CN114384060A - 一种水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，包括：S1)确定氟甲喹特征位移；S2)水产品处理：称取适量水产品待检样品，加入提取液1和提取液2，涡旋或超声振荡后离心，取上清液待用；S3)净化：在上清液中加入碱液调节溶液pH为弱碱性，再加入有机试剂，涡旋振荡后离心；S4)液液萃取：取净化后的有机溶剂层于瓶中，加入碱性溶液，静置分层；S5)拉曼检测：取上述萃取液与纳米金属粒子、辅助增强试剂混合均匀后进行检测。本发明通过简单前处理结合金属纳米粒子的表面增强拉曼散射效应，满足氟甲喹在水产品中简单、快速、廉价、高灵敏度等方面的检测需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种水产品检测方法，尤其涉及一种水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法。
背景技术
水产品富含多种营养物质，蛋白质含量尤其丰富，是人体重要的优质动物性蛋白来源之一。由于水产品自身的蛋白质、水分含量较高以及特殊的养殖条件，使水产品极易滋生细菌、不易保存。因此水产品在养殖和运输过程中用药种类和数量较多。氟甲喹是人工合成的第二代喹诺酮类动物专用抗菌药，主要用于畜禽细菌性呼吸道病，对动物细菌性的疾病有很好疗效。然而一些不法商贩为了追求养殖效益滥用药物，造成氟甲喹在动物体内残留超标。已有研究发现高剂量氟甲喹可引起大鼠胚胎发育畸变和小鼠肝癌，长期食用具有氟甲喹药物残留的食品，可能对人体健康造成潜在危害。随着水产品的养殖规模和消费能力不断扩大，建立一种高效、准确、快速的氟甲喹检测方法对水产品质量安全监管有着重要意义。
目前，针对氟甲喹等喹诺酮类抗菌物多采用高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法，其中液相色谱串联质谱法最为常用，这两种方法检测成本高、仪器设备昂贵，操作人员需要经过专业培训，不适用于大规模现场检测。拉曼光谱法由于其自身的独特优势，只需通过简单的前处理对目标物进行提取净化，还可以通过目标化合物的拉曼特征位移对待测目标物进行准确定性，因此在食品安全监管领域具有巨大潜力。基于此，本发明设计了一种基于表面增强拉曼光谱法检测水产品中氟甲喹的快速方法来解决上述问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，能够现场采集水产品样本，并通过简单前处理结合金属纳米粒子的表面增强拉曼散射效应，来满足氟甲喹在水产品中简单、快速、廉价、高灵敏度等方面的检测需求。
本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，包括如下步骤：S1)确定氟甲喹特征位移：通过测试氟甲喹固体粉末以及液体标品，确定氟甲喹的拉曼特征峰位移；S2)水产品处理：称取适量水产品待检样品，加入提取液1和提取液2，涡旋或超声振荡后离心，取上清液待用；S3)净化：在上清液中加入一定量碱液调节溶液pH为弱碱性，再加入有机试剂，涡旋振荡后离心；S4)液液萃取：取净化后的有机溶剂层于瓶中，加入一定量碱性溶液，静置分层后，取碱性溶液层待用；S5)拉曼检测：取上述萃取液与纳米金属粒子、辅助增强试剂混合均匀后进行检测。
进一步地，所述步骤S1中的氟甲喹的拉曼特征峰位移为488、553、742、982、1341、1375cm-1。
进一步地，所述步骤S2中提取液1包括氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中一种，浓度为0.01-0.02mol/L，加入体积为2-3mL；所述提取液2为甲醇、乙腈和乙醇中一种，加入体积为1-2mL。
进一步地，所述步骤S2和步骤S3中离心旋转速度为4000-7000r/min，离心处理时间为2-5min。
进一步地，所述步骤S3中的碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中一种，浓度为0.10-0.12mol/L，加入体积为200-300μL。
进一步地，所述步骤S3中的有机溶剂为二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯中一种，加入体积为2-3mL。
进一步地，所述步骤S4的碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中一种，浓度为0.01-0.02mol/L，加入体积为300-500μL。
进一步地，所述步骤S5中的金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子。
进一步地，所述步骤S5中的辅助增强试剂为碱金属盐溶液，所述碱金属盐溶液为碘化钾、碘化钠或溴化钠。
进一步地，所述步骤S5包括：将待测液、纳米溶胶、碱金属盐溶液按体积比1～3：5～10：1混加入样品检测瓶中，混合均匀后，于拉曼样品检测池中，用便携式拉曼光谱仪进行检测。
本发明对比现有技术有如下的有益效果：本发明提供的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，对水产品肌肉组织中氟甲喹检测低限为0.5mg/kg，符合国标《GB31650-2019食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定中氟甲喹限量标准，20min内即可完成多个样品检测，极大的缩短了检测时间；同时本方法操作简单、试剂用量少，对环境和人体污染小、灵敏度高、易于操作、检测成本低。
