CN114317763A - 一种与奶牛热应激相关的circRNA标志物及其应用 - Google Patents

一种与奶牛热应激相关的circRNA标志物及其应用 Download PDF

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CN114317763A CN202011046573.XA CN202011046573A CN114317763A CN 114317763 A CN114317763 A CN 114317763A CN 202011046573 A CN202011046573 A CN 202011046573A CN 114317763 A CN114317763 A CN 114317763A
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China
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primer
heat stress
circscd
dairy cows
sequence
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孙加节
汪东阳
张永亮
江青艳
习欠云
陈婷
罗君谊
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South China Agricultural University
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Abstract

本发明公开一种与奶牛热应激相关的circRNA标志物及其应用，属于家畜分子标记制备技术领域。所述的circRNA标志物为circSCD，其序列如SEQ ID NO：1所示。所述circSCD在适温组奶牛乳腺组织中极显著高表达，其能通过吸附bta‑miR‑183影响奶牛泌乳，应用于热应激条件下改善奶牛泌乳过程。本发明公开的circSCD可以作为与奶牛热应激相关的分子标记，在遗传辅助改善奶牛品种(系)中具有重要的实际应用价值。

Description

一种与奶牛热应激相关的circRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种与奶牛热应激相关的circRNA标志物及其应用。
背景技术
随着温室效应的产生，全球气候变暖，热应激已成为奶牛生产养殖过程中最重要的问题之一。目前我国的奶牛主要是来自荷兰的荷斯坦奶牛，其属于典型的耐寒怕热动物。不发达的汗腺，较差的散热能力，再加上泌乳时产生大量的代谢热，导致奶牛对高温天气的不耐受，极易在夏季，尤其是在我国南部地区产生热应激。据研究发现，热应激条件下，奶牛的泌乳量下降达20％～45％，这给我国的奶牛业造成了巨大的经济损失。
牛奶作为人类最好的食物之一，具有极高的营养价值,，其不仅包含了大多数营养素，还是人体内许多必须氨基酸的良好来源。但是随着奶牛热应激的产生，乳品质(乳蛋白，乳脂。乳糖)均显著下降。随着消费者对乳品质要求的日益提高，亟需改善热应激对牛奶的影响。因此，在奶牛乳腺组织水平上，分析热应激与泌乳相关性状之间的关系，发现优良性状相关基因控制泌乳的机理，对补充和完善当今奶牛泌乳的理论和生产实践十分必要和重要。
随着“基因组时代”的到来，在基因水平上对性状相关基因的表达情况进行解析，是目前奶牛泌乳工作的重要研究方向之一。环状RNA(circRNA)是非编码RNA中一种，作为继微小RNA(miRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)后的RNA家族的又一研究热点，在生命体的生长和发展过程中发挥着重要作用。CircRNA可以作为miRNA的海绵进而接触其对靶基因的抑制作用。近年来，越来越多的证据表明，circRNA在细胞分化与凋亡、生长发育等多个生理和病理过程中均扮演着关键的角色，其中已发现热应激会影响circRNA的生物合成。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种与奶牛热应激相关的circRNA标志物。
本发明的另一目的在于提供上述circRNA标志物的应用。
本发明通过对冬季适温和夏季热应激奶牛乳腺组织进行高通量circRNA测序，筛选与奶牛热应激相关的分子标记，经过生物信息学差异表达分析circSCD在适温组奶牛乳腺组织中极显著高表达，其能通过吸附bta-miR-183调控发挥功能。本发明还公布了用于检测所述分子标记的检测方法，具有重要的实际应用价值。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种与奶牛热应激相关的circRNA标志物，该circRNA标志物为circSCD，其序列如SEQ ID NO：1所示。所述circSCD通过吸附bta-miR-183影响奶牛泌乳，应用于热应激条件下改善奶牛泌乳过程。
本发明还提供了一种circSCD的靶标miRNA，所述靶标为bta-miR-183：5′-UAUGGCACUGGUAGAAUUCACUG-3′，如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供一种circRNA标志物的引物，该引物为：
CircSCD的上游引物序列为：5′-CCTGGCTGGTGAATAGTGCT-3′，SEQ ID NO：3；
CircSCD的下游引物序列为：5′-ACCAGGTTTGTAGTACCCGC-3′，SEQ ID NO：4；
本发明还提供一种circSCD的靶标miRNA的检测引物，该引物为：
上游引物F：5′-GGTATGGCACTGGTAGA-3′，SEQ ID NO：9；
下游引物R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，SEQ ID NO：10。
