CN114280023A - 集成分析器件阵列 - Google Patents

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light
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安妮特·格罗特
拉维·萨克塞纳
保罗·伦德奎斯特
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Pacific Biosciences of California Inc
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Abstract

本申请提供了一种集成分析器件阵列及其生产方法。所述阵列用于分析以大数量高密度方式分布的高度复用的光学反应(包括诸如如核苷酸测序反应的生化反应)。所述器件实现了使用诸如光谱、幅度和时间分辨率或它们的组合之类的特征来对光信号进行高灵敏度的区分。所述器件包括集成衍射光束成形元件，其提供对从光学反应发射的光进行空间分离。

Description

集成分析器件阵列
本申请是基于申请日为2015年8月26日、申请号为201580058653.8、发明创造名称为“集成分析器件阵列”的中国专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年8月27日提交的美国临时申请No.62/042,793的权益，其公开以引用方式全文并入本文中。
背景技术
在分析系统中，增加给定系统在任何给定时间实施的分析的数量的能力一直是提高这类系统的效用并延长其寿命的关键组成部分。特别地，通过增加给定系统的分析复用因子，可以增大系统的总体吞吐量，从而在增加其有用性的同时降低与使用相关的成本。
在光学分析中，增加复用通常会造成更多的困难，因为这可能需要更复杂的光学系统、更优良的照射或检测能力、以及新的反应控制策略。在某些情况下，系统试图成倍地甚至成数量级地来增加复用，这进一步牵连到以上那些注意事项。同样，在某些情况下，系统要被用于的分析环境非常敏感，以至于给定系统中不同分析之间的变化会是不可接受的。这些目标通常与单纯地使系统更大并具有更高性能的蛮力法相矛盾，因为这样的方法通常会造成更坏的后果，例如，相互反应串扰、由于信号降低和噪声升高中的任一者或两者而导致的信噪比降低等。因此，期望的是，提供对于它们期望的分析具有大幅增加的复用并且尤其用于高度敏感反应分析的分析系统，并且在许多情况下，在这样做的同时使这种增加的复用所带来的负面影响最小化。
同时，还需要提高分析系统的性能，并降低与生产和使用该系统相关的成本。特别地，还需要增加分析系统的吞吐量。还需要缩小分析系统的规模并降低其复杂度。还需要具有灵活构造和易于扩展的分析系统。
发明内容
在一个方面，本发明通过提供一种集成分析器件阵列来解决上述问题和其它问题，其中，每一个器件包括：
纳米级发射体；
检测器层，其光学地耦接到所述纳米级发射体；
衍射光束成形元件，其设置在所述纳米级发射体和所述检测器层之间；以及
滤色层，其设置在所述衍射光束成形元件和所述检测器层之间；
其中，通过所述发射体内的多个发射物从该纳米级发射体发射光；
其中，所述检测器层包括多个感测区域；并且
其中，所述衍射光束成形元件在空间上分离从所述纳米级发射体发射的光，并且将空间上分离的光引导穿过所述滤色层从而到达所述多个感测区域。
在另一方面，本发明提供了一种集成分析器件阵列，其中每个器件包括：
纳米级发射体；
检测器层，其光学地耦接到所述纳米级发射体；
衍射光束成形元件，其设置在所述纳米级发射体和所述检测器层之间；以及
滤色层，其设置在所述衍射光束成形元件和所述检测器层之间，其中,所述滤色层包含2个至9个滤色元件，每个滤色元件专用于一定范围的光波长；
其中，通过所述发射体内的多个发射物从该纳米级发射体发射光；
其中，所述检测器层包括多个感测区域，并且其中，所述感测区域光学地耦接到所述滤色元件；并且
其中，所述衍射光束成形元件将从所述纳米级发射体发射的光在空间上分离成多个光束，并将空间上分离的光束引导穿过所述滤色元件从而到达所述感测区域。
在一些实施方案中，上述阵列还包括设置在纳米级发射体积内的分析物。在具体实施例中，分析物包括生物样品，在更具体的实施例中，生物样品包括核苷酸，并且在更加具体的实施例中，生物样品包括聚合酶。
上述阵列可以包括至少1000个、至少10000个、至少100000个、至少1000000个、或甚至至少10000000个纳米级发射体。
在另一方面，本发明提供了用于生产本文所公开的集成分析器件阵列的方法。
附图说明
图1A至图1B示意性地示出了可以使用所公开的集成分析器件阵列来执行的示例性核苷酸测序处理。
图2提供了集成分析器件的示意性框图。
图3A提供了两个信号事件的激发光谱的示意和标出的窄带激发照射，而图3B示意性地示出了基于这两个信号事件的窄带照射所得到的检测到的信号。
图4示意性地示出了四个荧光标记基团中的每一个的信号轮廓，其中，该信号轮廓与两个不同的滤光器轮廓中的每一个重叠。
图5示意性地示出了用于检测来自测序反应的信号的集成分析器件，其中透镜元件在空间上分离从反应单元发射的光，并将光引导穿过滤色层从而到达检测器层。
图6示意性地示出了双色双幅度边合成边测序(sequence-by-synthesis)反应的信号迹线。
图7示出了简化的集成分析器件的两个视图，其中，该集成分析器件包括用于在空间上对发射光进行分离的衍射光束成形元件。
图8示出了对衍射光束成形元件的设计(例如，衍射光束成形元件和检测器层之间的间隔)进行修改的效果。
图9表示来自ZMW/纳米孔的发射光透射穿过代表性的衍射光束成形元件设计。
图10示出了在没有滤光器的情况下波长对穿过双衍射光束成形元件的发射路径的影响及其效率。
图11示出了代表性的纳米级器件的设计、构造和分析，该纳米级器件包括用于对从发射体传输的光进行空间分离的衍射光束成形元件。
图12A示出了介电干涉滤光器对光学抑制的入射角的依赖性。图12B和图12C示意性地示出了在集成器件中各个位置处包括低折射率层以提高光学抑制效率。
图13示出了示例性吸收染料层的光学性质。
图14示出了示例性介电叠层的光学性质。
图15示意性地示出了示例性混合式激光抑制滤光器的结构和该滤光器的光学性质。
图16示出了示例性介电叠层的物理性质以及叠层数和光透射之间的关系。
图17示出了包括TiO2/Al2O3介电叠层和Aptina red1吸收层的混合滤光器的光学性质。
图18示出了包括TiO2/SiO2介电叠层和Aptina red1吸收层的混合滤光器的光学性质。
图19示出了由两个示例性暗镜涂层所实现的降低了的反射率。
图20示出了本公开的示例性阵列内的集成器件的布局。
图21示出了本发明的示例性器件阵列内的集成分析器件的具体特征。
图22示出了本器件的示例性单位晶格的组件及其一般特征。
图23示出了图22的组件的组装图。
图24提供了本公开的示例性单位晶格的横截面图。
图25示出了根据本公开而制造的示例性集成器件的横截面SEM显微图。
图26示出了用于制造包括衍射光束成形元件的集成分析器件阵列的示例性工艺流程。
具体实施方式
集成分析器件
复用光学分析系统用于多种不同的应用。这样的应用可以包括单分子的分析，并且可以涉及例如在各单生物分子进行反应时对它们进行实时观察。为了便于讨论，本文中根据以下优选应用来对这样的复用系统进行探讨：核苷酸序列信息的分析，特别是单分子核苷酸序列分析。虽然根据特定应用进行描述，但是应当理解，本文所述的器件和系统的应用范围更广泛。
