CN114293268A - 一种封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种封装鼠李糖乳杆菌1.0320核‑壳纤维及其制备方法与应用，属于功能食品技术领域。制备方法为将尤特奇S100粉末溶解在无水乙醇/二甲基乙酰胺中，获得壳层尤特奇S100溶液；将果胶溶液、聚乙烯醇溶液和活化二代的鼠李糖乳杆菌1.0320菌液充分混匀，通过同轴静电纺丝技术制备封装了鼠李糖乳杆菌1.0320的纤维，操作简单，显著的提高了纤维的热稳定性，制备的纤维能够使鼠李糖乳杆菌1.0320经过胃液和肠液后仍能保持较高的存活率，靶向到达结肠发挥功效，可应用到口服的益生菌补充剂或添加到功能性食品中。
Description
技术领域
本发明涉及一种封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维及其制备方法与应用，属于功能食品技术领域。
背景技术
益生菌是活的微生物，当摄入充足的数量时，它会赋予宿主某种健康的好处。益生菌具有调节肠道菌群组成，抑制病原菌等多种益生作用，益生菌产品的加工、运输、贮藏、销售和摄入到体内的过程中，通常会受到酸性、高温等各种不利条件的影响，造成活菌数的下降，限制了益生菌的应用，因此，为了确保益生菌到达结肠处仍能维持较高的活菌数，益生菌封装技术作为一种有效的解决办法被广泛应用。
微胶囊技术是一种较为有效、应用最为广泛的技术，微胶囊技术封装益生菌最常用的方法为喷雾干燥法、挤压法、冷冻干燥法和乳化法，然而微胶囊技术存在一定的弊端，如喷雾干燥法和冷冻干燥法需要在极端环境下进行造成活菌数下降，乳化法和挤压法由于粒径的大小限制了微胶囊的应用，因此，对于新型益生菌封装技术的研究是很有必要的。静电纺丝是一种成本较低，效率较高的技术，制备的纤维通常是纳米级和亚微米级的纤维，静电纺丝制备的纤维具有高孔隙率、比表面积大、不产生热量等优点，静电纺丝技术在封装过程中不产生热量，无需使用有毒的有机溶剂，不会影响生物活性组分的性质，同轴静电纺丝技术主要应用在医药领域，通过利用同轴静电纺丝技术制备封装药物的纤维，减少了药物在体内的突释情况，制备的纤维具有良好的缓释性能。同轴静电纺丝技术的主要目的是将生物活性组分封装在纤维中，使其具有高的负载率并保持生物活性，由于同轴静电纺丝技术能够简便、有效地将肽类、维生素类等生物活性物质封装，因此，如果利用同轴静电纺丝技术制备出可以封装益生菌的纤维，对于开发新的益生菌保护制剂有着良好的研究前景。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维及其制备方法与应用，通过同轴静电纺丝技术，实现了鼠李糖乳杆菌1.0320的封装，与单轴静电纺丝纤维相比，提高了纤维的热稳定性，提高了鼠李糖乳杆菌1.0320通过模拟胃液和模拟肠液后的存活率。可以将其应用到口服益生菌补充剂或添加到功能性食品中。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的制备方法，包括以下步骤：
(1)核层纺丝溶液的制备：将果胶溶液和聚乙烯醇溶液混匀后，加入鼠李糖乳杆菌1.0320重悬菌液混合均匀，得到核层纺丝溶液；
(2)壳层纺丝溶液的制备：尤特奇S100加入到无水乙醇/二甲基乙酰胺混合溶剂中，充分混合均匀，得到壳层纺丝溶液；
(3)将步骤(2)制备的壳层纺丝溶液和步骤(1)制备的核层纺丝溶液通过同轴静电纺丝得到封装鼠李糖乳杆菌1.0320的核-壳纤维。
进一步地，步骤(1)中所述果胶溶液的质量浓度为11％，聚乙烯醇溶液的质量浓度为12％。
进一步地，步骤(1)中所述果胶溶液的制备方法为：将11g果胶粉末加入到100mL无菌蒸馏水中，微热磁力搅拌2-3h至果胶溶液均匀，制得质量浓度为11％的果胶溶液。
进一步地，步骤(1)中所述聚乙烯醇溶液的制备方法为：将12g聚乙烯醇粉末加入到100mL无菌蒸馏水中，95℃下磁力搅拌水浴2h，制得质量浓度为12％的聚乙烯醇溶液，静置消泡，冷却至室温备用。
