CN108676894B

CN108676894B - 与猪胴体肉品质相关的circRNA标志物及其应用

Info

Publication number: CN108676894B
Application number: CN201810496311.XA
Authority: CN
Inventors: 孙加节; 张永亮; 江青艳; 习欠云; 陈婷; 罗君谊; 谢月琴; 王伶
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2018-05-22
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2038-05-22
Also published as: CN108676894A

Abstract

本发明公开一种与猪胴体肉品质相关的circRNA标志物及其应用，属于家畜分子标记制备技术领域。所述的circRNA标志物为circLIMCH1，其序列如SEQ ID NO：1所示。该circLIMCH1通过吸附其靶标ssc‑miR‑133a‑5p调控猪肌纤维发育影响猪肉品质，应用于猪肉品质改良方面的辅助遗传选育过程。本发明公开的circLIMCH1可以作为与猪肉品质相关的分子标记，在遗传辅助育种中具有重要的实际应用价值。

Description

与猪胴体肉品质相关的circRNA标志物及其应用

技术领域

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪胴体肉品质相关的circRNA标志物及其应用。

背景技术

动物肌肉形成与品质性状改良是家畜育种工作中的最主要研究方向。目前，国内商品猪主要是从国外引进的瘦肉型猪种及其杂交后代，引进品种具有生长速度快，胴体瘦肉率及饲料转化率高等优点；但与我国地方猪种相比，猪抗应激能力与肉品质却显著降低了。近年来，随着消费者对肉品质要求的日益提高，亟需改善肉质，培育优质肉猪。肌纤维是肌肉的基本组成单位。近年来研究表明，肌纤维的组织学特性与肌肉品质特别是食用品质性状(嫩度、风味、多汁性)密切相关，肌纤维的特征在某种程度上决定了肌肉特性。一般而言，氧化型肌纤维直径小，脂质和肌红蛋白含量高，有助于增加肌肉的嫩度、多汁性和风味。比较我国地方猪种(梅山猪、二花脸猪)和引进瘦肉型猪种(大约克、杜洛克、长白猪)发现，加强对瘦肉生长的选择可导致酵解型肌纤维增加，氧化型肌纤维减少，当酵解型肌纤维比例高时，猪肉品质下降。因此，在猪酮体肌肉纤维水平上，分析不同遗传背景猪种与优良性状发生之间的关系，发现优良性状相关基因控制肌纤维发育的机理，对补充和完善当今猪“品种分子设计”技术体系，最终促进我国猪育种技术由传统的“经验育种”向高效的“精确育种”转变已十分必要和重要。

随着“基因组时代”的来临，在全基因组水平上解析性状相关基因表达模式的整体特征，是目前猪育种工作的重要研究方向之一。环状(circRNA)作为一类非编码RNA，在细胞中起到miRNA海绵的效果，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用。近年来，研究已表明circRNAs在细胞分化与凋亡、生长发育、糖脂代谢、炎症、免疫应答以及肿瘤发生等多个生理和病理过程中均扮演着关键的角色，其中在肌肉生成过程中一些影响肌细胞分化和增殖的circRNA已经被筛选和确定。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种与猪胴体肉品质相关的circRNA标志物。

本发明的另一目的在于提供上述circRNA标志物的应用。

本发明通过对长白猪和广东特色品种蓝塘猪肌肉组织进行高通量circRNA测序，筛选与猪肉品质相关的分子标记，经过生物信息学差异表达分析初步选定在瘦肉型长白猪肌肉组织中极显著高表达circLIMCH1，其能通过吸附ssc-miR-133a-5p调控猪肌肉纤维发育影响猪肉品质。本发明还公开了用于检测所述分子标记的检测方法，具有重要的实际应用价值。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种与猪胴体肉品质相关的circRNA标志物，该circRNA标志物为circLIMCH1，其序列如SEQ ID NO：1所示。所述circLIMCH1通过吸附ssc-miR-133a-5p调控猪肉品质，应用于猪肉品质改良方面的辅助遗传选育过程。