在单分子核苷酸测序分析的上下文中，对单个固定的核苷酸合成复合物(其包括聚合酶、尝试阐明其序列的模板核苷酸和与模板序列的一部分互补的引物序列)进行观察，以识别被掺入到延伸引物序列中的各个核苷酸。通常通过在核苷酸掺入之前、期间或之后观察核苷酸上的光学可检测标记来监测掺入。在某些情况下，这种单分子分析采用“一次一碱基方法(one base at a time approach)”，由此将单一类型的标记核苷酸一次引入到复合物中并与该复合物相接触。掺入时，将未成功掺入的核苷酸从复合物中洗去，并且将掺入的标记核苷酸作为固定的复合物的一部分进行检测。
在某些情况下，仅添加单一类型的核苷酸用以检测掺入。然后，需要反复地对各种不同类型的核苷酸(例如，A、T、G和C)重复这些方法，从而能够确定模板的序列。由于在任何给定时间仅有单一类型的核苷酸与复合物相接触，任何掺入事件定义为所接触的核苷酸的掺入。这些方法虽然有些效果，但是当模板序列包括多个重复的核苷酸时，通常会遇到困难，这是因为可以掺入多个碱基，而其无法与单掺入事件相区分。在某些情况下，针对该问题所提出的解决方案包括调整现有核苷酸浓度，以确保单次掺入事件为动力学主导的。
在其它情况下，同时添加多种类型的核苷酸，但可通过存在于每种类型的核苷酸上的不同光学标签来对各核苷酸进行区分。因此，这样的方法可以使用单个步骤来识别序列中给定的碱基。特别地，将四个各自具有可区分标记的核苷酸均加入到固定的复合物中。然后，对该复合物进行鉴定(interrogate)以识别被掺入到模板序列中的是哪种类型的碱基，并照此识别被掺入的下一个碱基。
在某些情况下，这些方法仅对一次一碱基的添加进行监测，因此这些方法(以及在某些情况下的单核苷酸接触方法)需要额外的控制来避免在任何给定步骤中加入多个碱基并由此被检测系统漏检。通常，这类方法在核苷酸上使用终止体基团(terminator group)，使得一旦掺入了一个核苷酸就能阻止引物的进一步延伸。这些终止体基团通常是可去除的，以便在检测到的掺入事件之后对再延伸进行控制。同样，为了避免与先前掺入的核苷酸的标签混淆，这些核苷酸上的标记基团通常被配置为是可去除或可灭活的。
在另一个处理中，对单分子引物延伸反应进行实时监测，以识别出持续被掺入到延伸产物中的核苷酸，以阐明潜在的模板序列。在这种单分子实时(或SMRTTM)测序中，当在聚合酶介导模板依赖性引物延伸反应(polymerase-mediated template dependentprimer extension reaction)中发生了核苷酸掺入的过程时，对该过程进行监测。在优选的方面中，模板/聚合酶引物复合体通常被设置为被固定在光学受限区域(例如，零模式波导(ZMW))内或靠近透明基底、光波导等的表面处(参见例如美国专利No.6,917,726和No.7,170,050以及美国专利申请公开No.2007/0134128，其全部公开内容针对所有目的以引用方式整体并入本文中)。针对待被使用的荧光标记核苷酸，利用适当的激发辐射对光学受限区域进行照射。由于复合物在光学限制区域或非常小的照射体内，所以只有紧密环绕该复合物的反应体才受到激发辐射。因此，例如，在掺入事件期间，与复合物相互作用的那些荧光标记核苷酸存在于照射体中足够时间，从而被确定为已经掺入。虽然本文公开的器件中的相关分析物是掺入荧光标记核苷酸的模板/聚合酶引物复合物，但是应当理解，可以使用本公开的器件来对其它相关分析物(特别是相关的荧光分析物)进行监测。
图1中示出了该测序处理的示意图。如图1A所示，在例如零模式波导106的光限制的观察体(如虚线104所示)中提供了由聚合酶、模板核苷酸和引物序列构成的固定复合物102。当将合适的核苷酸类似物(例如，核苷酸108)掺入到新生核苷酸链中时，在掺入期间，对该合适的核苷酸进行一段时间(该时间与标记的核苷酸类似物保留在观察体内的时间相对应)的照射，这样做生成了与该保留相关的信号(例如，如图1B中的A迹线所示的信号脉冲112)。一旦已掺入，就将附着至被标记的核苷酸类似物的多磷酸盐成分的标记释放。当下一个适当的核苷酸类似物(例如核苷酸110)与复合物相接触时，该核苷酸类似物也被掺入，从而使图1B的T迹线中的信号114升高。如模板序列的潜在互补所指定的那样，通过对碱基掺入到新生链的过程进行监测，可以获得模板的长延伸的序列信息。
可以将上述测序反应并入到这样一个器件(通常是集成分析器件)中，其提供用于(理想上实时地)同时观察多个测序反应。虽然系统中的每个器件的各个部件和各器件的构造会变化，但是每个集成分析器件通常至少部分地包括如图2中的框图所示的通用结构。如图所示，集成分析器件200通常包括反应单元202，该反应单元202中设置有分析物(即，聚合酶-模板复合物和相关联的荧光反应物)并且光学信号从该反应单元发出。该分析系统还包括检测器元件220，其被设置为与反应单元202进行光通信。反应单元202和检测器元件220之间的光通信由光具组204(其包括通常被指定为206、208、210和212的一个或多个光学元件)提供，用于有效地将信号从反应单元202引导到检测器220。根据应用的细节，这些光学元件通常包括任意数量的诸如透镜、滤光器、光栅、反射镜、棱镜、折射材料、孔隙之类的元件或这些元件的各种组合。通过将这些元件集成到单个器件架构中，提高了反应单元与检测器之间光耦合的效率。集成分析系统(包括用于对反应单元进行照射和对从反应单元发射的光信号进行检测的各种方法)的示例在美国专利申请公开No.2012/0014837、No.2012/0019828和No.2012/0021525中描述，其全部内容针对所有目的以引用方式并入本文中。
如上所述，设置在反应单元(例如，图2中的元件202)内或固定在器件表面的分析物(例如，聚合酶-模板复合物及相关联的荧光反应物)发射光，并且该光被传输至检测器元件(例如，图2中的元件220)。对于荧光分析物，通过激发光源对分析物进行照射，而对于其它分析物(例如，化学发光物质或其它这样的分析物)，可以不需要激发光源。作为反应单元体的至少一部分的发射体光学地耦接到检测器元件，使得通过检测器元件对从该体内的分析物发射的光进行测量。为了使同时测量的分析物的数量最大化，应当尽可能地缩小本(instant)集成分析器件的尺寸，使得每个器件内的发射体均是纳米级发射体。理想地，纳米级发射体和检测器元件之间的光学耦合是高效的，以使器件的灵敏度最大化并使信号输出最大化。如下面进一步详细描述的那样，在从纳米级发射体发射的光到达检测器元件之前，可以例如通过透镜元件和滤色层来进一步操作所述光。
常规的分析系统通常对在光谱上有区别的多个信号或信号事件进行测量，因此为了对那些不同的信号事件进行分离并进行确定地检测，就必须要利用复杂的光学系统。然而，可以通过减少所检测到的在光谱上可区分的信号的数目或数量来简化集成器件的光路。然而，这种减少是在不减少可检测到的不同反应事件的数量的情况下被理想化地实现的。例如，在基于四个不同可检测信号事件来区分四个不同反应的分析系统中，其中，典型的系统会为每个不同的反应分配不同的信号光谱，从而检测和区分每个信号事件，而在替代方法中，将通过少于四个的不同信号光谱来表示四个不同的信号事件，作为替代，这四个不同的信号事件会至少部分依赖于信号事件之间的其它非光谱区别。
例如，为了识别和表征四种不同核苷酸中的每一种的掺入，常规下采用四个在光谱上可区分的信号的测序操作(例如，“四色”测序系统)在替代构造的上下文中可以采用单色或双色分析，例如，依赖于仅具有一个或两个有区别的或可区分的光谱信号的信号。然而，在这种替代构造中，对信号光谱复杂度的依赖性的这种降低并未以牺牲从产生反应事件的多个(即，大量)不同信号中区分信号的能力为代价。特别地，与仅依靠信号光谱来区分反应事件不同，这种替代构造可以依赖于与发射光谱不同的一个或多个信号特性(包括例如信号强度、激发光谱或二者)来将信号事件彼此区分开。