进一步地，步骤(1)中所述鼠李糖乳杆菌1.0320重悬菌液的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌1.0320以2％的接种量接种到MRS液体培养基中培养18h-24h得到活化一代菌液，再将所述活化一代菌液以2％接种量接种到新的MRS液体培养基中培养18h得到活化二代菌液，取二代菌液20mL在4℃、8000r/min下离心10min，无菌吸管吸去上清液保留沉淀，用PBS缓冲溶液清洗3次后重悬得到所述鼠李糖乳杆菌1.0320重悬菌液。
进一步地，步骤(1)中所述果胶溶液、聚乙烯醇溶液与鼠李糖乳杆菌1.0320重悬菌液的料液比为9g:1g:400μL，加入鼠李糖乳杆菌1.0320重悬菌液后在室温下混合1h。
进一步地，步骤(2)中所述尤特奇S100与无水乙醇/二甲基乙酰胺混合溶剂的料液比为14g：100mL，所述混合为在室温下混合3h。
进一步地，步骤(2)中所述无水乙醇/二甲基乙酰胺混合溶剂中无水乙醇和二甲基乙酰胺的体积比为9：1。
进一步地，步骤(3)中所述同轴静电纺丝的纺丝电压：15kV，接收距离：14cm，核层纺丝溶液进样速率为0.4mL/h，壳层纺丝溶液进样速率为1.6mL/h。
进一步地，所述制备过程均在无菌条件下进行。
进一步地，所述室温为25℃。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维。
本发明还提供了上述的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维在口服益生菌补充剂或功能性食品中的应用。
本发明所用鼠李糖乳杆菌1.0320保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15557，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年04月08号。
本发明公开了以下技术效果：
(1)与常规的同轴静电纺丝技术使用的非医药级聚乙烯醇不同，本发明使用的原料均为医药级和食品级，采用的同轴静电纺丝技术操作简单，操作过程不产生热量，温和的条件能够保证益生菌的存活，制备的纤维有潜力直接应用在药品和功能性食品中。
(2)本发明创新性的使用医用材料尤特奇S100作为同轴静电纺丝技术封装益生菌的壳层材料，经实验发现，当溶剂无水乙醇/二甲基乙酰胺的比例为9:1时，制备的尤特奇S100溶液不会影响纺丝过程中鼠李糖乳杆菌1.0320的存活率，并且尤特奇S100是一种pH响应型材料，制备的纤维只能在pH＞7的溶液体系中溶解，这种pH响应性使本发明制备的纤维能够保护鼠李糖乳杆菌1.0320顺利通过胃液肠液，到达结肠处释放出封装的鼠李糖乳杆菌1.0320。
(3)本发明通过同轴静电纺丝技术制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320的纤维，与单轴静电纺丝技术制备的纤维相比，显著提高了纤维的热稳定性。本发明制备的纤维具有pH响应性，显著提高了鼠李糖乳杆菌1.0320在模拟胃液和小肠液中的存活率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中尤特奇S100溶液浓度为10％时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中A为扫描电子显微镜图，A’为直径分布图；
图2为实施例1中尤特奇S100溶液浓度为12％时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中B为扫描电子显微镜图，B’为直径分布图；
图3为实施例1中尤特奇S100溶液浓度为14％时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中C为扫描电子显微镜图，C’为直径分布图；
图4为实施例1中尤特奇S100溶液浓度为16％时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中D为扫描电子显微镜图，D’为直径分布图；
