CN104897785A - 一种检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法，用于检测水产品中氟甲喹手性对映体，成功实现了氟甲喹手性对映体及手性固定相的拆分，其中，对映体S-（-）-FMQ及R-（+）-FMQ在10μg/mL～100μg/mL浓度范围内与其响应值呈良好的线性关系，回归方程及相关系数分别为Y=96.62X-238.50、R2=1.0000及Y=112.32X-281.04、R2=1.0000，样品平均回收率分别为85.33%和83.28%，日间精密度分别为5.4%和4.7%，检出限分别为0.05μg/g和0.04μg/g，定量限分别为0.08μg/g和0.07μg/g。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法。
背景技术
喹诺酮类抗菌药氟甲喹(Flumequine)具有疗效显著、抗菌谱广、不会轻易出现交叉耐药性的特点，被广泛应用于人和动物多种感染疾病的防治中。众所周知，食用水产动物较难保存，对水质要求较高，极易感染细菌从而导致使用者出现肠道疾病等，而作为一种高效的广谱抗菌药，氟甲喹不仅对于革兰阳性细菌和革兰阴性细菌具有一定的抑制作用，对于水产动物感染的大肠杆菌病，弧球菌属和单孢菌属病等也有较强的抑制作用；并且，由于使用氟甲喹的安全范围广、无不良反应、药物残留小等，也使氟甲喹在抗菌药中的应用更为广泛。
氟甲喹存在两种对映体，其结构式如下：
由于不同的对映体在手性条件下反应可显示不同的反应性，而手性药物的对映体分子于手性固定相上的手性识别是许多因素综合作用的结果，不同的体系存在着不尽相同的手性识别机理，为了更进一步的对氟甲喹进行深入研究，研究手性化合物对映体及手性固定相的拆分机理十分重要，对于手性药物的研究和开发都具有重要意义，鉴于此，本发明提供一种检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供一种检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法，该方法能够成功实现氟甲喹手性对映体及手性固定相的拆分，为氟甲喹的深入研究提供了条件。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）用体积比为80%～100%:20%～0%的无水乙醇与异丙醇的混合物作为流动相将氟甲喹溶解并稀释配置成20μg/ml～30μg/ml的溶液，并用微孔滤膜过滤；
（2）取匀浆后的水产品2g于离心管中，加入步骤（1）中配置的氟甲喹溶液10～100mL，振荡后加入2g～3g无水Na2SO4及15ml～25ml乙酸乙酯，用漩涡混匀后再将离心管置于离心机上进行离心处理，然后转移离心管中的乙酸乙酯层到分液漏斗中；离心管中的残渣再用5ml～10ml乙酸乙酯溶解并进行离心处理，将该离心后的乙酸乙酯层与上述分液漏斗中的乙酸乙酯层进行混合；
（3）向上述分液漏斗中加入20ml～30ml正己烷溶液，充分振荡使其混匀，静置分层后弃正己烷层，将乙酸乙酯溶液转移于水浴锅中蒸干，蒸干后的残渣用无水乙醇溶解定溶至1ml～2ml，并采用微孔滤膜进行过滤后得到溶液A，溶液A中加入三乙胺作为添加剂，使其体积分数为0.1%～0.3%；
（4）采用高效液相色谱仪对上述溶液A进行检测；检测时选用CHIRALCEL OD-H手性柱，该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-三-[3，5-二甲苯基氨基甲酸酯]；所述手性柱的柱温为20℃～30℃；检测时的流速为0.5mL/min～0.7mL/min，波长为254nm。
作为优选，所述无水乙醇占乙醇和异丙醇混合物的体积分数为100%。
优选地，在所述溶液A中加入体积分数为0.3%的三乙胺作为添加剂。
所述步骤（4）中采用高效液相色谱仪对所述溶液A进行检测时的流速优选为0.6mL/min；检测波长为254nm。