在一个特定的替代构造中，可以通过将信号强度用作两个或更多个信号事件之间的区别特征来由此简化集成分析器件中的光路。在其最简单的迭代中，参考示例性测序处理，两种不同类型的核苷酸均携带荧光标记，所述荧光标记在相同的激发照射(即，具有相同或基本上重叠的光谱带)下均发射荧光，由此将提供使用单个激发源进行激发的益处。由每个荧光标记所产生的信号将在相同的照射下具有不同的信号强度或幅度，并且因此可以根据它们各自的信号幅度来对这些信号进行区分。这两个信号可以具有部分或完全重叠的发射光谱，但是基于发射光谱的任何差异来进行信号的分离将是不必要的。
因此，对于使用信号幅度不同的两个或多个信号事件的分析系统，通过将通常用于分离在光谱上区分开的信号的那些部件(比如用于信号事件的多个激发源及其关联光具组以及例如滤光器和分色器的颜色分离光学器件)中的一部分或全部去除，这类系统的集成分析器件可以容易地获益，因为在许多情况下，所述集成分析器件针对每个在光谱上区分开的信号需要至少部分地分离的光具组和检测器。因此，这些集成分析器件的光路被大大简化，从而允许将检测器元件放置地更靠近反应单元，并且改善了这些器件的检测处理的总体性能。
可以以多种方式来提供在特定激发照射分布(profi le)下产生不同信号幅度的信号产生分析物。例如，可以使用不同的荧光标记，所述不同的荧光标记呈现重叠但包括不同最大值的激发光谱分布。因此，窄波长的激发通常会针对每个荧光基团产生不同的信号强度。这如图3A中所示，其示出了两个不同荧光标记基团(分别为实线302和虚线304)的激发光谱。当每个荧光标记经受如垂直线306所示的波长范围内的激发照射时，每个荧光标记将发出相应幅度的信号。然后，将在给定激发波长处所得到的信号强度分别表示为图3B的条形图中的实线条和虚线条。可以容易地使用这两个信号产生标记在给定激发波长下的强度差异来对这两个信号事件进行区分。应当理解，当同时出现时，将不容易区分这种光谱相连信号，因为它们将产生叠加的重叠信号，除非如下文所述的那样，从光谱不同的激发波长产生这种光谱相连信号。应当理解，在两个以上标记基团情况下可以使用一样的方法，其中在给定激发光谱下产生的发光具有可区分的强度或幅度。
类似地，两个不同的荧光标记基团可以具有相同或基本相似的激发光谱，但是由于这些标记基团的量子产率而导致这两个不同的荧光标记基团可提供不同的且可区分的信号发射强度。
此外，虽然是按照两种不同的荧光染料来进行描述的，但是应当理解，每个不同的标记基团可以各自包括多个标记分子。例如，每个反应物可以包括能量转移染料对，其在受到单个照射源激发时会产生不同强度的发射光。例如，标记基团可以包括供体荧光团(其在给定激发波长处被激发)和受体荧光团(其在供体的发射波长下被激发，使得能量被转移到受体)。通过使用不同的受体(其激发光谱与供体的发射光谱进行不同程度地重叠)，该方法可以生成这样的总体标记基团，其针对给定激发波长和电平以不同的信号幅度进行发射。同样，调节供体和受体之间的能量转移效率也将在给定的激发照射下产生不同的信号强度。
作为替代，可以通过给定反应物上多个不同的信号产生标记基团(例如，将单个标记分子放在一个反应物上，同时将2个、3个、4个或更多个标记分子置于不同的反应物上)来提供不同的信号幅度。所产生的发射信号将反映存在于反应物上的标记的数目，并且由此指示该反应物的身份。
例如，在美国专利申请公开No.2012/0058473；No.2012/0077189；No.2012/0052506；No.2012/0058469；No.2012/0058482；No.2010/0255488；No.2009/0208957中描述了用于上述目的的涉及荧光试剂(例如，核苷酸类似物)的示例性组合物和方法，上述各申请针对所有目的通过全部引用方式并入本文。
如上所述，利用这种方法的集成分析器件例如通过将信号幅度或其它非光谱特性用作信号辨别的基础来消除光谱辨别要求从而降低复杂度。将这种非光谱辨别方法与更常见的光谱辨别方法结合的集成分析器件也可以提供胜过更复杂的光谱辨别系统的优点。通过将“四色”辨别系统改变为基于信号强度和颜色来区分信号的系统，相对于常规的四色分离方案，仍然可以降低整个光学系统的复杂度。例如，在检测四个离散反应事件的分析操作中(例如，在核苷酸测序分析中)，可以在给定的发射/检测光谱内提供两个信号事件(即，在同一光谱窗口内发射信号)，并且在不同的发射/检测光谱内提供其它两个事件。在每个频谱窗口内，这对信号事件产生相对于彼此可区分的信号强度。
为了便于讨论，依据两组荧光信号事件来描述该概念，其中每组的成员由于荧光强度而不同，并且各组由于其发射光谱而不同。应当理解，简化的光学系统(例如，针对两个不同发射光谱使用两个检测通道的光学系统)的使用不要求两组信号的发射分布不重叠或者不要求每个组的成员的发射光谱完全重叠。相反，在许多优选方面，可以使用更复杂的信号分布，在该分布中每个不同的信号事件具有独特的发射光谱，但是每个信号将基于每个通道中的信号强度来在两个检测通道内呈现独有的信号分布(signal profile)。
为在本器件中使用，样本中的每个“发射物”应该由此具有如刚刚描述的那样的独有的信号分布，以便被正确地识别。因此，可以使用本器件来容易地区分包含多个发射物的样本。在一些实施例中，器件区分4个到18个发射物、4个到12个发射物、或者甚至4个到8个发射物。在具体实施例中，器件区分四个发射物(例如，核苷酸测序反应的四个不同碱基)。
图4示意性地示出了四个荧光标记基团中的每一个的信号分布，其与两个不同的滤光器分布中的每一个均重叠。如图所示，四个标记基团分别产生发射光谱402、404、406和408。虽然来自这四个基团的信号彼此部分地重叠，但它们各自具有不同的最大值。当经受如由通过滤光器(pass filter)线410和412所示的双通道滤光器方案时，来自每个标记的信号将在两个检测通道之间产生独有的信号分布。特别地，信号经由包括两条路径的光具组，这两条路径根据所示的光谱分布而被过滤。对于每个信号，不同级别的发射光将通过每个路径，并且在相关联的检测器上被检测到。通过信号的光谱特性来描述通过每个滤光器路径的信号量。
在上述混合模式方案的情况下，可以提供包括至少两个不同的检测通道的检测系统，其中每个检测通道使不同于其它通道的光谱内的光通过。这样的系统还包括检测通道的光通信中的反应混合物，该反应混合物产生至少三个不同的光信号，并且其中与其它光信号相比，每个光信号在两个检测通道内产生独有的信号图案。
在所有情况下，选择每个信号产生反应物来提供在信号强度和信号通道中的至少一个方面与其它信号彼此完全不同的信号。如上所述，给定通道中的信号强度部分地受光信号的性质(例如，其发射光谱)以及该信号所通过的滤光器(例如，允许到达给定通道中的检测器的那部分光谱)的支配。然而，也可以通过随机变量(例如，标记基团在发射信号时的定向)或特定反应的其它变量来调制信号强度。因此，为了确保信号的强度与给定通道内的另一个信号的强度完全不同，在优选方面，考虑这种变化例。
随着在光谱上区分开的信号事件的数量减少，集成器件的光路的复杂度也降低了。图5示出了用于执行光学分析(例如，核苷酸测序处理)的非等比例的示例器件架构，所述光学分析部分地依赖于对不同信号的非光谱辨别，以及可选地，部分地依赖于光谱区分。如图所示，集成分析器件500可以包括被限定在器件的表面层上的反应单元502。如图所示，反应单元包括设置在表面层中的纳米孔(nanowell)。这样的纳米孔可以构成衬底表面中的凹陷，或者构成被设置为通过附加的衬底层到达下面的透明衬底的孔(例如，如在零模式波导(ZMW)阵列中所使用的那种孔)(参见例如美国专利No.7,181,122和No.7,907,800以及下文)。然而，还应当理解，在一些实施例中，可以以其它方式来限制所感兴趣的样本，并且可以从分析器件中省略那些实施例中的纳米级反应单元。例如，如果在缺乏各个分离的反应单元的器件的表面上将所感兴趣的目标固定为图案中，则可以在不需要对样本进行物理分离的情况下在那些位置处观察到结合事件(binding event)或其它感兴趣的事件。如本领域技术人员将理解的那样，可以适当地使用这种方法来监测杂交反应(例如，在固定化核苷酸和其互补序列之间的杂交反应)或结合反应(例如，在抗体和其配体之间的结合反应，其中结合对中的任一个成员可以固定在器件表面上的特定位置处)。