附图说明
图1为本发明氟甲喹的固体粉末及标品系列浓度测信号图；
图2为本发明黑鱼中氟甲喹的加标检测信号图；
图3为本发明草虾中氟甲喹的加标检测信号图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。
拉曼光谱检测分析法是基于印度科学家C.V.拉曼(Raman)所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息。表面增强拉曼光谱(SERS)技术具有灵敏度高、快速分析及振动光谱等优势。由于不同物质是由不同分子结构组成的，即每种物质都有自己的拉曼“指纹”谱。本发明从氟甲喹自身化学性质出发，结合SERS技术特点设计了一种简单、易行的前处理方法，只需通过简单的液液提取即可完成水产品肌肉组织中氟甲喹样品制备，检测结果符合国标《GB 31650-2019食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定中氟甲喹限量要求。具体来说，本发明提供的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，包括如下步骤：
S1)确定氟甲喹特征位移：称取少量氟甲喹固体粉末进行常规拉曼检测，所述的氟甲喹固体粉末以及液体标品的纯度大于等于99.0％，配制10mg/kg氟甲喹标准溶液，加入纳米增强基底进行检测，对比两次实验结果确定氟甲喹拉曼特征位移；
S2)水产品处理：准确称取1-2g水产品肌肉组织样品，加入2-4mL碱性溶液作为提取液1，加入1-2mL有机溶剂作为提取液2，取上清液待用；离心旋转速度优选为4000-7000r/min，离心处理时间优选为2-5min；
S3)净化：在上清液中加入0.2-0.4mL碱液调节溶液pH为弱碱性，再加入2-4mL有机试剂，涡旋振荡后离心；离心旋转速度优选为4000-7000r/min，离心处理时间优选为2-5min；pH调整为碱性有利于将氟甲喹萃取到有机相中，提高萃取率，pH应大于8，优选为8-10。若pH小于8，氟甲喹不能完全萃取到有机相中，会导致后续上机浓度降低，测试信号偏弱；若pH大于10，则需增大碱液浓度或加入较多碱液，会使后续测试信号降低。
S4)液液萃取：取净化后的有机溶剂层于瓶中，加入一定量碱性溶液，静置分层后，取碱性溶液层待用；
S5)拉曼检测：取上述萃取液与纳米金属粒子、辅助增强试剂混合均匀后进行检测。
本发明提供的检测方法操作简单，对仪器设备要求低，检测准确度高，无需大量的有机溶剂及有毒试剂，对实验人员身体健康和自然环境不会造成伤害、检测时间短、成本低。检测结果符合市场监管部门快速筛查的检测要求。
本发明提供的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，所述步骤S2中提取液1包括氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中一种，浓度为0.01-0.02mol/L，加入体积为2-3mL；所述提取液2为甲醇、乙腈和乙醇中一种，加入体积为1-2mL；氟甲喹在水中溶解度差，因此需要在提取液中含有一些有机试剂提高氟甲喹溶解度，低浓度碱液可以提高氟甲喹提取效率，有利于提高后期氟甲喹测试信号；提取液1和提取液2相互配合，两者优选的体积比例2:1-3:1，可使目标物在检测中信号最优，最便于判别。
本发明提供的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，所述步骤S3中碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中一种，浓度为0.10-0.12mol/L，加入体积为200-300μL；有机溶剂包括二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯中的至少一种；所述步骤S4中的碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中一种，浓度为0.01-0.02mol/L，加入体积为300-500μL。
本发明提供的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，所述金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子，粒径优选为55nm；所述步骤S5中的辅助增强试剂为酸性状态下的碱金属盐溶液，包括碘化钾、碘化钠、溴化钠等，浓度为0.8-1.2mol/L；配置好的碱金属盐溶液使用前需将溶液pH调至酸性。比如在配制好的碱金属盐溶液中加入少许盐酸或硫酸，使溶液pH小于6即可。若pH大于7，溶液pH为中性或碱性后续氟甲喹信号下降明显，对检测不利。所述步骤S5包括：将待测液、纳米银溶胶、碘化钾溶液的体积比为1～3：5～10：1加入样品检测瓶中，混合均匀后，于拉曼样品检测池中，用便携式拉曼光谱仪进行检测。待测液、纳米溶胶、碘化钾溶液加入比例对后续拉曼信号有较大影响，加入太多金属溶胶会导致检测成本上升。另一方面三者加入比例不合适会使检测体系之间不能充分作用，比如被测目标物被大比例稀释，导致检测信号下降；或者纳米粒子团聚速度过快，使得检测信号不稳；进而影响后续拉曼特征峰强度，最终使得目标待测物不能检出。
实施例一
氟甲喹标准品进行测试，其步骤如下：