本发明还提供一种上述circRNA标志物或miRNA在奶牛热应激遗传标记及改善奶牛热应激条件下奶牛泌乳过程中的应用。具体的，在制备奶牛热应激遗传标记及改善奶牛热应激条件下泌乳过程的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种检测上述circRNA标志物的试剂盒，含有上述circRNA标志物的引物，和/或探针。
进一步，使用荧光定量PCR法检测circRNA标志物时，所用的上游引物(Forwardprimer)为序列表中SEQ ID NO：3；下游引物(Reverse primer)为序列表中SEQ ID NO：4。
进一步，使用荧光定量PCR法检测circRNA标志物时，可以采用SYBR Green荧光染料法。
具体的，所述的试剂盒含有针对上述circSCD的反转录试剂、特异性引物、内参引物、SYBR Green荧光定量PCR反应液。
优选的，还包括circSCD特异性探针。
其中，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4。
所述的内参引物包括GAPDH内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQID NO：5，下游引物序列为SEQ ID NO：6；
上述试剂盒应用于奶牛乳腺组织中circSCD的定量检测。
上述试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
本发明还提供一种检测上述circRNA标志物的方法，包括如下步骤：
1)提取奶牛乳腺组织总RNA；
2)通过反转录随机引物在反转录酶的作用下进行circSCD反转录成cDNA；
3)在荧光实时定量PCR仪上将步骤2)获得的cDNA和内参基因进行扩增检测；
4)通过溶解曲线分析，2-ΔΔCt法进行相对定量。
本发明还提供一种检测上述miRNA的的试剂盒，含有针对所述bta-miR-183的引物。
进一步，使用茎环法检测bta-miR-183时，所用的反转录引物序列为SEQ ID NO：11、上游引物为序列表中SEQ ID NO：9；下游引物为序列表中SEQ ID NO：10。
进一步，使用茎环法检测bta-miR-183时，可以采用荧光染料法。
具体的，所述的试剂盒含有针对所述bta-miR-183的反转录试剂、特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。
其中，所述的针对所述bta-miR-183的反转录试剂序列为SEQ ID NO：11。
所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO：9，下游引物序列为SEQ ID NO：10。
所述的内参引物包括GAPDH内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQID NO：5，下游引物序列为SEQ ID NO：6。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明筛选得到的显著差异表达circRNA为circSCD，其吸附靶标miRNA为bta-miR-183。本发明公开的circSCD可以作为与奶牛热应激相关的分子标记，在遗传辅助改善奶牛品种(系)中具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1是CircSCD与其吸附靶标bta-miR-183结合位点。
图2是CircSCD成环的双引物核酸电泳图；其中，
Figure BDA0002708186390000041
表示circSCD特异性引物的结果；
Figure BDA0002708186390000042
表示circSCD收敛性引物的结果。
图3是荧光定量PCR检测奶牛乳腺组织中circSCD的相对表达量。
图4是荧光定量PCR检测奶牛乳腺组织中bta-miR-183的相对表达量。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例中所用的奶牛为荷斯坦奶牛，荷斯坦奶牛在文献“槟榔江水牛、摩拉水牛和荷斯坦奶牛血清中酶活性的测定[J].黑龙江畜牧兽医,2016(5):212-214”中公开。
实施例1高通量circRNA-seq鉴定热应激组和适温组奶牛乳腺差异表达circRNA
1)选取冬季适温和夏季热应激健康奶牛作为研究对象；3头冬季及3头夏季奶牛分别采用活检技术取它们的乳腺组织，组织标本取出后速冻于液氮30秒，然后储存于-80℃冰箱，随后附干冰送测序公司进行circRNA测序。
2)运用FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布、质量值的位置分布、GC含量、PCR duplication含量等。
高通量测序后6个样本得到的总reads数分别为111406942，117343926，104148772，108266368，117034172，105922738，经过质量校准后，每个文库平均包含103144230个有效reads，约占原始读数的93.19％。将有效reads与Bos taurus参考基因进行匹配。
3)对circRNA-seq测序数据进行circRNA鉴定分析，采用国际公认算法CIRCexplorer2(http://circexplorer2.readthedocs.io/en/latest/)、circRNA_finder(http s://omictools.com/circrnafinder-tool)、CIRI(https://sourceforge.net/projects/ciri/)、find_circ(https://github.com/orzechoj/circRNA_finder)和MapSplice(http://www.netlab.uky.edu/p/bioinfo/MapSplice2)进行。