激发照射从激发光源(未示出，该激发光源可以与衬底分离，或者也可被集成到衬底中)被传送到反应单元或固定的目标。如图所示，可以使用光波导(或波导层)505来将激发光(被示出为朝向一个方向的箭头，尽管光可以根据期望而在任一方向或两个方向上传播)传送到反应单元502或其它固定目标，其中从波导505发出的瞬逝场对照射体内的反应物进行照射。例如，在美国专利No.7,820,983和美国专利申请公开No.2012/0085894中描述了用于照射反应单元的光波导的使用，其全部内容通过引用并入本文以实现通用。纳米级反应单元(本文中也称为“纳米孔”或“ZMW”)起到这样的作用：其使得向下发射到器件中的荧光增强并限制向上散射的光的量。
通过集成光具组504(其包括一个或多个光学元件)将无论是从纳米级反应单元还是从固定的目标所发射的光引导到检测器。光具组包括透镜元件层508，用以将来自反应单元内的发射体的发射光引导到设置在反应单元下方的检测器层512。如下面更详细地描述的，本公开的集成分析器件中的透镜元件层优选地包括衍射光束成形元件，其用于将发射光高效地分离成至少两个光束以通过滤色层510。衍射光束成形元件可以例如将发射光分离成被引导到检测器层的两个、三个、四个、或者甚至更多个至少部分地分离的光束。根据衍射光束成形元件的构造，可以以线性方式来组织分光束，或者它们可以诸如2×2光束阵列等阵列的形式进行排列。这种排列通常由检测器层的感测区域的构造决定。
检测器层通常包括一个或优选的多个感测区域512a、512b(例如，阵列检测器(例如，CMOS检测器)中的像素)，其通过衍射光束成形元件光耦接到给定分析器件内的发射体。虽然像素512a、512b被示出为线性排列，但是应当理解，这样的像素可以以网格、n×n的正方形、n×m的矩形、环形阵列或任何其它方便的定向的方式进行排列。下面更详细地描述示例性排列。
应当理解，在本公开的上下文中，器件中的两个部件的“光耦接”并非旨在意指耦接的方向性。换句话说，由于通过光学器件的光能的透射是完全可逆的，所以应当认为第一部件到第二部件的光耦接等同于第二部件到第一部件的光耦接。
然后，检测并记录来自反应单元502的、对检测器层的像素进行撞击的发射信号。如上所述，优选地，滤色层510设置在检测器层和纳米级发射体之间，以使得在光谱上区分开的不同信号行进到检测器层512中的不同的相关感测区域512a和512b。例如，滤光器层510的部分510a仅允许具有可区分的第一发射光谱的信号到达与其相关联的感测区域512a，而滤光器层510的滤光器部分510b仅允许具有可区分的第二光谱的信号到达与其相关联的感测区域512b。
在利用这种构造的测序系统的上下文中，四个核苷酸中的两个的掺入将产生这样的信号，其通过滤光器部分510a到达感测区域512a并被滤光器部分510b阻挡。在这两个信号之间，一个信号将具有高于另一信号的信号强度，使得检测器层512中的感测区域512a将能够产生指示这种不同信号强度的信号响应。同样地，四个核苷酸中的另外两个的掺入将产生这样的信号，其通过滤光器部分510b到达感测区域512b并被滤光器部分510a阻挡。在这两个信号之间，一个信号将具有高于另一信号的信号强度，使得检测器层512中的感测区域512b将能够产生指示这种不同信号强度的信号响应。
检测器层可操作地与通常集成到衬底中的适当电路相耦接，用于向这样的处理器提供信号响应，所述处理器可选择地集成包括在同一器件结构内，或者与检测器层和相关电路相分离但是与检测器层和相关电路电耦接。在美国专利申请公开No.2012/0019828中描述了这种类型的电路的示例。
从前面的公开内容和图5中可以看出，本文所描述的集成分析器件不需要在使用常规四色光学器件的系统中所必须的更复杂的光路，从而在某些情况下避免需要过多的信号分离光学器件、发射镜、棱镜或滤光层。特别地，尽管如前所述仅给出了单个滤光层，但是在可选方面，可以消除滤光层或可以用这样的滤光层(例如，激光抑制滤光层(见下文))取代，该滤光层对来自激发源的杂散光进行阻挡而非对来自反应单元的不同发射信号进行区分。与常规四色系统相比，即便本申请中所描述的集成分析器件包括了滤光层510，但是仍能使得光学器件更简化和/或更有效，因为常规四色系统需要多层滤光器或窄带通滤光器，这通常需要混合层或感测区域的每个子集上的复合方式，从而阻止具有任何给定发射波长的信号到达一个或多个感测区域子集，从而使得从每个信号事件检测到的光子更少。另一方面，图5中所示的光学器件构造仅阻止整个信号光的较小部分到达检测器。作为替代，这样的常规系统将需要所有四种不同信号类型的分离和有差别的方向，因此需要包含用于实现光谱分离的额外的光学元件(例如，棱镜或光栅)。美国专利申请公开No.2012/0021525中提供了包括光谱转向元件(即，基于颜色在空间上对光进行分离的光学元件)的纳米级集成分析器件的实例。
图6示出了使用来自本发明的集成系统的两个颜色/两个振幅信号组的实时测序操作的示例信号输出，其中，一个迹线(虚线)表示与A碱基(高强度信号)和T碱基(低强度信号)的掺入相关联的信号，而另一条信号迹线(实线)表示与G(高)碱基和C(低)碱基相关联的不同发射光谱的信号。然后，使用根据信号的彩色通道和强度所推导出的掺入时间和掺入的碱基的身份来说明碱基序列。
用于空间分离发射光的透镜元件
如上所述，本公开的纳米级集成分析器件包括设置在纳米级发射体和检测器层之间的透镜元件层。这种层的透镜元件用于沿着两个或更多个空间上分离的光路高效率地引导从纳米级发射体发射的光。除了将发射光信号分离成分开的光路之外，透镜元件还可以使发射光准直和/或聚焦。特别地，这种透镜元件理想地能够用近轴线射线来使发射光准直，并且例如在通过滤色层进行分色之前对发射光进行分离。此外，使用标准技术容易生产这种透镜元件。
如本领域技术人员将理解的那样，根据所期望的光学性质和物理性质，本器件的集成光学透镜元件可以是折射透镜或衍射透镜。在某些情况下，与可比较的折射透镜相比，衍射透镜可以提供改善的图像质量、更容易小型化和/或生产成本更低。在一些情况下，透镜可以包括分开的折射部件和衍射部件，或者可以是将两个特征组合在单个透镜元件中的混合透镜。
在优选实施例中，本分析器件的透镜元件是衍射光束成形元件或其变型。这样的元件通常包括类似菲涅尔透镜特征的特征。关于入射辐射，菲涅尔透镜(当它们通过是衍射而非折射或反射来起作用时也被称为波带板或菲涅耳波带板)由具有特定锥形形状或具有交替的透明和不透明区域(也称为菲涅尔带)的一系列同心环构成。通过选择性吸收或选择性相移，这些结构导致穿过器件的光聚焦，从而使得器件起到透镜的作用。如本领域中所公知的，特定的透镜设计取决于待聚焦的辐射、用于构造透镜的材料的折射率、以及所期望的焦距。在一些实施例中，本器件的透镜元件是用作衍射阵列聚焦元件的改进的菲涅尔透镜。这种混合透镜元件由于其将发射光空间地分离成多个点的能力而被称为衍射光束成形元件。虽然在各实施例中将本公开的集成分析器件描述为包括衍射光束成形元件，但是应当理解，这些实施例是该器件的优选实施例，并且其它透镜元件可以不受限制地被包括在本分析器件中。
如本领域技术人员将理解的那样，可以使用各种材料和方法来生产本器件的透镜元件。例如，透镜元件可以通过对透光材料的平坦表面中的相关区域进行蚀刻并随后将吸收材料或相移材料沉积到蚀刻后区域中而形成。例如，相位菲涅耳波带板是相位菲涅耳透镜的阶梯近似。相位菲涅耳波带板的效率随着阶数的增加而增加。具体地，可看出两相菲涅耳波带板的最大衍射效率为40.5％，而四相菲涅耳波带板的最大衍射效率为81％。因此，在一些实施例中，透镜元件(例如，衍射光束成形元件)的光学效率为至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或甚至更高。在优选实施例中，光学效率为至少40％。用于设计具有所期望的空间分离能力的透镜元件的技术在本领域中是已知的。例如，Leger et al.(1988)The Lincoln Laboratory Journal 1(2):225描述了在设计用于操纵激光束(例如，分离和组合激光束)的光学元件时二元光学技术的应用。可以使用光线追迹软件(例如，光学设计程序Zemax)来设计这些元件。