图5为实施例1中尤特奇S100溶液浓度为18％时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中E为扫描电子显微镜图，E’为直径分布图；
图6为实施例2中纺丝电压为13kV时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中A为扫描电子显微镜图，A’为直径分布图；
图7为实施例2中纺丝电压为15kV时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中B为扫描电子显微镜图，B’为直径分布图；
图8为实施例2中纺丝电压为17kV时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中C为扫描电子显微镜图，C’为直径分布图；
图9为实施例3中接收距离为10cm时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中A为扫描电子显微镜图，A’为直径分布图；
图10为实施例3中接收距离为12cm时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中B为扫描电子显微镜图，B’为直径分布图；
图11为实施例3中接收距离为14cm时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中C为扫描电子显微镜图，C’为直径分布图；
图12为实施例3中接收距离为16cm时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中D为扫描电子显微镜图，D’为直径分布图；
图13为实施例3中接收距离为18cm时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中E为扫描电子显微镜图，E’为直径分布图；
图14为实施例4中壳层进样速率为1.2mL/h时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中A为扫描电子显微镜图，A’为直径分布图；
图15为实施例4中壳层进样速率为1.6mL/h时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中B为扫描电子显微镜图，B’为直径分布图；
图16为实施例4中壳层进样速率为2.0mL/h时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，其中C为扫描电子显微镜图，C’为直径分布图；
图17为实施例6制备得到的同轴纤维的TEM图；
图18为实施例7制备的同轴纤维的X衍射谱图，其中A为单轴静电纺丝核层纤维X衍射谱图，B为壳层粉末、单轴壳层静电纺丝纤维和同轴核-壳纤维X衍射谱图；
图19为实施例8中同轴纤维的傅里叶变换红外光谱图；
图20为实施例9中制备得到的同轴纤维的热性能分析曲线图；
图21为实施例10中制备得到的同轴纤维的荧光显微镜图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所用鼠李糖乳杆菌1.0320保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15557，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年04月08号。
本发明所用其他原料均可通过市售购买得到，为医药级和食品级。
本发明的制备过程均在无菌条件下进行。
本发明中的室温条件为25℃。
以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
(1)核层纺丝溶液的制备：将12g聚乙烯醇粉末加入到100mL无菌蒸馏水中，95℃下磁力搅拌水浴2h，制得质量浓度为12％的聚乙烯醇溶液，静置消泡，冷却至室温备用。
