CN114410480A - 一种无孢香菇菌株QH340及其Indel标记指纹图谱鉴定方法 - Google Patents

一种无孢香菇菌株QH340及其Indel标记指纹图谱鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种无孢香菇菌株QH340及其Indel标记指纹图谱鉴定方法，属于食用菌技术领域。本发明提供的香菇中温偏低型无孢菌株QH340其典型表型特征菌盖底部无菌褶形成，且无孢子产生，减少孢子对环境造成污染，降低了因吸入性孢子引起的呼吸道疾病的发生；同时，针对该香菇品种构建InDel标记指纹图谱，与目前通过国家品种审定的其他品种以及常用栽培品种都能特异性的区分开，可用于QH340菌株的鉴定，因此具有优异且广泛的实际应用之价值。

Description

一种无孢香菇菌株QH340及其Indel标记指纹图谱鉴定方法
技术领域
本发明属于食用菌技术领域，具体涉及一种无孢香菇菌株QH340及其Indel标记指纹图谱鉴定方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
中国是世界上最早进行香菇人工栽培的国家，栽培历史已有800多年，目前香菇是国内栽培最广、产量最高的菇种。2014年以来，我国食用菌总产量平稳增长，2020年12月，中国食用菌协会发布《2019年度全国食用菌统计调查结果分析》，该调查会对全国27个省、自治区、直辖市(不含西藏、宁夏、青海、海南和港澳台等省区)的统计调查，结果显示，2019年全国食用菌总产量3933.87万吨，同比增长3.8％。香菇依然是2019年产量最大的品种，全年总产量为1151.9万吨，是目前仅有的总产量突破1000万吨的食用菌。
随着人口老龄化进程的加剧和劳动力成本的提高，香菇栽培由传统模式向工厂化模式的转型升级。香菇目前尚不能实现工厂化出菇的主要原因在于其多潮出菇的特性，不能像金针菇那样单潮集中出菇采收，一个生产周期通常出4-5潮菇，且出菇不集中。并且，市场上可见的香菇菌株均为有孢菌株，栽培过程中孢子弹射对广大菇农造成呼吸系统危害，不仅对人体有过敏反应，大量孢子对环境而言是一种飞尘垃圾。其次，传统香菇品种的出菇需要温差、湿差、光照及机械震动等多方面的刺激才能实现，这些措施往往是个性化的，很多情况下是靠经验，很难有统一的标准化、精准化的管理措施。因此，要想实现香菇工厂化生产，必须采用具有特殊生物学特性的香菇品种。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明提供一种无孢香菇菌株QH340及其Indel标记指纹图谱鉴定方法。该香菇品种典型表型特征菌盖底部无菌褶形成，因此无孢子产生，从而减少孢子对环境造成污染，降低了因吸入性孢子引起的呼吸道疾病的发生，同时该香菇出菇产量高，两潮产量可达500-700g，适合工厂化培养和生产，因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种香菇(Lentinus edodes)无孢菌株QH340，该菌株已于2021年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.21954。
所述香菇(Lentinus edodes)QH340与常规香菇相比，菌盖底部无菌褶形成，且无孢子产生，从而有效减少孢子对环境造成污染，降低了因吸入性孢子引起的呼吸道疾病的发生；同时，采用适宜的栽培方法，从而为该品种提供一种工厂化栽培技术参考标准，使得工厂化生产经济可行，从而有效提高香菇生产效益。
本发明的第二个方面，提供上述香菇(Lentinus edodes)QH340的鉴定方法，所述鉴定方法包括：采用InDel标记指纹图谱进行鉴定。
本发明通过分子标记指纹图谱技术，建立了一种简便、快速、可靠的香菇QH340菌种特异性鉴定方法。采用的InDel标记通过香菇基因组测序及重测序开发而来，与ISSR，RAPD标记相比，具有稳定性高，重复性好的特点；与SSR标记相比，检测方法简单，无需制作PAGE凝胶电泳检测，仅需普通的琼脂糖凝胶电泳即可检测。指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，更是极大的缩短了检测时间，提高了检测准确性。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次获得一种无孢菌株QH340，QH340品种的典型表型特征菌盖底部无菌褶形成，且无孢子产生，减少孢子对环境造成污染，降低了因吸入性孢子引起的呼吸道疾病的发生；同时，针对该香菇品种构建InDel标记指纹图谱，与目前通过国家品种审定的其他品种以及常用栽培品种都能特异性的区分开，可用于QH340菌株的鉴定，因此具有优异且广泛的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为香菇正常子实体与QH340的菌褶部位形态图。