菲涅耳透镜及其变型已经被并入使用各种技术的先进光学器件中，例如，在照明系统(参见例如美国专利No.6,002,520)、发光器件(参见例如美国专利No.6,987,613)、固态成像器件(参见例如美国专利号7,499,094)、图像传感器(参见例如美国专利No.8,411,375)和集成红外传感器(参见例如美国专利申请公开No.2013/0043552)中作为成像光学器件。可以使用类似的方法来实现本公开的透镜元件的设计以及透镜元件与本分析器件阵列的集成。
在本器件的检测路径中使用对光进行空间分离的衍射光束成形元件提供了优于传统光学元件(例如，反射锥体或抛物面反射镜)的若干个优点。特别地，这种衍射光束成形元件提供从发射体发射的光的离轴聚焦。这样的元件进一步需要最小面积、最小间距，并且使得相邻检测器元件之间串扰最小。与通常用于纳米级集成分析器件或传统折射透镜元件的反射锥体或抛物面反射镜不同，本公开的衍射光束成形元件可以同时高效率地准直和分离从发射体发射的光。此外，使用标准微芯片制造技术(例如，使用标准沉积、去除和图案化技术)容易生产本衍射光束成形元件。
图7中示出了包括用于对发射光进行空间分离的衍射光束成形元件的简化示例性集成分析器件的两个视图。图7A示出了双像素器件(即，在检测器层中包含两个感测区域的器件)的俯视图，其中ZMW/纳米孔702位于两个感测区域712a和712b之间的边界上。应当注意，图7A的视图中省略了器件的介于中间的衍射光束成形元件、滤色层以及其它特征。图7B示出了同一器件的侧视图，其示出了从ZMW/纳米孔发出的光如何通过衍射光束成形元件708和滤色元件710a和710b到达检测器层的感测区域712a和712b。
本器件的衍射光束成形元件的设计可以根据需要而变化，以获得通过元件的发射光的期望的空间分离、准直和/或聚焦。例如，如图8所示，标称设计(图A)可以包括位于衍射光束成形元件和检测器层之间的足够的空间，以允许包括例如激光抑制干涉滤光层(见下文)或其它光学特征。在某些情况下，在衍射光束成形元件和检测器层之间增加横向间隔(图B)可能是有利的，而在其它情况下，通过减小衍射光束成形元件和检测器层之间的横向间隔(图C)可以有利于构建更紧凑的结构。如本领域技术人员将理解的那样，通过改变衍射光束成形元件的设计容易地实现衍射光束成形元件的光学特性的改变。
图9示出了来自ZMW/纳米孔的发射体的发射光通过代表性衍射光束成形元件设计的模拟透射。图9A中示意性地示出了所模拟的器件的基本设计，其包括ZMW/纳米孔902、衍射光束成形元件908和滤色层910的位置。如图9B所示，利用衍射光束成形元件的衍射效应将透射通过如图9A所示设计的衍射光束成形元件的光的强度在空间上进行分离。使用ZEMAX光线追迹软件设计如图9A所示的衍射光束成形元件908的组成和结构，并使用Lumerical FDTD(时域有限差分)Maxwell方程电磁传播软件来对如图9B所示的通过衍射光束成形元件的光的透射特性进行建模。
应当注意，本衍射光束成形元件并不意在基于颜色来分离光。相反，这些衍射光束成形元件的特征在于它们提供了所有光谱的最大传输效率，并且颜色区分由滤色层提供。就这一点而言，图10示出了在没有滤色器的情况下波长对通过双衍射光束成形元件的发射路径的效率和影响。图10A中示出了如上所述的衍射光束成形元件的相位分布图。图10B中示出了用于630nm发射的检测器水平处的场分布。针对没有任何透镜图案结构但是具有沉积的a-Si的聚集路径，图10C示出了作为发射波长的函数的衍射光束成形元件的效率。2μm氧化物线是针对具有距离a-Si层2μm的检测器的器件，4μm氧化物线是针对具有距离a-Si层4μm的检测器的器件。在这些器件中，像素相对较大(约8μm×10μm)。图10D中示出了波长对器件的焦点的影响。
图11示出了根据本公开制造的纳米级器件的设计、构造和分析，所述纳米级器件包括用于对从发射体发出的光进行空间分离的衍射光束成形元件。图11A示出了该器件的设计特征，包括ZMW/纳米孔1102、衍射光束成形元件1108和滤色层1110。该器件还包括用于将激发光传送到ZMW/纳米孔的波导(WG)、位于器件表面上的金属(Al)涂层和抗反射(TiN)涂层、位于衍射光束成形元件的上方和下方的氧化硅隔离层、以及位于衍射光束成形元件的表面上的孔隙层。附图中提供了各特征的大致尺寸。图11B示出了与根据图11A中概述的设计而构造的器件相对应的SEM显微图。
孔隙层
本公开的集成分析器件可以可选地包括一个或多个孔隙层。孔隙层制作在纳米级分析器件的其他层之间(例如，在ZMW/纳米孔层和衍射光束成形元件层之间、在衍射光束成形元件层和滤色层之间、和/或在滤色层和检测器层之间)。这些孔隙提供了开口，以实现发射光从ZMW/纳米孔到给定单元晶格内的检测器元件的感测区域的最大透射，同时使来自激发源(例如，波导)、器件内的自体荧光或相邻单位晶格之间的串扰的光的背景传输最小化。孔隙层通常由在其中不期望出现光的透射的遮光材料和在其中希望出现光的透射的透明材料构成。用于孔隙层的合适的遮光材料包括例如氮化钛、诸如铬的金属或任何其它合适的遮光材料。优选地，遮光材料为氮化钛。用于孔隙层的合适的透明材料包括例如SiO2、Si3N4、Al2O3、TiO2、GaP等。在优选实施例中，孔隙层厚度约为100nm。
激光抑制滤光元件和滤色元件
本公开的集成分析器件还包括被设计为在透射特定波长的光的同时显著减少或阻挡其它波长的光的特征。特别地，期望将尽可能多的信号相关的光透射到检测器的适当区域，并且阻止所有或至少大部分噪声相关的光。此外，由于本器件的透镜元件被设计为使得从分析物发射的所有波长的光透射，因此通常需要在透镜元件和检测器层的不同感测区域之间采用滤色元件，以便区分分析物中的不同的发射物。
因此，该器件包括设置在透镜元件层和检测器层之间的滤色层。通常，针对透射穿过透镜元件的每个空间上分离的光束均使用滤色层中的不同滤色元件。空间上分离的光通常在被检测器层中的相应感测区域检测到之前穿过滤色层。在本发明的一些实施例中，滤色层包括多个滤色元件，每个滤色元件针对一定范围的光波长。在更具体的实施例中，滤色层包括2个至9个滤色元件。在更具体的实施例中，滤色层包括2个滤色元件、感测区域和分离的光束。
本器件可以额外地或可选地包括位于激光抑制滤光层内的一个或多个激光抑制滤光元件。激光抑制滤光层设置在激发源和检测器层之间，通常设置在滤色层和集成器件的检测器层之间。在全集成分析器件(例如，本公开的器件)的情况下，这种激光抑制滤光元件(也称为“泵”抑制元件))是特别重要的，因为这些器件的集成性能可以对所有层的总厚度施加约束，并且还可以增加必须确保抑制的角度带宽。对于非集成检测器器件，负责抑制非信号光的沉积层可以是几十微米厚(对参合在一起的若干个滤光器求和)，但通常只需要在＜10度的角度范围(包括视野(“FOV”)和滤光器倾斜)内对光进行抑制。然而，对于诸如本文所例示的器件的集成器件，用于泵抑制的层的厚度可能需要为5微米甚至更小。
集成器件的进一步的考虑是确保被抑制的非信号光被有效地终止(即，确保从光学系统中将其有效地移除，例如，通过吸收将其转化为热)。对于非集成器件，这样的终止通常不是关键的，而对于集成器件，反射光可以通过几次(原则上为一次)反射而到达另一个检测器位置，此外，不存在让被抑制的光从该器件逃逸的本地出口。由于这些原因，确保将散射光有效地(理想地，在一次反射中)转换为热是重要的。本公开的后续部分中描述了适用于本集成器件的两种类型的激光抑制滤光元件的详细特性。