将11g果胶粉末加入到100mL无菌蒸馏水中，微热磁力搅拌2-3h至果胶溶液均匀，制得质量浓度为11％的果胶溶液。
将冻存的鼠李糖乳杆菌1.0320以2％的接种量接种到MRS液体培养基中培养18h-24h活化一代，再将一代菌液以2％接种量接种到新的MRS液体培养基中培养18h活化二代，取二代菌液20mL离心(4℃，8000r/min，10min)，无菌吸管吸去上清液保留沉淀，再用PBS缓冲溶液清洗3次，之后重悬至1mL。
取9g聚乙烯醇溶液和1g果胶溶液混合，室温下磁力搅拌1h混合均匀，即可得到核层纺丝溶液。
(2)壳层纺丝溶液的制备：将10g、12g、14g、16g和18g尤特奇S100粉末分别加入到100mL无水乙醇/二甲基乙酰胺混合溶剂中，室温条件下磁力搅拌3h使尤特奇S100粉末充分溶解，制备浓度为10％、12％、14％、16％和18％的尤特奇S100溶液。
(3)壳层纺丝溶液和核层纺丝溶液分别置于同轴静电纺丝设备的注射器中，纺丝电压：15kV；接收距离：14cm；进样速率：壳层溶液进样速率固定为1.2mL/h，核层溶液进样速率固定为0.3mL/h，核层纺丝溶液从同轴针头的内针推出，壳层纺丝溶液从同轴针头的外针推出，纤维收集到铝箔上，环境温度为25±5℃，环境湿度为30±10％，即可得到封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维。
图1～5分别为尤特奇S100溶液浓度为10％、12％、14％、16％和18％时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，通过比较图1～5可以看出，当尤特奇S100浓度为14％时，纤维的粗细均匀，形貌较好，确定壳层尤特奇S100的最佳浓度为14％，即尤特奇S100与无水乙醇/二甲基乙酰胺混合溶剂的料液比为14g：100mL。
实施例2
(1)按照实施例1中的步骤(1)制备核层纺丝溶液。
(2)按照实施例1中的步骤(2)和实施例1中的结论制备14％尤特奇S100作为壳层纺丝溶液。
(3)壳层纺丝溶液和核层纺丝溶液分别置于同轴静电纺丝设备的注射器中，将接收距离固定为14cm，壳层进样速率固定为1.2mL/h，核层进样速率固定为0.3mL/h，分别调整纺丝电压为13kV、15kV和17kV，核层纺丝溶液从同轴针头的内针推出，壳层纺丝溶液从同轴针头的外针推出，纤维收集到铝箔上，环境温度为25±5℃，环境湿度为30±10％。
图6～8分别为纺丝电压为13kV、15kV和17kV时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，通过比较图6～8可以看出，当纺丝电压为15kV时，可以形成较好的同轴纤维，纤维直径分布均匀，无珠粒，形貌较好，确定同轴静电纺丝最佳的纺丝电压为15kV。
实施例3
(1)按照实施例1中的步骤(1)制备核层纺丝溶液。
(2)按照实施例1中的步骤(2)和实施例1中的结论制备14％尤特奇S100作为壳层纺丝溶液。
(3)壳层纺丝溶液和核层纺丝溶液分别置于同轴静电纺丝设备的注射器中，将纺丝电压固定为实施例2得到的最优纺丝电压15kV，壳层进样速率固定为1.2mL/h，核层进样速率固定为0.3mL/h，分别调整接收距离为10cm、12cm、14cm、16cm和18cm，核层溶液从同轴针头的内针推出，壳层溶液从同轴针头的外针推出，纤维收集到铝箔上，环境温度为25±5℃，环境湿度为30±10％。
图9～13分别为接收距离为10cm、12cm、14cm、16cm和18cm时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，通过比较图9～13可以看出，当纺丝距离为14cm时，纤维形貌较好，直径分布均匀，可以形成较好的同轴纤维，确定同轴静电纺丝最佳的接收距离为14cm。
实施例4
(1)按照实施例1中的步骤(1)制备核层纺丝溶液。
(2)按照实施例1中的步骤(2)和实施例1中的结论制备14％尤特奇S100作为壳层纺丝溶液。