图2为本发明实施例2中香菇中温偏低型无孢菌株QH340的指纹图谱。
图3为本发明实施例2中香菇国审品种、主栽品种的指纹图谱。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，市场上可见的香菇菌株均为有孢菌株，栽培过程中孢子弹射对广大菇农造成呼吸系统危害，不仅对人体有过敏反应，大量孢子对环境而言是一种飞尘垃圾。其次，传统香菇品种的出菇需要温差、湿差、光照及机械震动等多方面的刺激才能实现，这些措施往往是个性化的，很多情况下是靠经验，很难有统一的标准化、精准化的管理措施。
有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种香菇(Lentinus edodes)中温偏低型无孢菌株QH340，该菌株已于2021年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCCNo.21954。
所述香菇(Lentinus edodes)QH340与常规香菇相比，菌盖底部无菌褶形成，且无孢子产生，从而有效减少孢子对环境造成污染，降低了因吸入性孢子引起的呼吸道疾病的发生；该品种是通过单孢杂交的方法选育获得的杂交菌株。
配合采用适宜的培养方法，从而为该品种提供一种工厂化栽培技术参考标准，该香菇品种两潮产量500-700g，使得工厂化生产经济可行，从而有效提高香菇生产效益。
因此，本发明的又一具体实施方式中，提供上述香菇(Lentinus edodes)QH340的选育过程，所属的选育过程包括亲本选配、单孢分离、交配型鉴定、杂交配对、杂交后代出菇筛选、一致性测试和稳定性测试。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述香菇(Lentinus edodes)QH340的鉴定方法，所述鉴定方法包括：采用InDel标记指纹图谱进行鉴定。
本发明的又一具体实施方式中，所述InDel标记指纹图谱其由10对Indel标记组成，其是基于香菇(Lentinus edodes)QH340基因组插入/缺失片段开发的Indel标记引物，10对Indel标记引物序列(5’-3’)如下：
QHID_fp002
正向引物：CTTTGGTTTTCTGCGTGCTT(SEQ ID NO.1)；
反向引物：TCCTGGAAGAAGATTCATTGG(SEQ ID NO.2)；
QHID_fp009
正向引物：ATGGTGGTGTTGATCACGTC(SEQ ID NO.3)；
反向引物：GTTCCACCAGAGCCGAAATA(SEQ ID NO.4)；
QHID_fp024
正向引物：CCGCAATCAACAGTAGCTCA(SEQ ID NO.5)；
反向引物：GTCAACCAGTGACCCGATTT(SEQ ID NO.6)；
QHID_fp045
正向引物：AACAAGGGCTGTGAATCCTG(SEQ ID NO.7)；
反向引物：CTGCAAAACCTGGAAATTGG(SEQ ID NO.8)；
QHID_fp110
正向引物：TCACGATACATTCGACCTCC(SEQ ID NO.9)；
反向引物：GGACAATTGACTAATATGGC(SEQ ID NO.10)；
QHID_fp114
正向引物：AAACTTGGCCGAGAAATCGG(SEQ ID NO.11)；
反向引物：TGACGGCTGATTCATCTGTC(SEQ ID NO.12)；
QHID_fp120
正向引物：TTTCTTGTAGGGACGTAGCC(SEQ ID NO.13)；
反向引物：TTCGAACAGCAATGGCAAGG(SEQ ID NO.14)；
QHID_fp122
正向引物：GGAATGAGCAAGGAGACATC(SEQ ID NO.15)；
反向引物：TCCCTTTTCTTCACTGTCGG(SEQ ID NO.16)；
QHID_fp127
正向引物：TTTCAAAGTCCCTTGGTGCG(SEQ ID NO.17)；
反向引物：CACGATCCCTACGCTCTTTC(SEQ ID NO.18)；
QHID_fp137
正向引物：CCAGGATCTGGTTAAACTGC(SEQ ID NO.19)；