所述步骤（4）中采用高效液相色谱仪对所述溶液A进行检测时所述手性柱的柱温优选为20℃。
所述微孔滤膜过滤所采用的微孔直径为0.45μm。
与现有技术相比，本发明用于检测水产品中氟甲喹手性对映体，成功实现了氟甲喹手性对映体及手性固定相的拆分，其中，对映体S-（-）-FMQ及R-（+）-FMQ在10μg/mL～100μg/mL浓度范围内与其响应值呈良好的线性关系，回归方程及相关系数分别为Y=96.62X-238.50、R2=1.0000及Y=112.32X-281.04、R2=1.0000，样品平均回收率分别为85.33%和83.28%，日间精密度分别为5.4%和4.7%，检出限分别为0.05μg/g和0.04μg/g，定量限分别为0.08μg/g和0.07μg/g。
附图说明
图1为本发明实施例中对映体分离度与乙醇含量之间的关系曲线图；
图2为本发明实施例中对映体分离度与三乙胺浓度之间的关系曲线图；
图3为本发明实施例中对映体分离度与流速之间的关系曲线图；
图4为本发明实施例中氟甲喹对映体的分离色谱图；
图5为本发明实施例中S-（-）-FMQ的色谱图；
图6为本发明实施例中R-（+）-FMQ的色谱图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一种检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法，包括以下步骤：
（1）用乙醇和异丙醇的混合物作为流动相将氟甲喹溶解并稀释配置成20μg/ml～30μg/ml的溶液，并用微孔直径为0.45μm的滤膜过滤；
（2）取匀浆后的水产品2g于离心管中，加入步骤（1）中配置的氟甲喹溶液10～100mL，振荡10min后分别加入2g无水Na2SO4及20ml乙酸乙酯，用漩涡混匀5min后再将离心管置于离心机上以4000r/min的速度进行离心处理10min，然后转移离心管中的乙酸乙酯层到分液漏斗中；离心管中的残渣再用10mL乙酸乙酯溶解并进行离心处理，将该离心后的乙酸乙酯层与上述分液漏斗中的乙酸乙酯层进行混合；
（3）向上述分液漏斗中加入30mL正己烷溶液，充分振荡使其混匀，静置分层后弃正己烷层，将乙酸乙酯溶液转移于水浴锅中蒸干，残渣用无水乙醇溶解定容至1mL并采用0.45μm的微孔滤膜进行过滤后得到溶液A；
（4）在溶液A中加入三乙胺作为添加剂，采用高效液相色谱仪对上述溶液A进行检测，高效液相色谱仪选用CHIRALCEL OD-H手性柱，该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-三-[3，5-二甲苯基氨基甲酸酯]，检测波长为254nm。
本实施例中所指的水产品为海洋和淡水渔业中的鱼、虾、蟹、贝等。
在本实施例中，步骤（1）中分别使用乙醇的体积分数为80%、90%、100%的乙醇和异丙醇的混合物作为流动相，表1为流动相中乙醇的含量对对映体保留和分离的影响，由图1和表1可以看出，随着乙醇比例的升高，分离度R明显增大，而选择性因子α变化不大，因此，所选用的流动相优选为100%的无水乙醇。
表1
由于氟甲喹为弱碱性化合物，如使用不含碱的乙醇溶液作为流动相进行分离，峰形较差。本实施例在流动相为100%乙醇不变的条件下，分别在溶液A中添加体积分数为0.1%、0.2%、0.3%的三乙胺，表1为流动相中三乙胺的浓度对对映体分离的影响，如图2和表2所示，随着三乙胺浓度提高，样品的保留时间延长，分离度也变大，色谱峰的拖尾情况逐步改善，但α值变化不大。因此，在溶液A中加入的三乙胺的体积分数优选为0.3%。
表2
由于检测时流速不同拆分效果可能不同，本实施例在选用乙醇作为流动相，在溶液A中加入体积分数0.3%的三乙胺的条件下，分别检测了流速为0.5mL/min、0.6mL/min、0.7mL/min时对映体的拆分情况，表3为不同流速下氟甲喹的拆分结果，如图3和表3所示，当流速从0.7mL/min降至0.5mL/min时，对映体的分离度随流速降低而升高。因此，本实施例检测时的流速优选为0.5mL/min。
表3