滤色元件和激光抑制滤光元件具有彼此共同的特征，因为它们都被设计成在使某些波长的光透射的同时对其它波长的光进行阻挡。然而，滤色元件用于区分从分析物中的不同发射物发射的光的波长，而激光抑制滤光元件被设计成通过散射或其它方式来对由波导或其它激发源产生的背景噪声进行阻挡。因此，通常在来自透镜元件的空间上分离的光和检测器层中的多个感测区域之间放置不同的滤色元件，并且通常在透镜元件和检测器层之间(优选地在滤色层和检测器层之间)放置单个激光抑制滤光元件或多个具有相似特性的激光抑制滤光元件。用于本器件的滤色元件和激光抑制滤光元件的合适材料包括例如非晶硅/氧化硅干涉叠层、类聚合物抗蚀剂、掺杂的PECVD氧化物、具有吸收染料的有机硅化合物等。在优选实施例中，滤色元件和激光抑制滤光元件均是薄膜干涉滤光器。在更优选的实施例中，根据非晶硅和氧化硅层来制备滤色元件和激光抑制滤光元件。在其它优选实施例中，激光抑制元件设置在滤色层和检测器层之间。
多层激光抑制滤光元件和混合激光抑制滤光元件
理想的激光抑制滤光器提供对样品激发波长处的光能量的深度抑制(例如，对于典型的激光照明源，在532nm处OD≥6)，呈现样品发射波长处宽的高透射率窗口，并且进一步呈现感兴趣的波长之间的较小的斯托克斯位移。此外，希望激光抑制滤光器呈现最小色散角和偏振、最小厚度、以及受控的终止。此外，优选地，滤光器叠层是廉价的并且在适于生产集成器件的其它部件的条件(例如，温度)下容易生产。
在介电薄膜激光抑制滤光器的情况下，涉及这种堆叠来在非信号光的宽范围的入射角度下获得足够的滤光器性能有时会是具有挑战性的。例如，给定的指定波长范围内，边缘滤光器仅在特定的入射角范围内(通常从垂直入射角度到某一值)可以提供高反射效率。在本文所述的一些集成器件设计中，为了使激发源的散射光子不能到达检测器，可能需要在宽角谱上对光子进行抑制，特别是阻挡具有比典型薄膜叠层能够足够支持的入射角更大的入射角的光子。
本公开通过在一个方面中提供包括低折射率(low index)全内反射(TIR)层的多层激光抑制滤光器来解决该问题，以便减少高角度散射光的透射。具体地，在激发源和检测器层之间的器件叠层中包括低折射率层，以便使背景信号最小化。传统的介电长通滤光器(例如，如图12A的左图所示)反射具有较低入射角的光线(例如，附图中的中间光线)比反射具有较高入射角的光线(例如，附图中的外侧光线)的效率更高。如图12A的右图所示，当将该滤光器设计结合到集成器件中时，来自波导的高角度散射光透射通过滤光器叠层并到达传感器的机会相对较高。然而，在本公开的设计解决方案中(例如，在图12B的左图所示的结构中)，在集成激励波导和诸如介电滤光器叠层的低角度抑制滤光器之间添加了低折射率TIR层。高角度散射光在遇到低折射率TIR层时经历全内反射，并且在多次反弹后，从侧面离开集成器件。同时，较低角度的散射光透过低折射率TIR层，但被介电滤光器叠层所抑制。因此，TIR层和滤光器叠层的组合效应产生了阻挡具有广角光谱的散射光的屏障滤光器。
用于本主题多层滤光器叠层的低折射率TIR层的一种候选材料是具有几乎零色散和低折射率的空气，但是其它低折射率材料也是合适的，包括具有低折射率和其它合适的性质的其它气体、液体和固体。如本领域技术人员所理解的那样，用于低折射率TIR层的材料的具体选择将取决于折射率和相邻层的其它物理性质。
为了有助于对散射光进行收集并减少多次散射的机会，可以选择性地将吸收层或吸收块添加到器件中(如图12B的右图所示)。基于材料的吸收波长、消耗光能的能力和在制造集成器件时的适宜性来选择用于这种吸收层的材料。
根据低折射率层的位置、厚度、材料选择和层数，上述宽角度光谱多层边缘滤光器的各种构造是可行的。如上所述，低折射率层可以直接放置在激发波导包覆层的下方，从而产生最短的谐振腔长度，因此限制了二次散射的机会。然而，作为替代，可以如图12C的左图所示的那样在薄膜叠层内放置低折射率层，或者如图12C的右图所示的那样在薄膜叠层和检测层之间放置低折射率层。这些构造增加了谐振腔长度，并且因此可以增加二次散射的机会，但是这些构造可以有利地便于器件的生产。这些示例中未示出透镜元件层，该透镜元件层可以在激光抑制滤光元件的上方或下方，但优选地在激光抑制滤光器的上方。
在任何情况下，将附加的TIR设计约束结合到激光抑制滤光器设计中为低折射率层产生附加值。例如，通过将(一个或多个)低折射率层作为整体部件结合到激光抑制滤光器设计中，例如，因为滤光器不再局限于薄膜叠层而是可以包括从激发波导到检测层的各层，所以集成器件的性能可以被充分地优化。
本公开还在另一方面中提供了包括介电叠层和吸收层的组合的激光抑制滤光元件。这种混合滤光器利用干涉涂层和吸收层的入射角互补依赖性。具体地，如上所述，用于抑制的干涉涂层通常针对以垂直入射为中心的光锥表现最佳，其中干涉薄膜中的分散体按角度的余弦影响性能，而吸收抑制层的性能趋向于随着入射角增加，其中吸收抑制层中的分散体按角度的余弦影响性能。由于这种互补性，可以获得在广角范围内以最小厚度将目标抑制得最小的混合涂层。对于较高折射率薄膜和较低折射率吸收层来说，减小了该厚度。注意，在混合抑制滤光器中可以有效地使用对非信号光进行吸收(但是信号光的吸收量最小)的薄膜。
作为适合与介电滤光器组合使用的吸收染料的示例，Aptina red1具有高于600nm的高透射率的吸收光谱。参见Pang et al.(2011)Lab Chip 11：3698中的图2。虽然该出版物中所使用的厚度相对较大(8μm)，但是根据器件的激光激发波长可以使用更薄的层。例如，5μm厚度的层在532nm处提供OD＞6，4.7μm厚度的层在540nm处提供OD＞6，并且2.8μm厚度的层在562nm处提供OD＞6。本领域技术人员容易确定适用于本混合滤光器叠层的其它吸收染料和颜料。
特别地，通过吸收染料层(例如，通过Aptina red1染料层)进行激光抑制有利地呈现出无偏振色散、弱角色散和非信号光的受控终止。此外，角度上不均匀的散射体可以允许吸收染料层的进一步变薄。如果半球的某些部分具有待被抑制的较低强度的非信号光，或者如果在某些角度处强度具有已知的偏振依赖性，则该信息可用于(针对给定的抑制目标)进一步减小混合抑制滤光器的厚度。吸收抑制滤光器(例如Aptina red1染料层)的缺点包括适度地大的消光系数、相对较大的厚度(5μm)、以及需要使用具有相当大的斯托克斯位移(532nm至约620nm)的样品染料。然而，在本混合抑制滤光器中通过将吸收层与介电叠层进行组合，可以在很大程度上弥补这些缺点。图13示出了吸收染料层的弱角色散(左图)和缺乏偏振色散(右图)。
关于混合抑制滤光器的介电叠层部件，通过将非常高折射率的材料用于滤光器的干涉部分，特别优越的抑制滤光器(特别是角度依赖性低的滤光器)是可行的。在532nm泵情况下可以用于这些目的的示例性材料为作为高折射率材料的GaP(磷化镓)、作为低折射率材料的TiO2，但是如下所述且如本领域技术人员理解的那样，也可以使用其他适当材料。值得注意的是，对于普遍生产的涂层，通常将TiO2用作高折射率材料。图14示出了nH/nL GaP/TiO2介电叠层的有利的性质，特别是在532nm的泵源(由向下的箭头表示)的范围中的高消光系数和可控制的斯托克斯位移。然而，该材料还呈现出了在0度和45度之间的显著的角色散(带有蓝移)、以及p型偏振光信号(靠近570nm的上部的迹线)和s型偏振光信号(靠近570nm的中部的迹线)之间的显著偏振色散(分光)。
图15中示出了在单个混合激光抑制滤光器中将吸收染料层和介电干涉叠层进行组合的优点。具体地，图15A示出了这样的混合滤光器的示意性示意图，在该图中下层是GaP/TiO2薄膜叠层，上层是Aptina red1染料。混合滤光器在3μm总厚度的情况下获得OD＝6(其中，OD＝2由吸收层提供，OD＝4由干涉层提供)的抑制。可以通过滤光器元件的设计来补偿偏振色散和角度色散。如图15B和图15C所示，图15B针对p型偏振光(上迹线)和s型偏振光(下迹线)示出了入射角对透射率的影响，图15C针对45度入射光(左迹线，p型偏振和s型偏振)和0度入射光(右迹线)示出了波长对透射率的影响。吸收层对透射光的终止进行控制，并且整体设计提供了可容忍的斯托克斯偏移、合理的厚度和在样品发射波长下的良好透射。