(3)壳层和核层纺丝溶液分别置于同轴静电纺丝设备的注射器中，将纺丝电压固定为实施例2得到的最优纺丝电压15kV，将接收距离固定为实施例3得到的最优接收距离14cm，固定壳层进样速率和核层进样速率比为4:1，分别调整壳层进样速率为1.2mL/h、1.6mL/h和2.0mL/h，核层溶液从同轴针头的内针推出，壳层溶液从同轴针头的外针推出，纤维收集到铝箔上，环境温度为25±5℃，环境湿度为30±10％。
图14～16分别为壳层进样速率为1.2mL/h、1.6mL/h和2.0mL/h时制备的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的扫描电子显微镜图和直径分布图，通过比较图14～16可以看出，当壳层进样速率为1.6mL/h，核层进样速率为0.4mL/h时，纤维直径均匀性较好，无珠粒出现，纤维形貌较好，纤维的平均直径为1563.14±263.14nm，同轴静电纺丝最佳的壳层进样速率为1.6mL/h，核层进样速率为0.4mL/h。
实施例5
不同壳层溶剂比例对于同轴纤维封装鼠李糖乳杆菌1.0320活菌数的影响，包含以下步骤：
(1)按照实施例1中的步骤(1)制备核层纺丝溶液，再吸取400μL重悬菌液加入到聚乙烯醇和果胶共混溶液中，磁力搅拌至混合均匀。
(2)14g尤特奇S100粉末溶解在100mL不同体积比的无水乙醇/二甲基乙酰胺(9:1、8:2、7:3)混合溶剂中，室温条件下磁力搅拌3h使尤特奇S100粉末充分溶解，将溶解在不同体积比溶剂中尤特奇S100的溶液作为壳层纺丝溶液。
(3)壳层和核层纺丝溶液分别置于同轴静电纺丝设备的注射器中，将纺丝电压固定为实施例2得到的最优纺丝电压15kV，将接收距离固定为实施例3得到的最优接收距离14cm，壳层进样速率固定为1.6mL/h，核层进样速率固定为0.4mL/h，核层溶液从同轴针头的内针推出，壳层溶液从同轴针头的外针推出，纤维收集到铝箔上，环境温度为25±5℃，环境湿度为30±10％。
(4)12mg载有鼠李糖乳杆菌1.0320的同轴纤维，添加到4mLPBS缓冲溶液中(pH＝7.4)，吸取400μL溶解了同轴纤维的PBS缓冲溶液加入到20mL MRS液体培养基中，37℃活化24h，再按照国标GB4789.2-2016中的倾注法检测鼠李糖乳杆菌1.0320的活菌数，每个稀释度的样品平行检测三次。测试结果见表1。
表1不同壳层溶剂比的同轴纤维封装鼠李糖乳杆菌1.0320的活菌数
注：不同上标小写字母表示有显著差异(P<0.05)
由表1可以得出，无水乙醇与二甲基乙酰胺的体积比为9:1时为制备壳层尤特奇S100溶液溶剂的最佳比例。
实施例6
同轴纤维的核壳结构透射电子显微镜图，包含以下步骤：
(1)按照实施例1中的步骤(1)制备核层纺丝溶液，再吸取400μL重悬菌液加入聚乙烯醇和果胶的共混溶液中，磁力搅拌至混合均匀。
(2)14g尤特奇S100粉末溶解在100mL无水乙醇/二甲基乙酰胺(体积比9:1)混合溶剂中，室温条件下磁力搅拌3h使尤特奇S100粉末充分溶解，将溶解在不同体积比溶剂中尤特奇S100的溶液作为壳层纺丝溶液。
(3)壳层纺丝溶液和核层纺丝溶液分别置于同轴静电纺丝设备的注射器中，将纺丝电压固定为实施例2得到的最优纺丝电压15kV，将接收距离固定为实施例3得到的最优接收距离14cm，将壳层进样速率固定为实施例4得到的最优壳层进样速率1.6mL/h，核层进样速率固定为0.4mL/h，核层溶液从同轴针头的内针推出，壳层溶液从同轴针头的外针推出，纤维收集到铝箔上，环境温度为25±5℃，环境湿度为30±10％。
(4)纺丝前将铜网固定在接收板的铝箔上，纺丝过程中会有纤维堆积在铜网上，当观察到铜网上有一层较薄的白色纤维后，取下铜网，将铜网放置在TEM的载物台上观察。
图17为实施例6制备得到的同轴纤维的TEM图，可以看出纤维有着明显的核壳结构，说明成功制备出同轴纤维。
实施例7
同轴纤维X衍射谱图，包含以下步骤：
(1)按照实施例5中的步骤(1)制备核层纺丝溶液。
(2)根据实施例5中的步骤(2)制备壳层纺丝溶液。
(3)根据实施例5中的步骤(3)制备同轴静电纺丝纤维。