保持其它的色谱条件不变，本实施例还考察了柱温对氟甲喹对映体手性分离的影响。表4为不同柱温下氟甲喹的拆分结果，可以看出，随着柱温升高，分离度有下降趋势，因此，本实施例优选20℃作为最佳柱温。
表4
精确称取氟甲喹对照品，用乙醇溶解，稀释配制成25μg/ml的溶液。以改变进样量的方式测定峰面积与药液浓度的关系，计算时将进样量换算成质量浓度，即以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，并求出回归方程和相关系数。S-（-）-FMQ浓度在10～100μg/mL范围内与其响应值呈良好的线性关系，以Y表示浓度，X表示峰面积，回归方程及相关系数为Y=96.62X-238.50，R2=1.0000；R-（+）-FMQ浓度在10～100μg/mL范围内与其响应值呈良好的线性关系，以Y表示浓度，X表示峰面积，回归方程及相关系数为Y=112.32X-281.04，R2=1.0000。在真鲷空白肌肉样品中添加10μg/g、50μg/g和100μg/g这3个浓度的氟甲喹标准溶液，按本实施例的方法进行回收率实验，每个添加浓度平行操作5次，计算回收率和精密度，S-（-）-FMQ和R-（+）-FMQ的日间精密度分别为5.4%和4.7%；样品平均回收率分别为85.33%和83.28%；检出限分别为0.05μg/g和0.04μg/g，定量限分别为0.08μg/g和0.07μg/g。
由图4、5、6可知，本方法能成功实现氟甲喹手性对映体及手性固定相的拆分，氟甲喹对映体的分离度为2.72。
Claims (5)
1.一种检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）用体积比为80%～100%:20%～0%的无水乙醇与异丙醇的混合物作为流动相将氟甲喹溶解并稀释配置成20μg/ml～30μg/ml的溶液，并用微孔滤膜过滤；
（2）取匀浆后的水产品2g于离心管中，加入步骤（1）中配置的氟甲喹溶液10～100mL，振荡后加入2g～3g无水Na2SO4及15ml～25ml乙酸乙酯，用漩涡混匀后再将离心管置于离心机上进行离心处理，然后转移离心管中的乙酸乙酯层到分液漏斗中；离心管中的残渣再用5ml～10ml乙酸乙酯溶解并进行离心处理，将该离心后的乙酸乙酯层与上述分液漏斗中的乙酸乙酯层进行混合；
（3）向上述分液漏斗中加入20ml～30ml正己烷溶液，充分振荡使其混匀，静置分层后弃正己烷层，将乙酸乙酯溶液转移于水浴锅中蒸干，蒸干后的残渣用无水乙醇溶解定溶至1ml～2ml，并采用微孔滤膜进行过滤后得到溶液A，溶液A中加入三乙胺作为添加剂，使其体积分数为0.1%～0.3%；
（4）采用高效液相色谱仪对上述溶液A进行检测；检测时选用CHIRALCEL OD-H手性柱，该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-三-[3，5-二甲苯基氨基甲酸酯]；所述手性柱的柱温为20℃～30℃；检测时的流速为0.5mL/min～0.7mL/min，波长为254nm。
2.根据权利要求1所述的检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法，其特征在于：所述无水乙醇占乙醇和异丙醇混合物的体积分数为100%。
3.根据权利要求2所述的检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法，其特征在于：在所述溶液A中加入体积分数为0.3%的三乙胺作为添加剂。
4.根据权利要求3所述的检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法，其特征在于：所述步骤（4）中采用高效液相色谱仪对所述溶液A进行检测时的流速为0.6mL/min。
5.根据权利要求4所述的检测水产品中氟甲喹手性对映体的方法，其特征在于：采用高效液相色谱仪对所述溶液A进行检测时所述手性柱的柱温为20℃。
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