合成纳米银溶胶：取100mL 1mM硝酸银溶液加热至沸腾，加入2mL 1％柠檬酸三钠水溶液，持续反应30min后取出冷却后即为纳米银溶胶。
标准溶液配制：分别配置0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L系列浓度标准品。
检测：取100μL样品，再加入50μL酸化后碘化钾溶液，加入200μL银纳米粒子快速混匀，上机检测，检测结果为图1。
实施例二
对黑鱼中不同浓度加标的检测，其步骤如下：
标准品制备：配置浓度为10ppm的氟甲喹标准溶液。
样品加标及前处理：将黑鱼样品，以《GB2761-2017食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定限值点进行加标，使加标浓度符合国标限值要求。
取1g鱼样，加入2mL 0.01mol/L氢氧化钠溶液，再加入1mL乙腈，涡旋2min，4000rpm/min离心3min，取所有上清液，加入0.2mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，再加入2mL二氯甲烷，涡旋1min，4000rpm/min离心3min，取下层液体500μL，加入300μL 0.01mol/L氢氧化钠溶液，涡旋1min，静置分层。测定时，取100μL复溶液，再加入50μL 1mol/L碘化钾溶液，加入200μL银纳米粒子快速混匀，上机检测，检测结果为图2。
实施例三
采用实施例一中系列浓度的标准品，并采用相同的加标方法，对草虾样品进行加标、前处理和检测，检测结果为图3。
上述实施例检测过程中，样品的检测时间不超过20min，单次实验物料检测的成本在5～10元内。相对于传统的液质等检测方法，不仅快速，廉价，检测结果也满足各地海关口岸、市场监管部门的快速筛查的检测要求。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1)确定氟甲喹特征位移：通过测试氟甲喹固体粉末以及液体标品，确定氟甲喹的拉曼特征峰位移；
S2)水产品处理：称取适量水产品待检样品，加入提取液1和提取液2，涡旋或超声振荡后离心，取上清液待用；
S3)净化：在上清液中加入一定量碱液调节溶液pH为弱碱性，再加入有机试剂，涡旋振荡后离心；
S4)液液萃取：取净化后的有机溶剂层于瓶中，加入一定量碱性溶液，静置分层后，取碱性溶液层待用；
S5)拉曼检测：取上述萃取液与纳米金属粒子、辅助增强试剂混合均匀后进行检测。
2.如权利要求1所述的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S1中的氟甲喹的拉曼特征峰位移为488、553、742、982、1341、1375cm-1。
3.如权利要求1所述的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S2中提取液1包括氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中一种，浓度为0.01-0.02mol/L，加入体积为2-3mL；所述提取液2为甲醇、乙腈和乙醇中一种，加入体积为1-2mL。
4.如权利要求1所述的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S2和步骤S3中离心旋转速度为4000-7000r/min，离心处理时间为2-5min。
5.如权利要求1所述的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S3中的碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中一种，浓度为0.10-0.12mol/L，加入体积为200-300μL。
6.如权利要求1所述的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S3中的有机溶剂为二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯中一种，加入体积为2-3mL。
7.如权利要求1所述的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S4的碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中一种，浓度为0.01-0.02mol/L，加入体积为300-500μL。
8.如权利要求1所述的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S5中的金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子。
9.如权利要求1所述的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S5中的辅助增强试剂为碱金属盐溶液，所述碱金属盐溶液为碘化钾、碘化钠或溴化钠。
10.如权利要求1所述的水产品中氟甲喹的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S5包括：将待测液、纳米溶胶、碱金属盐溶液按体积比1～3：5～10：1混加入样品检测瓶中，混合均匀后，于拉曼样品检测池中，用便携式拉曼光谱仪进行检测。
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