进一步，所述circLIMCH1在瘦肉型猪肌肉组织中高表达，在脂肪型猪肌肉组织中低表达并能通过吸附作用负调控ssc-miR-133a-5p发挥作用。

本发明还提供一种circLIMCH1的靶标miRNA，所述靶标miRNA为ssc-miR-133a-5p：5′-AGCUGGUAAAAUGGAACCAAAU-3′，如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供一种上述circRNA标志物的引物，该引物为：

circLIMCH1的上游引物序列为：5′-GTCTCGCCAGAACCACAGCATTT-3′，SEQ ID NO：3；

circLIMCH1的下游引物序列为：5′-AGCCAGGTCATCTTGCCATTTGT-3′，SEQ ID NO：4；

本发明还提供一种上述circRNA标志物在遗传标记辅助育种及改善猪肉品质中的应用。具体的，在制备遗传标记辅助育种及改善猪胴体肉品质的试剂盒中的应用。

优选的，上述circRNA标志物的引物在遗传标记辅助育种及改善猪胴体肉品质中的应用，具体的，在制备遗传标记辅助育种及改善猪胴体肉品质的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种检测上述circRNA标志物的试剂盒，含有上述circRNA标志物的引物和/或探针。

进一步，使用荧光定量PCR法检测circRNA标志物时，所用的上游引物(Forwardprimer)为序列表中SEQ ID NO：3；下游引物(Reverse primer)为序列表中SEQ ID NO：4。

进一步，使用荧光定量PCR法检测circRNA标志物时，可以采用SYBR Green荧光染料法。

具体的，所述的试剂盒含有针对上述circLIMCH1的反转录试剂、特异性引物、内参引物、SYBR Green荧光定量PCR反应液。

优选的，还包括circLIMCH1特异性探针。

其中，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4。

所述的内参引物包括GAPDH内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQID NO：5，下游引物序列为SEQ ID NO：6；

上述试剂盒应用于猪肌肉组织中circLIMCH1的定量检测。

上述试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

本发明还提供一种检测上述circRNA标志物的方法，包括如下步骤：

1)提取猪肌肉组织总RNA；

2)通过反转录随机引物在反转录酶的作用下进行circLIMCH1反转录成cDNA；

3)在荧光实时定量PCR仪上将步骤(2)获得的cDNA和内参基因进行扩增检测；

4)通过溶解曲线分析，2^-ΔΔCt法进行相对定量。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明筛选得到的显著差异表达circRNA为circLIMCH1，其吸附靶标miRNA为ssc-miR-133a-5p。本发明公开的circLIMCH1可以作为与猪肉品质相关的分子标记，在遗传辅助育种中具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1是预测circLIMCH1与其吸附靶标ssc-miR-133a-5p结合位点。

图2是荧光定量PCR检测猪肌肉组织中circLIMCH1的相对表达量。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1高通量circRNA-seq鉴定不同品种猪肌肉组织中差异表达circRNA

1)选取胴体肉品质差异较大的长白猪和广东特色品种蓝塘猪作为研究对象；选3例长白猪及3例蓝塘猪分别取它们的背部肌肉组织，组织标本自取出后速冻于液氮30秒，然后储存于-80℃冰箱，随后附干冰送测序公司进行circRNA测序。

2)运用FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布、质量值的位置分布、GC含量、PCR duplication含量等。

高通量测序后蓝塘猪三个背肌肉样本得到的总reads数分别为63,486,000、43,861,368和74,548,578，长白猪三个样本得到的总reads数分别为98,600,440、73,875,454和71,845,066，所得reads数目满足试验需要。

3)对circRNA-seq测序数据进行circRNA鉴定分析，采用国际公认算法CIRCexplorer2(http://circexplorer2.readthedocs.io/en/latest/)、circRNA_finder(https://omictools.com/circrnafinder-tool)、CIRI(https://sourceforge.net/projects/ciri/)、find_circ(https://github.com/orzechoj/circRNA_finder)和MapSplice(http://www.netlab.uky.edu/p/bioinfo/MapSplice2)进行。

4)采用国际公认算法edgeR(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)进行差异筛选，通过分析最终挑选出差异表达极显著的circLIMCH1，序列为SEQ ID NO：1，circLIMCH1在高瘦肉率长白猪肌肉组织中极显著高表达。通过搜索miRanda数据库(http://34.236.212.39/microrna/home.do)，预测其吸附调控的靶标miRNA为ssc-miR-133a-5p(图1)。