反向引物：TGAACACAAGGCAATTCCGC(SEQ ID NO.20)。
本发明的又一具体实施方式中，所述鉴定方法包括：采用上述10对Indel标记引物对待测香菇菌种进行Indel标记扩增，将得到的带型与上述香菇(Lentinus edodes)QH340菌种的带型进行对照，与该带型一致的即为香菇(Lentinus edodes)QH340；其中香菇(Lentinus edodes)QH340的带型编号组合为：(12)(12)1111(12)1(12)(23)。经实验证明，该组合在所检测的118个香菇菌株中具有专一性，能够区别鉴定国内主要国审菌株、主栽品种，其指纹图谱具备专一性。
本发明通过分子标记指纹图谱技术，建立了一种简便、快速、可靠的香菇QH340菌种特异性鉴定方法。采用的InDel标记通过香菇基因组测序及重测序开发而来，与ISSR，RAPD标记相比，具有稳定性高，重复性好的特点；与SSR标记相比，检测方法简单，无需制作PAGE凝胶电泳检测，仅需普通的琼脂糖凝胶电泳即可检测。指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，更是极大的缩短了检测时间，提高了检测准确性。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述香菇(Lentinus edodes)QH340在工厂化栽培中的应用。本发明提供的香菇(Lentinus edodes)QH340，属于中温偏低型无孢香菇，其能够在工厂化栽培条件下进行培养、出菇，实现工厂化生产条件下的周年生产，提高香菇生产效益。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述香菇(Lentinus edodes)QH340的工厂化栽培方法，所述栽培方法包括：制棒、接种、培养和出菇。
本发明的又一具体实施方式中，所述制棒具体工艺方法包括：将香菇(Lentinusedodes)QH340栽培基质封装于栽培袋中，灭菌后即得；在本发明的一个具体实施方式中，菌棒棒重控制在2.2-2.4kg，菌棒灭菌具体条件为：在119℃下保持4-6h。
本发明的又一具体实施方式中，所述栽培基质包括木屑，优选为阔叶类木屑，木屑颗粒度控制为3-10mm，进一步的，所述木屑进行预湿堆置4-7天。
在本发明的一个具体实施方式中，所述香菇(Lentinus edodes)QH340栽培基质配比(干重)为：木屑74-84％、麦麸15-25％、石膏1％。调节总含水量为55-60％，优选为57-58％，pH为弱酸性至中性，优选pH为6-7。
所述接种工艺具体包括：待灭菌后的菌棒温度降至20-25℃时，接种香菇(Lentinus edodes)QH340菌种；在本发明的一个具体实施方式中，每一个菌棒接种2-6个接种穴，优选为4个，每个接种穴接菌种20-25g。
所述培养具体方法包括：由于QH340菌丝生长温度20-28℃，最适生长温度为23-25℃，因此将培养环境温度调控在24-27℃，棒温维持在25±1℃，空气相对湿度50-70％，CO2浓度2000-6000ppm，避光培养。
本发明的又一具体实施方式中，所述培养方法还包括：菌丝蔓延至菌棒表面1/2-2/3时沿菌落边缘进行一次刺孔操作，每棒刺孔数量16-22个，刺孔深度2-3cm，直径2-4mm；培养至菌棒表面形成瘤状凸起并变软后进行二次刺孔操作，每棒刺孔数量40-50个，刺孔深度5-7cm，孔径3-5mm；二次刺孔后增加持续24h强度为500-1000lux散射光照，待菌棒周身转色成褐色，培养菌龄在100-110天之间时，菌棒达到生理成熟。
本发明的又一具体实施方式中，所述出菇的具体操作方法包括：对成熟后的菌棒进行注水，补水至初始菌棒重量的88-95％；注水完成后，进行催蕾，出菇房温度10-25℃之间，昼夜4-10℃(优选为6-10℃)的温差，CO2浓度800-1200ppm，空间湿度85-90％，催蕾3-5天后菇蕾形成；随后进行疏蕾操作，每棒保留菇蕾10-16个，疏蕾后出菇房温度调控10-15℃维持2天；随后出菇房温度控制在10-25℃之间，12-20℃之间最佳，CO2浓度600-800ppm，空间湿度85-90％，子实体生长5-10天，菌盖直径5cm左右或者菌幕形成后进行采收，一潮采收期5-10天，可采收300-400g鲜菇；随后菌棒进入休养期，出菇房内温度提升至23-26℃，湿度70-80％，CO2浓度2000ppm以内，菌棒休养15天；通过注水的方式将菌棒重量补充至初始棒重的75％-85％，进入二潮出菇，催蕾、出菇条件同一潮，二潮可采收200-300g鲜菇。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是，下述实施例中使用的香菇(Lentinus edodes)无孢菌株QH340由山东七河生物科技股份有限公司选育获得，并已于2021年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.21954。