(4)尤特奇S100粉末、封装鼠李糖乳杆菌1.0320的单轴核层聚乙烯醇/果胶纤维，单轴壳层尤特奇S100纤维和同轴封装鼠李糖乳杆菌1.0320的纤维的X衍射谱图通过X衍射仪检测。X衍射仪仪器参数：Cu-Kα射线，电压：40kV，电流：30mA，扫描范围为5°-85°(2θ)，扫描速率为2°/min。得到的数据使用JADE软件进行分析。
图18为实施例7制备的同轴纤维的X衍射谱图，可以看出封装了鼠李糖乳杆菌1.0320的同轴纤维为非晶态结构。
实施例8
同轴纤维傅里叶变换红外光谱图，包含以下步骤：
(1)按照实施例5中的步骤(1)制备核层纺丝溶液。
(2)根据实施例5中的步骤(2)制备壳层纺丝溶液。
(3)根据实施例5中的步骤(3)制备同轴静电纺丝纤维。
(4)使用傅里叶变换红外光谱仪检测尤特奇S100粉末、封装鼠李糖乳杆菌1.0320的单轴核层聚乙烯醇/果胶纤维，单轴壳层尤特奇S100纤维和同轴封装鼠李糖乳杆菌1.0320纤维的红外光谱，分辨率设定为4cm-1，扫描波长范围为4000-500cm-1，扫描32次。
图19为实施例8中同轴纤维的傅里叶变换红外光谱图，说明了核层结构的成功制备，并不是核层和壳层纤维的简单混合。
实施例9
同轴纤维热性能分析曲线，包含以下步骤：
(1)按照实施例5中的步骤(1)制备核层纺丝溶液。
(2)根据实施例5中的步骤(2)制备壳层纺丝溶液。
(3)根据实施例5中的步骤(3)制备同轴静电纺丝纤维。
(4)分别称量10mg尤特奇S100粉末、封装鼠李糖乳杆菌1.0320的单轴核层聚乙烯醇/果胶纤维，单轴壳层尤特奇S100纤维和同轴封装鼠李糖乳杆菌1.0320的纤维加入到坩埚中，在氮气环境中，从25℃加热到700℃，升温速率为10℃/min。检测尤特奇S100粉末、封装鼠李糖乳杆菌1.0320的单轴核层聚乙烯醇/果胶纤维，单轴壳层尤特奇S100纤维和同轴封装鼠李糖乳杆菌1.0320的纤维重量损失的变化。
图20为实施例9中制备得到的同轴纤维的热性能分析曲线图，与封装鼠李糖乳杆菌1.0320的单轴核层聚乙烯醇/果胶/鼠李糖乳杆菌1.0320纤维相比，封装了鼠李糖乳杆菌1.0320的同轴纤维具有更高的热稳定性。
实施例10
荧光显微镜下同轴纤维中封装的染色的鼠李糖乳杆菌1.0320，包含以下步骤：
(1)将离心管中冻存的罗丹明123染液取出稀释至5μg/mL，加入到重悬的菌液中，37℃暗处孵育1h，离心(4℃，8000r/min，10min)吸去上清液中残留的染液保留沉淀，再用PBS缓冲溶液重复以上步骤清洗三次。
(2)按照实施例1中的步骤(1)制备核层纺丝溶液，再吸取400μL重悬的染色菌液加入到聚乙烯醇和果胶共混溶液中，避光磁力搅拌至混合均匀。
(3)根据实施例5中的步骤(2)制备壳层纺丝溶液。
(4)根据实施例5中的步骤(3)制备同轴静电纺丝纤维，为了防止罗丹明123的猝灭，静电纺丝过程在暗处进行。
(5)取下部分较薄的纤维置于载玻片上，使用荧光显微镜观察染色的鼠李糖乳杆菌1.0320在纤维膜中的分布。
图21为实施例10中荧光显微镜下同轴纤维中封装的染色的鼠李糖乳杆菌1.0320，可以看出鼠李糖乳杆菌1.0320均匀的分布在同轴静电纺丝纤维内部，沿着纤维的走向线性排列，几乎每一根纤维内部都封装了鼠李糖乳杆菌1.0320，鼠李糖乳杆菌1.0320能够被完全封装在同轴静电纺丝纤维内部。
实施例11
同轴纤维封装的和未封装的鼠李糖乳杆菌1.0320经过模拟胃肠体系后的活菌数，包含以下步骤：
(1)按照实施例5中的步骤(1)制备核层纺丝溶液。
(2)根据实施例5中的步骤(2)制备壳层纺丝溶液。
(3)根据实施例5中的步骤(3)制备同轴静电纺丝纤维。
(4)模拟胃液配方：依次加入0.138mL 0.5mol/L的氯化钾溶液，0.018mL 0.5mol/L的磷酸二氢钾溶液，0.25mL1mol/L的碳酸氢钠溶液，0.236mL 2mol/L的氯化钠溶液，0.008mL 0.5mol/L的六水氯化镁溶液，加水至总体积10mL，使用6mol/L盐酸溶液调节pH＝3.0，加入0.1g胃蛋白酶，搅拌至溶解。
