40 | 75 | 25 |
第四步：记录色谱图中叔丁胺衍生物的峰面积，按外标法计算供试品中叔丁胺的残留量。
本发明的有益技术效果包括：
(1)通过对衍生反应试剂、反应时间、色谱条件等筛选，最终选用了10％水杨醛-甲醇为衍生试剂，保证方法的准确度与精密度。
(2)采用本发明色谱条件，可以准确测定化学原料药中叔丁胺等残留，同时该方法操作简单，准确度高，无需特殊设备，有效降低了检测成本。
(3)本发明分析分离方法具有简便、快速、准确高等优点，完善了化学原料药中叔丁胺等残留量检测的质量标准。
(4)本方法还可广泛应用于化学原料药中的其它伯胺和仲胺类残留溶剂，如二乙胺，三乙胺，异丙胺等的测定。
附图说明
图1为WELCH Ultimate AQ-C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)，0.02mol/L KH2PO4(磷酸调pH3.0±0.1)为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱，柱温30℃，检测波长348nm，流速1.0ml/min，进样量20μl色谱条件下的对照品HPLC图。图1中的色谱峰为叔丁胺衍生物的色谱峰，保留时间约10min。
图2为线性试验项下叔丁胺在限度浓度及200％限度之间，峰面积对浓度进行线性回归的线性图；
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而用于限制本发明的范围，下例实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
以下为实施例中所涉及的仪器、样品、对照品、试剂及其色谱条件：
1.仪器：
天平：METTLER XS105DU；
Sartorius BSA224S
液相色谱仪：LC2030CDplus。
2.样品：
盐酸阿罗洛尔：成都苑东生物有限公司；批号20200901；分子量408.00。
3.对照品：
叔丁胺：成都科隆化学品有限公司；批号2019070101；纯度：≥99.0％。
4.试剂
邻羟基苯甲醛：阿拉丁生化；批号B2014005；纯度：98％。
氢氧化钠：成都科隆化学品有限公司；批号：2020050601；纯度：≥98.0％。
实施例1
A、供试品衍生：取盐酸阿罗洛尔样品50mg至25ml容量瓶，加甲醇10mL溶解，加0.1mol/L 氢氧化钠0.5ml和衍生剂(10％水杨醛-甲醇)1ml，在60℃水浴中衍生30min，取出放冷，加甲醇稀释至刻度；
B、对照品衍生：取叔丁胺对照品适量，加甲醇稀释制成50μg/ml溶液；取上述溶液1ml 置25ml容量瓶，加甲醇10mL、0.1mol/L氢氧化钠0.5ml和衍生剂(10％水杨醛-甲醇)1ml，在60℃水浴中衍生30min，取出放冷，加甲醇稀释至刻度；
C、取上述两种溶液，分别精密量取20μl，注入液相色谱仪中，以十八烷基键合硅胶(WELCH Ultimate AQ-C18，5μm，4.6×250mm)为填料，柱温为30℃，检测波长为348nm，0.02mol/L KH2PO4(磷酸调pH3.0±0.1)为流动相A，乙腈为流动相B，按下表所示梯度洗脱，流速为1.0ml/min；
| T(min) | A％ | B％ |
| 0 | 75 | 25 |
| 20 | 75 | 25 |
| 21 | 20 | 80 |
| 30 | 20 | 80 |
| 31 | 75 | 25 |
| 40 | 75 | 25 |
D、记录色谱图中叔丁胺衍生物的峰面积，按外标法计算供试品中叔丁胺的量；
计算公式
式中：
A样-----供试品溶液的色谱图中获得残留的峰面积。
A对-----对照品溶液的色谱图中获得残留的峰面积。
M对-----对照品称样量(mg)。
M样-----供试品称样量(mg)。
实施例2方法学验证
2.1.专属性试验
取空白溶剂和其它待测溶剂(DMF、DMSO、冰乙酸、二氯甲烷、丙酮、甲醇和异丙醇)，按拟定色谱条件衍生后进行检测，记录色谱图。
试验结果表明，空白溶剂和其它待测溶剂(DMF、DMSO、冰乙酸、二氯甲烷、丙酮、甲醇和异丙醇)在叔丁胺出峰位置无干扰，表明专属性良好。
2.2.定量限试验
取叔丁胺适量，精密称定，用甲醇溶解并逐级稀释后，按拟定方法衍生后测定，记录色谱图，取信噪比约为10:1的溶液所对应的绝对进样量作为定量限。试验结果见下表。
定量限试验结果
由上述试验结果可知，当样品溶液浓度为2mg/mL，进样量为20μL时，拟定方法下的叔丁胺定量限相当于限度的百分比远低于限度的30％，定量限溶液连续进样6次峰面积RSD小于15％。
2.3.检测限试验
取叔丁胺适量，精密称定，用甲醇溶解并逐级稀释后，按拟定方法衍生后测定，记录色谱图，取信噪比约为3:1的溶液所对应的绝对进样量作为检测限。试验结果见下表。
检测限试验结果
由上述试验结果可知，当样品溶液浓度为2mg/mL，进样量为20μL时，拟定方法下检测限相当于限度的百分比远低于限度的10％。
2.4.准确性试验
按拟定方法制备供试品溶液及对照品溶液，另制备限度浓度50％、100％及150％的加标供试品溶液，各浓度平行制备3份，按拟定色谱条件测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算叔丁胺的含量，并计算各加标供试品中叔丁胺的回收率。试验结果如下。
准确度试验结果