4)采用国际公认算法edgeR(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)进行差异筛选，通过分析最终挑选出差异表达极显著的c ircSCD作为研究对象，序列为SEQ ID NO：1，circSCD在适温奶牛乳腺组织极显著高表达。通过搜索miRanda数据库(http://34.236.212.39/microrna/home.d o)，预测其吸附调控的靶标miRNA为bta-miR-183(图1)。
实施例2荧光定量PCR检测奶牛乳腺组织中circSCD的表达
试剂：
反转录试剂盒：PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)，#RR047Q，Takara；
定量PCR试剂：
Figure BDA0002708186390000051
Fast qPCR Mix，#RR430A，Takara。
相关实验物品去RNase处理：
1)将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高温烤干2小时以上。
2)将塑料器皿(如：EP管/枪头)使用前需用0.1％DEPC水侵泡过夜，后控干液体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。
总RNA提取：
采用活检技术取10头冬季适温奶牛乳腺组织和10头夏季热应激奶牛乳腺组织，参照Invitrogen试剂盒说明书采用Trizol法进行总RNA提取，具体步骤如下：
1)取黄豆粒大小的奶牛乳腺组织样置于液氮预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉；
2)待无明显颗粒存在，转移粉末状组织至1.5mL离心管中；
3)加入1mL Trizol，迅速剧烈震荡，室温孵育10min，使细胞裂解完全；
4)加入200μL氯仿，用力上下摇动90s，放置冰上孵育5min；
5)4℃，12,000r/min离心15min，将上清液转移至另一个新的1.5mL离心管中；
6)加入等体积异丙醇，混匀，静置10min沉淀RNA；
7)4℃，12,000r/min离心10min，弃上清；
8)75％乙醇洗涤沉淀二次，室温下自然干燥5min；
9)加50μL DNase I混合液，75℃溶解5min，-80℃保存备用。
用1.2％琼脂糖凝胶电泳初步检测总RNA的完整性；安捷伦生物分析仪Agilent2100(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)进一步检测总RNA的质量和溶度，取1μL样品在70℃变性2min后，进行Agilent 2100检测。
cDNA合成及质量检测
1)总RNA检测合格后立即进行cDNA的合成，反转录使用的是大连宝生物公司的反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)，首先按下表在0.2mL PCR管中配制去基因组反应体系，总反应体系为10μL，然后42℃放置2分钟。
5×gDNA Eraser Buffer 2μL
gDNA Erase 1μL
总RNA 1000ng
RNase-free dH<sub>2</sub>O 加至10μL
反应体系 10μL
2)在上述反应液中依次加入5×PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScript RTEnzyme Mix I 1μL，随机6碱基反转录引物0.5μL，及RNase-free dH2O 4.5μL，共计20μL。37℃反应30分钟，85℃反应15秒终止。然后加入180μL RNase free dH2O稀释至200μL储存在-20℃，用于后续试验。
定性分析
1)本实验首先用上海生物工程股份有限公司Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒将奶牛乳腺组织中的全基因组DNA(gDNA)提取出来。
2)本实验用分别对奶牛乳腺组织的cDNA和gDNA进行普通PCR反应，反应体系及条件如下表：
2×taq Master Mix 12.5μL
上游引物(10μM) 1μL
下游引物(10μM) 1μL
cDNA或gDNA 1.5μL
RNase-free dH<sub>2</sub>O Up to 25μL
反应体系 25μL
其中，与circSCD特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDNO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4，
以及circSCD的收敛性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDNO：7，下游引物序列为SEQ ID NO：8。
3)PCR反应条件：首先95℃预变性30秒；40个循环，每个循环95℃变性5秒，60℃退火30秒；
4)最后用2％琼脂糖凝胶电泳初步检测PCR产物的长度，验证circSCD的成环性，其核酸电泳图如图2显示。根据图2可知，在circSCD收敛引物的作用下，cDNA和gDNA均跑出条带，而在circSCD特异性引物的作用下，仅cDNA跑出条带，证明了circSCD成环的真实性。
定量分析
1)本试验用大连宝生物公司
Figure BDA0002708186390000071
Fast qPCR Mix试剂进行实时定量PCR分析。每个样品设置3个重复，每对引物设置3个阴性对照。以GAPDH作为内参基因，反应体系及条件如下表：
2×SYBR Premix Ex Taq II 12.5μL
上游引物(10μM) 1μL
下游引物(10μM) 1μL
cDNA 1.5μL
RNase-free dH<sub>2</sub>O Up to 25μL
反应体系 25μL
其中，针对circSCD的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQID NO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4。
