CN107308923B - 一种高效液相色谱固定相制备方法及色谱柱 - Google Patents

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Abstract

本发明属于高效液相色谱柱技术领域，公开了一种高效液相色谱固定相制备方法及色谱柱，包括：功能基团4‑(2‑苯基色原酮)甲基丙烯酸酯的合成；巯基丙基三甲氧基硅烷修饰硅胶的制备；基于巯基烯烃点击化学方法制备固定相；以甲醇为匀浆剂制备固定相匀浆，以甲醇为顶替液，于40MPa的压力下填装至150mm*4.6mm(i.d.)色谱柱中，填装好的色谱柱以纯甲醇以0.3ml/min的流速冲洗30倍柱体积。本发明所制备的高效液相色谱柱柱效和商品化的色谱柱柱效相当、制备方法简便，具有广阔的应用前景。

Description

一种高效液相色谱固定相制备方法及色谱柱
技术领域
本发明属于高效液相色谱柱技术领域，尤其涉及一种高效液相色谱固定相制备方法及色谱柱。
背景技术
高效液相色谱柱被誉为高效液相色谱的心脏，其为实现多组分分离分析的基础。目前高效液相色谱分析工作中使用较多的是使用C18或C8作为键合相的色谱柱，其分离机理主要是依靠其疏水作用，根据待分离组分在流动相和固定相两相间的分配比的不同来实现多组分的分离。但是此类固定相在分离疏水性或极性相近的目标物时，很多情况下得不到理想的分离结果。但是很多情况下，实际分析工作又对固定相有提高结构类似物分离的要求，例如天然产物的分离分析、药物合成中异构体的拆分。因此，新型高效液相色谱固定相的制备对于扩展高效液相色谱的应用具有巨大的实际意义。目前，国内外对于高效液相色谱的发展方向主要集中在三个方面：前处理技术、柱(前)后衍生、新型固定相的制备。前处理技术的开发主要是为了在现有仪器灵敏度的基础上以提高方法的检测限或者去除干扰物质。柱(前)柱后衍生主要是解决高效液相色谱常规检测手段对某些化合物不能实现检测或者信号强度低的问题。新型固定相的制备解决的是能不能实现分离的问题，这是仪器的进步、前处理手段的丰富都不能解决的问题。目前，国内外有许多新型固定相的文献报道，主要可以分为聚合物、化学键合等两大类固定相。虽然目前所发展的固定相在某些方面的应用较常规的C18、C8等反相固定相有一定的优势，但是多数情况下又限制了所制备的固定相的应用领域，往往普适性较差。黄酮类化合物是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的化合物。黄酮类化合物由于其独特的生理活性(如抗氧化、改善血液循环)引起了人们的广泛关注，但是由于黄酮类化合物广泛存在于自然界中的某些植物和浆果中，总数大约有4千多种，其分子结构不尽相同，但又十分相似，由于黄酮类化合物结构、性质上的相似性，目前商品化固定相难以实现黄酮类化合物的完全分离，往往在分析天然产物中黄酮类化合物时是在用总黄酮含量来表示；但是由于黄酮类化合物种类多样，生化活性又不尽相同，实现黄酮类化合物的分离有着实际的需要。现有商品化固定相虽然具有较好的普适性，但是在分离结构类似物的时候往往不能实现完全分离，尤其在对天然产物等组成成分复杂的分析物分析时存在不能完全分离的困难，因此根据特定的分析对象设计合成高效液相色谱固定相具有很强的现实意义。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有商品化固定相在分离结构类似物的时候往往不能实现完全分离，在对天然产物等组成成分复杂的分析物分析时存在不能完全分离的困难。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高效液相色谱固定相制备方法及色谱柱。
本发明是这样实现的，一种高效液相色谱固定相制备方法，所述高效液相色谱固定相制备方法包括以下步骤：
步骤一，功能基团4-(2-苯基色原酮)甲基丙烯酸酯的合成；
步骤二，巯基丙基三甲氧基硅烷修饰硅胶的制备；
步骤三，基于巯基烯烃点击化学方法制备固定相；