其中，长白猪和蓝塘猪均在文献“蓝塘猪与长白猪正反交F1代胴体性状和肉品质的比较.华南农业大学学报,2015,36(5):1-6”中公开。

实施例2荧光定量PCR检测猪肌肉组织中circLIMCH1的表达

试剂：

反转录试剂盒：PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)，#RR047Q，Takara；

定量PCR试剂：

Fast qPCR Mix，#RR430A，Takara。

相关实验物品去RNase处理：

1)将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高温烤干2小时以上。

2)将塑料器皿(如：EP管/枪头)使用前需用0.1％DEPC水侵泡过夜，后控干液体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。

总RNA提取：

选取50例长白猪肌肉组织和50例蓝塘猪肌肉组织，参照Invitrogen试剂盒说明书采用TRIzol法进行，具体步骤如下：

1)取黄豆粒大小的肌肉组织样置于液氮预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉；

2)待无明显颗粒存在，转移粉末状组织至1.5mL离心管中；

3)加入1mL Trizol，迅速剧烈震荡，室温孵育10min，使细胞裂解完全；

4)加入200μL氯仿，用力上下摇动90s，放置冰上孵育5min；

5)4℃，12,000r/min离心15min，将上清液转移至另一个新的1.5mL离心管中；

6)加入等体积异丙醇，混匀，静置10min沉淀RNA；

7)4℃，12,000r/min离心10min，弃上清；

8)75％乙醇洗涤沉淀二次，室温下自然干燥5min；

9)加50μL DNase I混合液，75℃溶解5min，-80℃保存备用。

用1.2％琼脂糖凝胶电泳初步检测总RNA的完整性；安捷伦生物分析仪Agilent2100(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)进一步检测总RNA的质量和溶度，取1μL样品在70℃变性2min后，进行Agilent 2100检测。

cDNA合成及质量检测

1)总RNA检测合格后立即进行cDNA的合成，反转录使用的是大连宝生物公司的反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser)，首先按下表在0.2mLPCR管中配制去基因组反应体系，总反应体系为10μL，然后42℃放置2分钟。

5×gDNA Eraser Buffer	2μL
		gDNA Erase	1μL
总RNA	1000ng
		RNase-free dH<sub>2</sub>O	加至10μL
反应体系	10μL

2)在上述反应液中依次加入5×PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScript RTEnzyme Mix I 1μL，随机6碱基反转录引物0.5μL，及RNase-free dH₂O 4.5μL，共计20μL。37℃反应30分钟，85℃反应15秒终止。然后加入180μL RNase free dH₂O稀释至200μL储存在-20℃，用于后续试验。

定量分析

1)本试验用大连宝生物公司

Fast qPCR Mix试剂进行实时定量PCR分析。每个样品设置3个重复，每对引物设置3个阴性对照。以GAPDH作为内参基因，反应体系及条件如下表：

2×SYBR Premix Ex Taq II	12.5μL
		上游引物(10μM)	1μL
下游引物(10μM)	1μL
		cDNA	1.5μL
RNase-free dH<sub>2</sub>O	Up to 25μL
		反应体系	25μL

其中，针对circLIMCH1的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4。

GAPDH内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO：5，下游引物序列为SEQ ID NO：6。

2)实时定量PCR反应条件：首先95℃预变性30秒；40个循环，每个循环95℃变性5秒，60℃退火30秒；循环结束后记录65～95℃范围内的溶解曲线。

3)基因表达丰度用2^-ΔΔCt法表示，在长白和蓝塘肌肉组织中circLIMCH1相对表达结果见图2。根据图2可知，ssc-miR-423-5p在蓝塘猪肌肉组织中表达量极显著低于长白猪。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 与猪胴体肉品质相关的circRNA标志物及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1201