GAPDH内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO：5，下游引物序列为SEQ ID NO：6。
2)实时定量PCR反应条件：首先95℃预变性30秒；40个循环，每个循环95℃变性5秒，60℃退火30秒；循环结束后记录65～95℃范围内的溶解曲线。
3)基因表达丰度用2-ΔΔCt法表示，在冬季适温和夏季热应激奶牛乳腺组织中circSCD相对表达结果见图3。根据图3可知，circSCD在冬季适温奶牛乳腺组织中的表达量极显著高于夏季热应激奶牛乳腺组织中的表达量。
实施例3荧光定量PCR检测奶牛乳腺组织中bta-miR-183的表达
试剂：
反转录试剂盒：PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)，#RR047Q，Takara；
定量PCR试剂：
Figure BDA0002708186390000072
Fast qPCR Mix，#RR430A，Takara
相关实验物品去RNase处理：
1)将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高温烤干2小时以上。
2)将塑料器皿(如：EP管/枪头)使用前需用0.1％DEPC水侵泡过夜，后控干液体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。
总RNA提取：
采用活检技术取10头冬季适温奶牛乳腺组织和10头夏季热应激奶牛乳腺组织，参照Invitrogen试剂盒说明书采用Trizol法进行总RNA提取，具体步骤如下：
1)取黄豆粒大小的乳腺组织样置于液氮预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉；
2)待无明显颗粒存在，转移粉末状组织至1.5mL离心管中；
3)加入1mL Trizol，迅速剧烈震荡，室温孵育10min，使细胞裂解完全；
4)加入200μL氯仿，用力上下摇动90s，放置冰上孵育5min；
5)4℃，12,000r/min离心15min，将上清液转移至另一个新的1.5mL离心管中；
6)加入等体积异丙醇，混匀，静置10min沉淀RNA；
7)4℃，12,000r/min离心10min，弃上清；
8)75％乙醇洗涤沉淀二次，室温下自然干燥5min；
9)加50μL DNase I混合液，75℃溶解5min，-80℃保存备用。
用1.2％琼脂糖凝胶电泳初步检测总RNA的完整性；安捷伦生物分析仪Agilent2100(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)进一步检测总RNA的质量和溶度，取1μL样品在70℃变性2min后，进行Agilent 2100检测。
cDNA合成及质量检测
1)总RNA检测合格后立即进行cDNA的合成，反转录使用的是大连宝生物公司的反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)，首先按下表在0.2mLPCR管中配制去基因组反应体系，总反应体系为10μL，然后42℃放置2分钟。
5×gDNA Eraser Buffer 2μL
gDNA Erase 1μL
总RNA 1000ng
RNase-free dH<sub>2</sub>O 加至10μL
反应体系 10μL
2)在上述反应液中依次加入5×PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScript RTEnzyme Mix I 1μL，miRNA反转录引物0.5μL，内参基因GAPDH下游引物0.5μL及RNase-freedH2O 4μL，共计20μL。37℃反应30分钟，85℃反应15秒终止。然后加入180μL RNase freedH2O稀释至200μL储存在-20℃，用于后续试验。
定量分析
1)本试验用大连宝生物公司
Figure BDA0002708186390000091
Fast qPCR Mix试剂进行实时定量PCR分析。每个样品设置3个重复，每对引物设置3个阴性对照。以GAPDH作为内参基因，反应体系及条件如下表：
2×SYBR Premix Ex Taq II 12.5μL
上游引物(10μM) 1μL
下游引物(10μM) 1μL
cDNA 1.5μL
RNase-free dH<sub>2</sub>O Up to 25μL
反应体系 25μL
其中，针对bta-miR-183的反转录引物序列为SEQ ID NO：11；
针对bta-miR-183的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQID NO：9，下游引物序列为SEQ ID NO：10；
GAPDH内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO：5，下游引物序列为SEQ ID NO：6。
2)实时定量PCR反应条件：首先95℃预变性30秒；40个循环，每个循环95℃变性5秒，60℃退火30秒；循环结束后记录65～95℃范围内的溶解曲线。
3)基因表达丰度用2-ΔΔCt法表示，在冬季适温和夏季热应激奶牛乳腺组织中bta-miR-183相对表达结果见图4。根据图4可知，bta-miR-183在冬季适温奶牛乳腺组织中的表达量显著低于夏季热应激奶牛乳腺组织中的表达量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种与奶牛热应激相关的circRNA标志物及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 233
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> circSCD
<400> 1
gtactacaaa cctggtgtcc tgttgttgtg cttcatcctg cccacactcg tgccatggta 60