步骤四，以甲醇为匀浆剂制备固定相匀浆，以甲醇为顶替液，于40MPa的压力下填装至150mm*4.6mm(i.d.)色谱柱中，填装好的色谱柱以纯甲醇以0.3ml/min的流速冲洗30倍柱体积。
进一步，所述步骤一具体包括：
(1)4-羟基苯甲醛12.46g 100mmol，碳酸钾和催化剂量的KI分散于100mL新蒸丙酮中，在氮气保护下滴加1.2当量的烯丙基溴，升温至回流反应过夜，反应结束后旋转蒸干丙酮，残余物质以乙酸乙酯溶解；
(2)转移至分液漏斗中，并以饱和食盐水洗涤，有机相以无水硫酸镁干燥，旋转蒸干有机溶剂，快速柱层析得到4-烯丙氧基苯甲醛，将所得的产品在40％KOH水溶液作为催化剂和等当量的邻羟基苯乙酮反应，反应结束后倾倒至适量的冰水中并以2M盐酸调节pH至2，观察到大量黄色固体析出，抽滤；
(3)关环反应是在以4％当量的碘作为催化剂，DMSO为溶剂于140℃下进行；脱保护过程用到了四(三苯基膦)钯作为催化剂，得到4'-羟基黄酮；
(4)利用4'-羟基黄酮和甲基丙烯酰氯制备4-(2-苯基色原酮)甲基丙烯酸酯。
进一步，所述步骤二具体包括：
1)5g干燥的高效液相色谱级硅胶分散于50mL重蒸的甲苯中，逐滴滴加4mL巯基丙基三甲氧基硅烷，再于氮气保护下升温至回流反应48小时；
2)反应结束后，待分散液冷却至室温后，以5000rpm的转速离心处理，分别以甲苯、无水乙醇洗涤三遍，40℃真空干燥过夜，待用。
进一步，所述步骤三具体包括：
第一步，4.0g 4-(2-苯基色原酮)甲基丙烯酸酯溶解于100mL四氢呋喃中，再加入8.0g巯基丙基三甲氧基硅烷修饰的硅胶，超声分散2min；
第二步，加入200mg偶氮二异丁腈，氮气脱气20分钟，密闭于65℃反应48小时，反应结束后以5000rpm离心处理，分别以四氢呋喃、无水乙醇洗涤三遍，干燥待用。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述高效液相色谱固定相制备方法制备的色谱柱。
本发明的优点及积极效果为：本发明基于黄酮类骨架结构通过巯基-烯烃点击化学制备了一种新型的高效液相色谱固定相，利用本发明所制备固定相填充的高效液相色谱柱相比于商品化的C18等色谱柱具有更为优越的选择性，并且本发明所制备的高效液相色谱柱柱效和商品化的色谱柱柱效相当、制备方法简便，具有广阔的应用前景。本发明是对于黄酮类化合物具有更高选择性的色谱固定相，在实现黄酮类化合物的多组分分离、天然产物中黄酮类化合物的分析具有十分巨大的现实意义。
附图说明
图1是本发明实施例提供的高效液相色谱固定相制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的高效液相色谱固定相制备方法包括以下步骤：
S101：功能基团4-(2-苯基色原酮)甲基丙烯酸酯的合成；
S102：巯基丙基三甲氧基硅烷修饰硅胶的制备；
S103：基于巯基烯烃点击化学方法制备固定相；
S104：以甲醇为匀浆剂制备固定相匀浆，以甲醇为顶替液，于40MPa的压力下填装至150mm*4.6mm(i.d.)色谱柱中，填装好的色谱柱以纯甲醇以0.3ml/min的流速冲洗30倍柱体积。
本发明实施例提供的高效液相色谱固定相制备方法具体包括以下步骤：
1、功能基团4-(2-苯基色原酮)甲基丙烯酸酯的合成：
4-羟基苯甲醛(12.46g 100mmol)，碳酸钾和催化剂量的KI分散于100mL新蒸丙酮中，在氮气保护下滴加1.2当量的烯丙基溴，升温至回流反应过夜，反应结束后旋转蒸干丙酮，残余物质以乙酸乙酯溶解，然后转移至分液漏斗中，并以饱和食盐水洗涤，有机相以无水硫酸镁干燥，旋转蒸干有机溶剂，快速柱层析得到4-烯丙氧基苯甲醛，将所得的产品在适量40％KOH水溶液作为催化剂和等当量的邻羟基苯乙酮反应，反应结束后倾倒至适量的冰水中并以2M盐酸调节pH至2，观察到大量黄色固体析出，抽滤；关环反应是在以4％当量的碘作为催化剂，DMSO为溶剂于140℃下进行的。脱保护过程用到了四(三苯基膦)钯作为催化剂，得到4'-羟基黄酮；最后，利用4'-羟基黄酮和甲基丙烯酰氯制备4-(2-苯基色原酮)甲基丙烯酸酯。