可以根据需要通过用于构建叠层的材料的选择、每层的厚度和层数来调节混合抑制滤光器的介电叠层组件的光学性质。用于制造干涉滤光器的介电材料通常是非导电材料(通常为具有特定折射率的金属盐和金属氧化物)。示例性材料包括SiO2、SiO、Si2O3、Al2O3、BeO、MgO、CeF3、LiF、NaF、MgF2、CaF2、TiO2、Ta2O5、ZrO2、HfO2、Sb2O3、Y2O3、CeO2、PbCl2和ZnS。同时还因为GaP的极高的折射率而对其进行使用。优选地，将介电叠层设计为(H/2L H/2)N的整体结构，其中，H层是具有相对较高折射率的第一材料，L层是具有相对低折射率的第二材料。如本领域技术人员所理解的那样，基于所期望的光学性质来选择叠层内每层的物理厚度。值“N”是括号内的结构的重复单位数，并且其为整数。随着总厚度的增加(例如，随着N增加)，抑制频带中的透射率(针对给定的入射角)趋于零。图16A示出了具有各种N值的GaP/Ti02叠层的物理性质和光学性质。图16B示出了使用不同的H和L对的干涉叠层的物理和光学性质的进一步比较。
图17和图18突出了与使用其它传统介电叠层材料相比在混合抑制滤光层中使用GaP/Ti02叠层的优点。包含GaP/TiO2介电叠层和Aptina red1吸收层的混合抑制滤光器的光学性质在上文中以及图15B和图15C中得到了描述。为了比较，图17A和图17B中示出了包括TiO2/Al2O3介电叠层和Aptina red1吸收层的混合抑制滤光器的光学性质，图18A和图18B中示出了包括TiO2/SiO2介电叠层和Aptina red1吸收层的混合抑制滤光器的光学性质。重要的是，TiO2/Al2O3和TiO2/SiO2叠层的有效折射率比GaP/TiO2叠层的有效折射率低，从而导致这些滤光器具有更大的角度和偏振色散。TiO2/Al2O3混合抑制滤光器的色散补偿需要4.7μm的厚度(吸收层为约3.6μm，介电叠层为约1.1μm)。TiO2/SiO2混合抑制滤光器的色散补偿需要4.5μm的厚度(吸收层为约3.6μm，介电层为约0.9μm)。从图17B可以清楚看出，TiO2/Al2O3混合抑制滤光器理想地将与具有相对较大的斯托克斯位移(例如，532nm的激发和大于635nm的发射)的荧光染料一起使用，而TiO2/SiO2混合抑制滤光器最好与具有甚至更大的斯托克斯位移的染料一起使用。
应当理解，可以改变涂层的顺序以实现混合激光抑制滤光元件的最佳性能。例如，这些层可以被排序为首先是吸收层其次是干涉涂层，或相反。吸收材料可以在诸如PMMA的主体材料中携带，并且可以使吸收材料成形或图案化以适应有限的体积或允许更简单的集成。
如本领域技术人员将会理解的那样，可以以不同的工序来生成涂层，并且可以将该图层结合到组装件中。
因此，本公开在该方面提供有：
一种集成分析器件阵列，每个器件包括：
纳米级发射体；
光学地耦接到纳米级发射体的检测器层；
设置在纳米级发射体和检测器层之间的衍射光束成形元件；
设置在衍射光束成形元件和检测器层之间的滤色层；
光学地耦接到纳米级发射体的激发源；以及
设置在激发源和检测器层之间的激光抑制滤光元件；
其中，通过发射体内的多个发射物从该纳米级发射体发射光；
其中，检测器层包括多个感测区域；并且
其中，衍射光束成形元件在空间上分离从纳米级发射体发射的光，并且将空间上分离的光引导穿过滤色层从而到达多个感测区域。
在一些实施例中，激光抑制滤光元件是多层抑制滤光元件或混合抑制滤光元件。
在具体实施例中，激光抑制滤光元件是包括介电干涉滤光层和低折射率全内反射层的多层滤光元件。在更具体的实施例中，每个器件还包括吸收层。
在其它具体实施例中，激光抑制滤光元件是包括吸收层和介电叠层的混合抑制滤光元件。
在一些实施例中，激光抑制滤光元件在532nm处呈现低光学透射率和在高于620nm呈现高光学透射率。
暗镜元件
在另一方面，本公开的集成分析器件还包括暗镜元件。术语暗镜通常用于描述具有趋向于吸收入射光而不固有地对光进行散射并且还具有低透射率的涂层的表面。在具有在光源附近处的非样品荧光材料的储存器的集成器件中，非信号光传播到荧光材料的储存器中可导致附加的噪声背景，所以其应当被避免。在器件的当信号(或照射)光通过时不会激活的区域上设置暗镜涂层提高了集成器件在被抑制的非信号光可能撞击到另一个器件位置之前有效地终止非信号光的能力。
图19中示出了示例性暗镜涂层的光学性质，其中，图19A示出了在涂覆有Cr的介电叠层上可以实现反射率的显著降低。如图19B所示，在替代涂层(例如，TaN涂层)的情况下，甚至更低的反射率是可行的。如本领域技术人员将理解的那样，其它材料适于用作暗镜涂层。
可以在散射表面设置暗镜涂层，以降低撞击信号角带内的另一个器件位置的可能性，或者延长在到达另一个器件位置之前的吸收路径长度。
角度敏感和/或偏振敏感的暗镜涂层可用于实现信号光的高效透射，同时实现非信号光的某种目标吸收水平。
因此，本公开在该方面提供有：
一种集成分析器件阵列，每个器件包括：
纳米级发射体；
光学地耦接到纳米级发射体的检测器层；
设置在纳米级发射体和检测器层之间的衍射光束成形元件；
设置在衍射光束成形元件和检测器层之间的滤色层；
暗镜滤光元件；
其中，通过发射体内的多个发射物从该纳米级发射体发射光；
其中，检测器层包括多个感测区域；并且
其中，衍射光束成形元件在空间上分离从纳米级发射体发射的光，并且将空间上分离的光引导穿过滤色层从而到达多个感测区域。
在实施例中，暗镜元件包括散射表面上的暗镜涂层。
集成分析器件阵列
为了获得基因测序的广泛应用(例如，研究和诊断)可能需要的大量序列信息，需要高吞吐量系统。如上所述，举例来说，为了增强系统的测序吞吐量，通常监测多个复合物，其中每个复合物对单独的模板序列进行测序。在基因组测序或其它大型DNA组分测序的情况下，这些模板通常包含基因组DNA的重叠片段。通过对每个片段进行测序，可以随后根据来自片段的重叠序列数据来组装连续的序列。
如上所述，并且如图1所示，这样的测序系统的模板/DNA聚合酶-引物复合物通常被固定设置在光学限制区域(例如，零模式波导(ZMW)或纳米孔、或靠近透明衬底的表面、光波导等)内。优选地，在衬底上排列大量的这样的反应单元，以实现基因组或其它大规模DNA测序方法所需的规模。优选地，这样的阵列包括完全集成分析器件(例如，图2和图5的框图中所示的器件等)。美国专利申请公开No.2004/0014837；No.2012/0019828；和No.2012/0021525中提供了包括光学分析器件阵列的集成系统的示例。
可以以超高密度的方式(在任何地方处提供1000个ZMW/cm2至1000000个ZMW/cm2或更多个)来制造诸如包括ZMW/纳米孔的器件阵列的集成分析器件阵列。因此，在任何给定的时间，可以分析单个反应系统内甚至单个衬底上的100、1000、3000、5000、10000、20000、50000、100000、1百万、1千万、甚至更多个纳米级发射体或其他反应区域中发生的反应。
使用上述系统，已经对阵列中的数千或数万个ZMW/纳米孔的同时定向照明进行了描述。然而，随着复用的需求增加，难以增加阵列上的ZMW的密度以及这种阵列提供定向照明的能力，这是因为如下问题增加：ZMW串扰(来自相邻ZMW的信号在离开阵列时彼此相互污染)、由更高水平的密集照明引起的信噪比降低等。本发明的阵列和方法解决了这些问题中的一些。