(5)模拟肠液的配方：参照中国药典的方法略作修改，称取0.068g磷酸二氢钾溶解在10mL水中，使用1mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH＝6.8，加入0.1g胰蛋白酶，搅拌均匀至完全溶解。
(6)准确称取100mg封装了鼠李糖乳杆菌1.0320的同轴纤维，分别置于10mL模拟胃液和模拟肠液中，37℃100rpm在摇床上分别培养2h和4h后，按照实施例4中的方法检测活菌数。
实施例11中同轴纤维封装的和未封装的鼠李糖乳杆菌1.0320经过模拟胃肠体系后的活菌数如表2和表3所示，在壳层材料和核层材料的双重保护下，经过同轴纤维封装的鼠李糖乳杆菌1.0320在经胃液处理后的存活率达到了90.07％，经肠液处理后的存活率达到了91.96％，与未封装的鼠李糖乳杆菌1.0320相比，极大的增加了经过模拟胃液和模拟肠液后封装的鼠李糖乳杆菌1.0320的存活率。
表2模拟胃液处理后同轴纤维封装的鼠李糖乳杆菌1.0320和未封装的鼠李糖乳杆菌1.0320的活菌数
注：同一列不同上标小写字母表示有显著差异(P<0.05)
表3模拟肠液处理后同轴纤维封装的鼠李糖乳杆菌1.0320和未封装的鼠李糖乳杆菌1.0320的活菌数
注：同一列不同上标小写字母表示有显著差异(P<0.05)
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)核层纺丝溶液的制备：将果胶溶液和聚乙烯醇溶液混匀后，加入鼠李糖乳杆菌1.0320重悬菌液混合均匀，得到核层纺丝溶液；
(2)壳层纺丝溶液的制备：尤特奇S100加入到无水乙醇/二甲基乙酰胺混合溶剂中，充分混合均匀，得到壳层纺丝溶液；
(3)将步骤(2)制备的壳层纺丝溶液和步骤(1)制备的核层纺丝溶液通过同轴静电纺丝得到封装鼠李糖乳杆菌1.0320的核-壳纤维。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述果胶溶液的质量浓度为11％，聚乙烯醇溶液的质量浓度为12％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述果胶溶液、聚乙烯醇溶液与鼠李糖乳杆菌1.0320重悬菌液的料液比为9g:1g:400μL，加入鼠李糖乳杆菌1.0320重悬菌液后在室温下混合1h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述鼠李糖乳杆菌1.0320重悬菌液的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌1.0320以2％的接种量接种到MRS液体培养基中培养18h-24h得到活化一代菌液，再将所述活化一代菌液以2％接种量接种到新的MRS液体培养基中培养18h得到活化二代菌液，取二代菌液在4℃、8000r/min下离心10min，取沉淀用PBS缓冲溶液清洗后重悬得到所述鼠李糖乳杆菌1.0320重悬菌液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述尤特奇S100与无水乙醇/二甲基乙酰胺混合溶剂的料液比为14g：100mL，所述混合为在室温下混合3h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述无水乙醇/二甲基乙酰胺混合溶剂中无水乙醇和二甲基乙酰胺的体积比为9：1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述同轴静电纺丝的纺丝电压：15kV，接收距离：14cm，核层纺丝溶液进样速率为0.4mL/h，,壳层纺丝溶液进样速率为1.6mL/h。
8.一种权利要求1～7任一项所述制备方法制备得到的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维。
9.权利要求8所述的封装鼠李糖乳杆菌1.0320核-壳纤维在口服益生菌补充剂或功能性食品中的应用。
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