实施例1
一种无孢香菇菌株QH340的选育过程，包括：
(1)亲本选配：选择亲本菌株七河2号和L808菌株，其七河2号品种具备菌龄短、高产、大型子实体等优点，L808具备菇质硬，子实体肉质肥厚等优点，两亲本优良性状互补。
(2)单孢分离：菌株七河2号与L808进行单孢分离，获得七河2号孢子单核体414株，获得L808孢子单核体396株；
(3)交配型鉴定：经交配型鉴定其L808的孢子单核的交配型为A2B2、A3B3、A2B3、A3B2，其七河2号孢子单核体的交配型为A1B1、A2B2、A1B2、A2B1。
(4)杂交配对：根据孢子单核体的交配型鉴定结果，进行杂交组配获得334个杂交菌株。344个杂交菌株经电子显微镜镜检，均具有索状联合，为七河2号与L808的杂交后代。
(5)杂交后代出菇筛选：将334个杂交后代按照香菇常规的栽培方式制作成香菇菌棒，每个杂交后代设3个重复，经出菇考察农艺性状，发现QH340菌株菌盖底部无菌褶形成，且无孢子产生，如图1所示，香菇(Lentinus edodes)QH340与正常香菇相比，菌盖底部无菌褶形成，且无孢子产生，从而有效减少孢子对环境造成污染，降低了因吸入性孢子引起的呼吸道疾病的发生。
(6)一致性测试：2018年春季在试验田设2个播种区，每个小区设计完全按照随机区组排列，分别对每个小区的50个菌棒(50株作物)进行田间观察，生产周期平均为160天，其中发菌期42天，后熟转色期65天，出菇期53天，98％以上菌棒均可正常现蕾出菇，出菇整齐，畸形菇极少。如表1所示，出菇率统计表。
表1出菇率统计表
分区 棒数 现蕾棒数 出菇率
区1 50 49 98％
区2 50 49 98％
总 100 98 98％
(7)稳定性测试：从2017年至2019年分别设置了小试、复筛、中试、大试栽培验证，实验菌株为QH340，对照菌株为七河2号，常规长棒设施化栽培方法。在出菇阶段统计出菇率、等级率等数据，进行对比分析，QH340在出菇率和等级率表现稳定，并且与主栽品种七河2号没有明显差异。如表2所示，出菇率统计信息表，如表3所示，一级菇比例统计信息表。
表2出菇率统计信息表
试验类型 小试 复筛 中试 大试
QH340 100％ 100％ 98.44％ 98.33％
七河2号 100％ 100％ 98.00％ 98.51％
表3一级菇比例统计信息表
试验类型 小试 复筛 中试 大试
QH340 53.24％ 49.83％ 60.27％ 43.5％
七河2号 52.38％ 51.69％ 57.22％ 46.33％
实施例2
一、香菇菌株QH340以及部分国内审定或者主栽品种的InDel指纹图谱鉴定
为了实现香菇菌株的Indel指纹图谱鉴定方法建立，运用包括QH340菌株在内的156个香菇品种构建指纹图谱方法进行了研究。本实施例采用82对香菇Indel引物对156个香菇菌株进行扩增，通过带型比对，确定了10对具有良好重复性的Indel引物，这10对引物能够区分156株香菇菌株中的118株，多态性较高。
所述的10对Indel标记具体为：
QHID_fp002正向引物：CTTTGGTTTTCTGCGTGCTT；
反向引物：TCCTGGAAGAAGATTCATTGG；
QHID_fp009正向引物：ATGGTGGTGTTGATCACGTC；
反向引物：GTTCCACCAGAGCCGAAATA；
QHID_fp024正向引物：CCGCAATCAACAGTAGCTCA；
反向引物：GTCAACCAGTGACCCGATTT；
QHID_fp045正向引物：AACAAGGGCTGTGAATCCTG；
反向引物：CTGCAAAACCTGGAAATTGG；
QHID_fp110正向引物：TCACGATACATTCGACCTCC；
反向引物：GGACAATTGACTAATATGGC；
QHID_fp114正向引物：AAACTTGGCCGAGAAATCGG；
反向引物：TGACGGCTGATTCATCTGTC；
QHID_fp120正向引物：TTTCTTGTAGGGACGTAGCC；
反向引物：TTCGAACAGCAATGGCAAGG；
QHID_fp122正向引物：GGAATGAGCAAGGAGACATC；
反向引物：TCCCTTTTCTTCACTGTCGG；