tctgtgggat gaaacgtttc aaaacagcct gttttttgcc accttattcc gttatgccct 120
tgggctcaac gtcacctggc tggtgaatag tgctgcccat atgtatggat accgccctta 180
tgacaagacc atcaaccccc gagagaatat tctggtttcc ctgggagctg cgg 233
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> bta-miR-183
<400> 2
uauggcacug guagaauuca cug 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CircSCD的上游引物
<400> 3
cctggctggt gaatagtgct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CircSCD的下游引物
<400> 4
accaggtttg tagtacccgc 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GAPDH内参基因的上游引物
<400> 5
ctgccgcctg gagaaacct 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GAPDH内参基因的下游引物
<400> 6
gctgtagcca aattcattgt cg 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> circSCD的收敛性上游引物
<400> 7
tggtatctgt gggatgaaa 19
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> circSCD的收敛性下游引物
<400> 8
agccaggtga cgttgagccc aaggg 25
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上游引物F
<400> 9
ggtatggcac tggtaga 17
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下游引物R
<400> 10
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 针对bta-miR-183的反转录引物
<400> 11
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccagtga a 51

Claims (10)

1.一种与奶牛热应激相关的circRNA标志物，其特征在于：
所述的circRNA标志物为circSCD，其序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种如权利要求1所述的circRNA标志物的检测引物，其特征在于所述检测引物为：
CircSCD的上游引物序列为：5′-CCTGGCTGGTGAATAGTGCT-3′；
CircSCD的下游引物序列为：5′-ACCAGGTTTGTAGTACCCGC-3′。
3.一种如权利要求1所述的circRNA标志物的靶标miRNA，其特征在于：
所述的miRNA为bta-miR-183，其序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种如权利要求3所述的靶标miRNA的检测引物，其特征在于：
上游引物F：5′-GGTATGGCACTGGTAGA-3′；
下游引物R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。
5.权利要求1所述的circRNA标志物或权利要求2所述的检测引物的应用，其特征在于：所述的应用为下列的任一种：
权利要求1所述的circRNA标志物或权利要求2所述的检测引物在奶牛热应激遗传标记及改善奶牛热应激条件下奶牛泌乳过程中的应用；
权利要求1所述的circRNA标志物或权利要求2所述的检测引物在制备奶牛热应激遗传标记及改善奶牛热应激条件下泌乳过程的试剂盒中的应用。
6.权利要求3所述的靶标miRNA或权利要求4所述的检测引物的应用，其特征在于：所述的应用为下列的任一种：
权利要求3所述的靶标miRNA或权利要求4所述的检测引物在奶牛热应激遗传标记及改善奶牛热应激条件下奶牛泌乳过程中的应用；
权利要求3所述的靶标miRNA或权利要求4所述的检测引物在制备奶牛热应激遗传标记及改善奶牛热应激条件下泌乳过程的试剂盒中的应用。
7.一种检测权利要求1所述的circRNA标志物的试剂盒，其特征在于含有权利要求2所述的circRNA标志物的检测引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：
所述的试剂盒还含有针对权利要求1所述circSCD的反转录试剂、内参引物、荧光定量PCR反应液；
所述的内参引物包括GAPDH内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDNO：4，下游引物序列为SEQ ID NO：5。
9.权利要求7或8所述的试剂盒在奶牛乳腺组织中circSCD的定量检测中的应用。
10.一种检测权利要求1所述的circRNA标志物的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)提取奶牛乳腺组织总RNA；
2)通过反转录随机引物在反转录酶的作用下进行circSCD反转录成cDNA；
3)在荧光实时定量PCR仪上将步骤2)获得的cDNA和内参基因进行扩增检测；
4)通过溶解曲线分析，2-ΔΔCt法进行相对定量。
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