2、巯基丙基三甲氧基硅烷修饰硅胶的制备
5g干燥的高效液相色谱级硅胶分散于50mL重蒸的甲苯中，逐滴滴加4mL巯基丙基三甲氧基硅烷，再于氮气保护下升温至回流反应48小时。反应结束后，待分散液冷却至室温后，以5000rpm的转速离心处理，分别以甲苯、无水乙醇洗涤三遍。40℃真空干燥过夜，待用。
3、基于巯基烯烃点击化学方法制备固定相
4.0g 4-(2-苯基色原酮)甲基丙烯酸酯溶解于100mL四氢呋喃中，再加入8.0g巯基丙基三甲氧基硅烷修饰的硅胶，超声分散2min，然后加入200mg偶氮二异丁腈，氮气脱气20分钟，最后密闭于65℃反应48小时，反应结束后以5000rpm离心处理，分别以四氢呋喃、无水乙醇洗涤三遍，最后干燥待用。
4、色谱柱的填装
以甲醇为匀浆剂制备固定相匀浆，以甲醇为顶替液，于40MPa的压力下填装至150mm*4.6mm(i.d.)色谱柱中，填装好的色谱柱以纯甲醇以0.3ml/min的流速冲洗30倍柱体积。
5、分析应用
将本发明所描述的新型固定相所填装的色谱柱用于黄酮类化合物槲皮素及其结构类似物杨梅素的分离，取得良好的分离效果，相关结果与商品化C18色谱柱作了比较；商品化C18色谱柱不能实现两组分的分离。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种高效液相色谱固定相制备方法，其特征在于，所述高效液相色谱固定相制备方法包括以下步骤：
步骤一，功能基团4-(2-苯基色原酮)甲基丙烯酸酯的合成；
步骤二，巯基丙基三甲氧基硅烷修饰硅胶的制备；
步骤三，基于巯基烯烃点击化学方法制备固定相；
步骤四，以甲醇为匀浆剂制备固定相匀浆，以甲醇为顶替液，于40MPa的压力下填装至150mm*内径4.6mm的色谱柱中，填装好的色谱柱以纯甲醇以0.3ml/min的流速冲洗30倍柱体积。
2.如权利要求1所述的高效液相色谱固定相制备方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：
(1)4-羟基苯甲醛12.46g，碳酸钾和催化剂量的KI分散于100mL新蒸丙酮中，在氮气保护下滴加1.2当量的烯丙基溴，升温至回流反应过夜，反应结束后旋转蒸干丙酮，残余物质以乙酸乙酯溶解；
(2)转移至分液漏斗中，并以饱和食盐水洗涤，有机相以无水硫酸镁干燥，旋转蒸干有机溶剂，快速柱层析得到4-烯丙氧基苯甲醛，将所得的产品在40％KOH水溶液作为催化剂和等当量的邻羟基苯乙酮反应，反应结束后倾倒至适量的冰水中并以2M盐酸调节pH至2，观察到大量黄色固体析出，抽滤；
(3)关环反应是在以4％当量的碘作为催化剂，DMSO为溶剂于140℃下进行；脱保护过程用到了四(三苯基膦)钯作为催化剂，得到4'-羟基黄酮；
(4)利用4'-羟基黄酮和甲基丙烯酰氯制备4-(2-苯基色原酮)甲基丙烯酸酯。
3.如权利要求1所述的高效液相色谱固定相制备方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：
1)5g干燥的高效液相色谱级硅胶分散于50mL重蒸的甲苯中，逐滴滴加4mL巯基丙基三甲氧基硅烷，再于氮气保护下升温至回流反应48小时；
2)反应结束后，待分散液冷却至室温后，以5000rpm的转速离心处理，分别以甲苯、无水乙醇洗涤三遍，40℃真空干燥过夜，待用。
4.如权利要求1所述的高效液相色谱固定相制备方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：
第一步，4.0g 4-(2-苯基色原酮)甲基丙烯酸酯溶解于100mL四氢呋喃中，再加入8.0g巯基丙基三甲氧基硅烷修饰的硅胶，超声分散2min；
第二步，加入200mg偶氮二异丁腈，氮气脱气20分钟，密闭于65℃反应48小时，反应结束后以5000rpm离心处理，分别以四氢呋喃、无水乙醇洗涤三遍，干燥待用。
5.一种利用权利要求1～4任意一项所述高效液相色谱固定相制备方法制备的色谱柱。
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