QHID_fp127正向引物：TTTCAAAGTCCCTTGGTGCG；
反向引物：CACGATCCCTACGCTCTTTC；
QHID_fp137正向引物：CCAGGATCTGGTTAAACTGC；
反向引物：TGAACACAAGGCAATTCCGC。
本实施例进一步的，重新挑选了19个香菇品种对上述Indel标记指纹图谱的区分效果进行了验证。
1.鉴定菌株：QH340、申香4号、武香1号、申香215、Cr62、L135、广香51号、华香8号、申香12号、香杂26号、闽丰1号、菌兴8号、华香5号、L952、赣香1号、森源8408、香九、森XR1、L26共19个菌株；
2.菌丝培养：将香菇19个待测菌种分别转接到PDA(马铃薯葡萄糖)培养皿中，23℃～25℃下避光培养10-15d，用小菌丝；
3.基因组DNA的提取：上述19个菌株用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度为20-30ng/μL；
4.InDel分子标记的检测：对上述提取的DNA进行InDel标记的PCR扩增，总体积20μL，包括：PCR反应mix 10uL，InDel标记正向引物和反向引物各1μL(引物浓度10μmol/L)，模板DNA 2μL，ddH2O 6μL；
PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 45s，55-60℃ 45s，72℃ 30s，35个循环；72℃7min；10℃保存；
4.电泳检测，结果统计。
预计入核酸染料(0.5μL/L)的琼脂糖凝胶，浓度为3％；上述PCR扩增产物10μL，DNA分子量对照D2000bp DNA ladder以及PCR空白对照点样；电泳缓冲液为1×TBE，固定电压110v，电泳4h，凝胶成像系统照相。
本实施例构建香菇中温偏低型无孢菌株QH340的InDel标记指纹图谱，该指纹图谱由10对InDel标记特异性等位片段的组合而成。源于香菇测序和重测序开发的InDel引物(等位片段PCR扩增信息见表4，PCR扩增结果见图2)对其基因组进行扩增时，分别产生(12)(12)1111(12)1(12)(23)的等位片段组合，这样的DNA等位片段的组合扩增组合使QH340菌株区别于其他156个香菇菌种。图2中M是DL2000 DNA Marker；1：引物QHID_fp002扩增带型，菌株QH340扩增条带为1，2；2：引物QHID_fp009扩增带型，菌株QH340扩增条带为1，2；3：引物QHID_fp024扩增带型，菌株QH340扩增条带为1；4：引物QHID_fp045扩增带型，菌株QH340扩增条带为1：5：引物QHID_fp110扩增带型，菌株QH340扩增条带为1；6：引物QHID_fp114扩增带型，菌株QH340扩增条带为1；7：引物QHID_fp120扩增带型，菌株QH340扩增条带为1，2；8：引物QHID_fp122扩增带型，菌株QH340扩增条带为1；9：引物QHID_fp127扩增带型，菌株QH340扩增条带为1，2；10：引物QHID_fp137扩增带型，菌株QH340扩增条带为2，3；N：空白对照。
表4 InDel标记扩增信息
Figure BDA0003436997340000101
所述10对InDel标记引物具体为：
QHID_fp002
正向引物：CTTTGGTTTTCTGCGTGCTT(SEQ ID NO.1)；
反向引物：TCCTGGAAGAAGATTCATTGG(SEQ ID NO.2)；
QHID_fp009
正向引物：ATGGTGGTGTTGATCACGTC(SEQ ID NO.3)；
反向引物：GTTCCACCAGAGCCGAAATA(SEQ ID NO.4)；
QHID_fp024
正向引物：CCGCAATCAACAGTAGCTCA(SEQ ID NO.5)；
反向引物：GTCAACCAGTGACCCGATTT(SEQ ID NO.6)；
QHID_fp045
正向引物：AACAAGGGCTGTGAATCCTG(SEQ ID NO.7)；
反向引物：CTGCAAAACCTGGAAATTGG(SEQ ID NO.8)；
QHID_fp110
正向引物：TCACGATACATTCGACCTCC(SEQ ID NO.9)；
反向引物：GGACAATTGACTAATATGGC(SEQ ID NO.10)；
QHID_fp114
正向引物：AAACTTGGCCGAGAAATCGG(SEQ ID NO.11)；
反向引物：TGACGGCTGATTCATCTGTC(SEQ ID NO.12)；