准确度试验结果表明：在3个加标浓度共9份加标供试品溶液中，叔丁胺的回收率在 97.81％～99.52％之间，平均值为98.7％，RSD为0.6％。在拟定的方法下，叔丁胺能被准确回收，该方法准确度良好。
2.5.重复性试验
平行制备6份100％加标供试品溶液，按拟定的条件衍生后进行测定，分别以6份样品中叔丁胺的加样回收率的平均值及RSD来评价方法的精密度。试验结果如下。
重复性试验结果
由上表结果可知，6份供试品溶液中，叔丁胺的回收率在98.45％～99.57％范围内，平均值为99.1％，RSD为0.4％，实验结果证明该方法重复性较好。
2.6.中间精密度
由不同实验人员，按重复性项下的方式平行制备6份加标供试品溶液，于不同时间、以相同的条件衍生后进行测定，计算每份加标供试品中叔丁胺的回收率，结果如下。
中间精密度检测结果
试验结果显示：12份100％加样回收供试品溶液中，叔丁胺的回收率应在97.48％～99.86％范围内，平均值为98.6％，RSD为0.9％。实验结果证明该方法的精密度良好。
2.7.线性
取叔丁胺适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成不同浓度对照品溶液，按拟定方法衍生后测定，记录色谱图，以峰面积对浓度进行线性回归，线性图如图2。
线性验证结果
线性试验表明：叔丁胺在限度浓度及200％限度之间，峰面积对浓度进行线性回归，线性回归系数r为0.9999，方程截距均小于100％限度浓度水平所对应的峰面积的25％。表明在拟定的方法下，叔丁胺浓度与峰面积均呈良好的线性关系。
2.8.耐用性试验
将拟定的色谱条件(以下简称原条件)中的重要参数做细微调整，形成一系列耐用性考察色谱条件。考察色谱条件对供试品及加标供试品溶液进行测定，计算加标供试品中叔丁胺的回收率，将各耐用性条件下所测得的值与原条件相比较。
耐用性考察色谱条件参数
耐用性考察结果-回收率
结果表明在原色谱条件基础上，衍生时间变动±10min，衍生温度±10℃、流速变动±0.1 (mL/min)、柱温变动±5℃、pH变动±0.1，叔丁胺的回收率在96.65％～101.15％范围内，平均值为99.0％，RSD为1.2％。上述结果表明色谱条件的参数在上述范围内变动时，对检测结果无影响，该方法的耐用性良好。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种盐酸阿罗洛尔原料药中叔丁胺残留量的分析方法，其特征在于，该分析方法包括以下步骤：
第一步：盐酸阿罗洛尔样品用甲醇溶解后置容量瓶中，加入甲醇、氢氧化钠和10％水杨醛-甲醇进行衍生化反应，置水浴中保温，取出放冷后，用甲醇稀释至所需浓度；
第二步：取叔丁胺对照品，用甲醇稀释至所需浓度后，置于容量瓶中，加入甲醇、氢氧化钠和10％水杨醛-甲醇进行衍生化反应，置水浴中保温，取出放冷后，用甲醇稀释至所需浓度；
第三步：取上述第一步和第二步得到的两种溶液，分别精密量取适量，注入高效液相色谱仪中，色谱条件为：
以十八烷基键合硅胶为填料，以0.02mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相A，用磷酸调节pH值至3.0±0.1，乙腈为流动相B，按下表梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为348nm；
第四步：记录色谱图中叔丁胺胺衍生物的峰面积，按外标法计算供试品中叔丁胺衍生物的残留。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，该分析方法包括以下步骤：
第一步：取盐酸阿罗洛尔样品50mg至25ml容量瓶，加甲醇10mL溶解，加0.1mol/L氢氧化钠0.5ml和10％水杨醛-甲醇1ml，在60℃水浴中衍生30min，取出放冷，加甲醇稀释至刻度；
第二步：取叔丁胺对照品适量，加甲醇稀释制成50μg/ml叔丁胺溶液；取所述叔丁胺溶液1ml置25ml容量瓶，加甲醇10mL、0.1mol/L氢氧化钠0.5ml和10％水杨醛-甲醇1ml，在60℃水浴中衍生30min，取出放冷，加甲醇稀释至刻度；
第三步：取上述第一步和第二步得到的两种溶液，分别精密量取20μl，注入液相色谱仪中，以十八烷基键合硅胶为填料，所述十八烷基键合硅胶为WELCH UltimateAQ-C18，5μm，4.6×250mm，柱温为30℃，检测波长为348nm，0.02mol/LKH2PO4为流动相A，用磷酸调节pH值至3.0±0.1，乙腈为流动相B，按下表梯度洗脱，流速为1.0ml/min；
第四步：记录色谱图中叔丁胺衍生物的峰面积，按外标法计算供试品中叔丁胺的残留。
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| R.SRIKANTH等.DEVELOPMENT AND VALIDATION OF RP-HPLC PRE-COLUMN DERIVATISATION FOR THE TRACE LEVEL DETERMINATION OF TERTBUTYLAMINE IN TIGECYCLINE DRUG SUBSTANCE.《International Journal of Pharma and Bio Sciences》.2013,第4卷(第2期),第524页. * |
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