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> circLIMCH1

<400> 1

auacggaccg agaacuccug ugucugauga cgcagagagc accaguaugu uugacaugcg 60

gugugaggag gaggccgcgg ugcagccgca cagcagggcc cgccaggagc agcugcagcu 120

gauaaauaac cagcugcggg aagaggacga caaauggcaa gaugaccugg cucguuggaa 180

aagccggaga agaagugcuu cucaggacuu aaucaagaaa gaggaagaaa ggaaaaaaau 240

ggagaaguua cuggcuggag aggaugggac acgugaacga aggaaaagca ucaaaaccua 300

cagagaaauu guccaagaaa aagagcggag agagagggag uugcaugagg cguacaagaa 360

cgcacggucc caggaggagg cggaagggau ccuucagcag uauaucgaga gguucacuau 420

cagcgaagcu guucucgaac guuuggagau gccaaaaauu cuggaaagaa gccauucagc 480

agagccaaac ucauccuccu uccuggauga ccccaacccc augaaauacc ugcggcaaca 540

gucacugccu ccacccaagu ucacugccac uguggaaacc accaucacuc guaccagcgu 600

uccggaugcc agcaugucag caggcagugg gucuccgagc aaaacuguca cucccaaagc 660

cgugccuaug cugacaccca agccuuacuc ccagcccaaa aacucucaag agguucugaa 720

gaccuucaag guagauggaa aagucagcau gaauggagag acaguucaug gugacgagga 780

gaaggaaaga gaguguccuc cgggggcaca uacucccucc uugaccaaau cccagauguu 840

ugaaggugug gccagggugc acgggucccc cguggagcug aaacaagaca acaauagcau 900

ugagaucaac auaaagaagc caaguucucu uccccaagag cuaccggcaa ccauugagga 960

aacugaugca aaccgucaag aagaugagag ugauggugaa aaaagagaaa aagggaauac 1020

ggacauuguc ucgccagaac cacagcauuu uacaacaacu gugacgcgau ccagcccgac 1080

cguggccuuu guggagcuuu ccuccagucc ucagcugaag aacgaggugc cagaagagaa 1140

agagcagaag aaacuggaaa augaaaugag cggaaaggug gaguuggugc ugucacaaaa 1200

g 1201

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssc-miR-133a-5p

<400> 2

agcugguaaa auggaaccaa au 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 针对circLIMCH1的上游引物

<400> 3

gtctcgccag aaccacagca ttt 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 针对circLIMCH1的下游引物

<400> 4

agccaggtca tcttgccatt tgt 23

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH内参基因的上游引物

<400> 5

ctgccgcctg gagaaacct 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH内参基因的下游引物

<400> 6

gctgtagcca aattcattgt cg 22

Claims

1.一种与猪胴体肉品质相关的circRNA标志物，其特征在于：

所述的circRNA标志物为circLIMCH1，其序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种如权利要求1所述的circRNA标志物的检测引物，其特征在于所述检测引物为：

circLIMCH1的上游引物序列为：5′-GTCTCGCCAGAACCACAGCATTT-3′；

circLIMCH1的下游引物序列为：5′-AGCCAGGTCATCTTGCCATTTGT-3′。

3.权利要求1所述的circRNA标志物或权利要求2所述的检测引物在遗传标记辅助育种及改善猪胴体肉品质中的应用。

4.权利要求1所述的circRNA标志物或权利要求2所述的检测引物在制备遗传标记辅助育种及改善猪胴体肉品质的试剂盒中的应用。

5.一种检测权利要求1所述的circRNA标志物的试剂盒，其特征在于含有权利要求2所述的circRNA标志物的检测引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：

所述的试剂盒还含有针对权利要求1所述circLIMCH1的反转录试剂、内参引物、荧光定量PCR反应液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：

所述的内参引物包括GAPDH内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDNO：5，下游引物序列为 SEQ ID NO：6。

8.权利要求5～7任一项所述的试剂盒在猪肌肉组织中circLIMCH1的定量检测中的应用。

9.一种检测权利要求1所述的circRNA标志物的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）提取猪肌肉组织总RNA；

2）通过反转录随机引物在反转录酶的作用下进行circLIMCH1反转录成cDNA；

3）在荧光实时定量PCR仪上将步骤2）获得的cDNA进行扩增检测；

4）通过溶解曲线分析，2^-ΔΔCt法进行相对定量。