QHID_fp120
正向引物：TTTCTTGTAGGGACGTAGCC(SEQ ID NO.13)；
反向引物：TTCGAACAGCAATGGCAAGG(SEQ ID NO.14)；
QHID_fp122
正向引物：GGAATGAGCAAGGAGACATC(SEQ ID NO.15)；
反向引物：TCCCTTTTCTTCACTGTCGG(SEQ ID NO.16)；
QHID_fp127
正向引物：TTTCAAAGTCCCTTGGTGCG(SEQ ID NO.17)；
反向引物：CACGATCCCTACGCTCTTTC(SEQ ID NO.18)；
QHID_fp137
正向引物：CCAGGATCTGGTTAAACTGC(SEQ ID NO.19)；
反向引物：TGAACACAAGGCAATTCCGC(SEQ ID NO.20)。
所述10对InDel标记等位片段的特异编号组合为：(12)(12)1111(12)1(12)(23)。
通过10对InDel引物对香菇QH340以及部分国内审定品种菌株进行PCR扩增，通过对比DNA分子量对照D2000bp DNA ladder可确定各InDel标记对应的等位片段的数量和相对分子量大小，与10个InDel标记标准产物大小比较后，可确定19个鉴定菌株的指纹图谱如图3所示，每个菌株的鉴定结果均具备特异性。
实施例3
一种无孢香菇菌株QH340的栽培方法，包括：
(1)制棒：选择阔叶类木屑作为QH340菌株的主要栽培基质，木屑颗粒度3-10mm之间，木屑进行预湿堆置7天。栽培基质配比(干重)为木屑84％、麦麸15％、石膏1％，调至总含水量58.5％，pH7，充分搅拌40min。培养料采用折径15cm、长度55cm、厚度0.006-0.008mm的聚乙烯栽培袋装成长度43±0.5cm的菌棒，装好后的菌棒棒重量在2300±50g之间，菌棒在119℃下保持6h灭菌。
(2)接种：灭菌后的菌棒温度降至25℃时，接种QH340菌种，每棒接种4个接种穴，每个接种穴接菌种25g。
(3)培养：QH340培养阶段将培养环境温度调控在24-27℃，棒温维持在25±1℃，空气相对湿度50-70％，CO2浓度低于6000ppm，避光培养。菌丝蔓延至菌棒表面1/2时沿菌落边缘进行一次刺孔操作，每棒刺孔数量16个，刺孔深度2.5cm，直径3mm；培养至菌棒表面形成瘤状凸起并变软后进行二次刺孔操作，每棒刺孔数量55个，刺孔深度5.5cm，孔径4mm。二次刺孔后增加持续24h强度为600lux散射光照，待菌棒周身转色成褐色，培养菌龄在105天时，菌棒达到生理成熟。
(4)出菇：菌棒成熟后，转移至出菇房，对菌棒进行注水，补水至初始菌棒重量的88-95％。注水完成后，进行催蕾，出菇房温度控制在10-25℃之间，昼夜4-10℃的温差，CO2浓度低于1200ppm，空间湿度控制在85-90％，催蕾5天后菇蕾逐渐形成。随后进行疏蕾操作，每棒保留菇蕾10-16个，疏蕾后出菇房温度调控10-15℃维持2天。随后出菇房温度控制在12-20℃之间，CO2浓度低于800ppm，空间湿度维持85-90％，菇蕾形成后子实体继续生长7天，菌盖直径4-5cm或者菌幕形成后进行采收，一潮采收期8天，采收鲜菇平均单产308g。随后菌棒进入休养期，出菇房内温度提升至23-26℃，湿度70-80％，CO2浓度2000ppm以内，菌棒休养15天。通过注水的方式将菌棒重量补充至初始棒重的75％-85％，进入二潮出菇，催蕾、出菇条件同一潮，二潮采收245g鲜菇(平均单棒产量)。至此，QH340菌株的两潮产量553g。如图1所示，香菇(Lentinus edodes)QH340与正常香菇相比，菌盖底部无菌褶形成，且无孢子产生，从而有效减少孢子对环境造成污染，降低了因吸入性孢子引起的呼吸道疾病的发生。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东七河生物科技股份有限公司
<120> 一种无孢香菇菌株QH340及其Indel标记指纹图谱鉴定方法
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctttggtttt ctgcgtgctt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcctggaaga agattcattg g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggtggtgt tgatcacgtc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gttccaccag agccgaaata 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccgcaatcaa cagtagctca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtcaaccagt gacccgattt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aacaagggct gtgaatcctg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctgcaaaacc tggaaattgg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tcacgataca ttcgacctcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggacaattga ctaatatggc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aaacttggcc gagaaatcgg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgacggctga ttcatctgtc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tttcttgtag ggacgtagcc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ttcgaacagc aatggcaagg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggaatgagca aggagacatc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tcccttttct tcactgtcgg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tttcaaagtc ccttggtgcg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cacgatccct acgctctttc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ccaggatctg gttaaactgc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tgaacacaag gcaattccgc 20

Claims (5)

1.一种香菇(Lentinus edodes)QH340，该菌株已于2021年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.21954。
2.权利要求1所述香菇(Lentinus edodes)QH340，其特征在于，子实体菌盖底部无菌褶形成，且无孢子产生。
3.权利要求1所述的香菇(Lentinus edodes)QH340的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括：采用InDel标记指纹图谱进行鉴定。
4.如权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述InDel标记指纹图谱由10对Indel标记组成，其是基于香菇(Lentinus edodes)QH340基因组插入/缺失片段开发的Indel标记引物，10对Indel标记引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20所示。
5.如权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括：采用所述10对Indel标记引物对待测香菇菌种进行Indel标记扩增，将得到的带型与香菇(Lentinus edodes)QH340菌种的带型进行对照，与该带型一致的即为香菇(Lentinus edodes)QH340；其中香菇(Lentinus edodes)QH340的带型编号组合为：(12)(12)1111(12)1(12)(23)。
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