给定的信号在检测器上的入射位置表示：(1)阵列中的ZMW/纳米孔内的起始发射体，以及(2)信号分量的发射特性，其用于例如识别被掺入到延伸反应的荧光标记的核苷酸类似物的类型。如上所述，在一些情况下，检测器可以包括多个感测区域，每个感测区域用于检测从发射体穿过衍射光束成形元件和滤色层到达检测器层的光。例如，在测序的情况下，每个反应单元的传感器可以具有4个元件，每个元件用于四个碱基中的一个。在一些情况下，感测区域可以提供颜色区分，尽管滤色层优选地用于区分适当的感测区域的光的适当颜色。在这些实施例中，感测区仅检测信号的强度，而不区分颜色。在某些情况下，传感器元件使用发射特性的组合来识别被掺入的核苷酸。
图20示出了有用地用于本公开的阵列中的示例性器件布局。在每种情况下，从上方对阵列进行观察，黑色圆圈表示ZMW/纳米孔。如图所示，ZMW/纳米孔直接位于波导(其被标识为宽箭头)上方。在图20A和图20C所示的阵列的情况下，波导的“间距”是2列(即，波导被隔开两列感测区域/像素的宽度)，而对于图20B和图20D的阵列，波导的间距为1列(即，波导被隔开一列感测区域/像素的宽度)。通过与一些ZMW/纳米孔相关联的两个细箭头来指示受每个阵列中的衍射光束成形元件影响的发射光的空间分离。例如，在图20A的器件中，衍射光束成形元件将发射的光引导到与波导垂直(即，成90°)对准的两个感测区域上。在图20B的器件中，衍射光束成形元件将发射光引导到与波导共线(即，成0°)的两个感测区域上。对于图20C和图20D的器件，衍射光束成形元件将发射光引导到与波导成对角线(即，成45°)的两个感测区域上。从附图可以清楚看出，图20C和图20D的器件关于各个波导的间距而各不相同。
图21示出了从上方所观察的器件的阵列，其中更详细地示出了特定单位晶格内的示例性衍射光束整形元件2108的设计。单位晶格内还标记出了ZMW/纳米孔2102、波导2105以及将被设置在检测层的感测区域上的两个滤色区域2110中的一个。在这些器件中，检测区域将与波导共线，并且波导间距将为1列。该图中未示出第二滤色区域和上面已经描述了的器件的各种其它特征(例如，孔隙元件、激光抑制元件、金属抗反射表面层、波导覆层、电子电路等)。
图22示出了用于构建本器件的示例性单位晶格的各种典型元件及其一般特征。从单位晶格的平面上方对元件进行观察。具体地，图22A示出了衍射光束成形元件，其中衍射光束成形元件(以及单位晶格本身)的尺寸大约为10μm×15μm。图22B示出了ZMW/纳米孔(被示出为小方形)及其相关联的波导。如图所示，波导的宽度大约为0.3μm至0.7μm，并且其被制作在大约9μm宽的沟槽中。图22C示出了半径为2.8μm和3.0μm的两个圆形滤色区域。然而，当装配在器件内时，每个滤色区域将相对于ZMW/纳米孔偏移约3.0μm。图22D示出了ZMW/纳米孔(被示出为小方形)和两个相关联的孔隙元件(在每种情况下其对应于两个偏移的透明圆)。典型地，在检测器层和激光抑制层/滤色层之间设置有具有大约2.5μm的直径并且相对于ZMW/纳米孔偏移约+/-2.7μm的圆的较大孔隙元件层。典型地，在滤色层和衍射光束成形元件层之间设置有具有大约2.0μm的直径并且相对于ZMW/纳米孔偏移大约+/-1.6微米的圆的较小的孔隙元件层。图22E示出了ZMW/纳米孔(被示出为小正方形)和与两个偏移透明圆相对应的第三个相关联的孔隙元件。这些圆直径约为1.5μm，并且相对于ZMW/纳米孔偏移约+/-1.0μm。该孔隙元件通常设置在衍射光束成形元件层和波导之间。
图23示出了将图22的部件组装到本发明的示例性集成单位晶格器件中的示意图。ZMW/纳米孔为清楚地示出在单位晶格的中心处的小方形，波导被示出为骑跨ZMW/纳米孔的垂直平行线。该示例性器件按照以下顺序从上至下地包括ZMW/纳米孔、波导、第三孔隙元件、衍射光束成形元件、第二孔隙元件、滤色层、第一孔隙元件和检测器层。示例性器件可以可选地包括位于滤色层和第一孔隙元件之间或在器件中的另一位置处的激光抑制层。纳米级集成分析器件的该实施例中的衍射光束成形元件将对从垂直于波导的ZMW/纳米孔发射的光进行引导。换句话说，该示例性器件将与图20A中所示的阵列布局相对应。
图24提供了图23中所描述的器件的更详细的示意性横截面，包括尺寸和示例性材料。图25示出了根据图24的设计制造的器件的横截面SEM显微图。
集成分析器件阵列的制作方法
在另一方面，本公开提供了用于制作集成分析器件阵列的方法。如上所述，这样的阵列可用于例如核苷酸的大规模测序，特别是基因组测序。可以通过各种方法来制作这样的阵列。用于制作该阵列的一种优选方法涉及使用针对集成电路的制作而被高度开发了的精密加工方法(例如，半导体或MEMS工艺方法)。已经使用类似的工艺来建立用于各种应用(包括喷墨打印机、加速度计、压力传感器和显示器(例如，数字微镜显示器(DMD))的微机电系统(MEMS)。可以将精密加工方法应用于大型衬底(比如晶圆)，其可以随后被切割成许多器件，从而实现一次生产许多器件。
本发明的方法可以例如将抗蚀工艺(例如，光致抗蚀剂)应用于限定衬底或其它层上的结构性元件。蚀刻工艺可用于生产三维结构，包括集成分析器件中的部件结构。沉积工艺可用于在器件上添加层。还可以采用其它半导体工艺(例如，灰化、抛光、释放、剥离和湿法清洗)来建立本发明的结构，这将在下文更详细描述。
例如，可以使用光刻技术(例如，常规光刻法、电子束光刻法等)来从聚合物材料(例如，光致抗蚀剂)中界定掩模层。作为替代，可以将光刻技术与层沉积方法一起使用，以使用例如铝、金、铂、铬或其它常规使用的金属来沉积金属掩模层，或沉积其它无机掩模层(例如，基于硅(比如，硅、二氧化硅等)的衬底)。作为替代，可以采用负色调工艺(negativetone process)来限定与例如纳米孔相对应的抗蚀剂柱。参见例如美国专利No.7,170,050，其全部内容以引用方式并入本文中以实现通用。然后，可以将掩模层沉积在抗蚀剂柱上，并且随后移除该柱。在特别优选的方面，下面的衬底和掩模层都是由相同的材料制成的，在特别优选的方面，该材料是诸如玻璃、石英或熔融石英的基于SiO2的衬底等的透明衬底材料。通过提供相同材料的掩模和下层，可以确保这两个层与其所暴露的环境具有相同的相互作用，从而使任何混合表面相互作用最小化。
在基于SiO2的衬底和掩模层的情况下，可以采用常规的制造工艺。例如，具有诸如波导的表面暴露特征的玻璃基底可以在其表面上沉积有抗蚀剂层。然后通过抗蚀剂层的适当曝光和显影来限定掩模层的负像(negative)，以提供在其中希望保持对底层特征的访问的抗蚀岛状物。然后将掩模层沉积在表面上，并且例如通过剥离工艺去除剩余的抗蚀剂岛状物，以提供到达下面的特征的开口。在金属层的情况下，可以通过许多方法(包括蒸发、溅射等)来实现沉积。这样的工艺已经在例如美国专利No.7,170,050中描述。在基于二氧化硅的掩模层的情况下，可以使用化学气相沉积(CVD)工艺来将硅层沉积到表面上。在剥离抗蚀剂层之后，热氧化工艺可以将掩模层转化为SiO2。作为替代，可以使用蚀刻方法来使用常规工艺蚀刻到达下层的接入点。例如，可以在下面的衬底上沉积硅层。然后，将抗蚀剂层沉积在硅层的表面上，并对其曝光并进行显影以限定掩模的图案。然后，使用适当的差异蚀刻(differential etch)移除硅但不移除下面的SiO2衬底，以从硅层中蚀刻出接入点。一旦限定了掩模层，则还是使用例如热氧化工艺将硅层转化为SiO2。
本发明的一个方面涉及一种用于制造集成分析器件的阵列的方法，该方法包括以下步骤：提供衬底层，其可以是感光检测器层(例如，CMOS传感器层、CCD层等)；在衬底层上沉积激光抑制滤光元件层；在激光抑制滤光元件层上沉积滤色层；在滤色层上沉积透镜元件层，特别是包括衍射光束成形元件的层；在透镜元件层上沉积激发波导层，在透镜元件层上沉积ZMW层；以及对ZMW材料构图和蚀刻以限定穿透ZMW层的上包覆层的纳米孔阵列。除非具体描述，否则在适当的情况下可以改变本文所述工艺的步骤的顺序。在一些实施例中，可以添加附加步骤，特别是在器件的其它层之间对一个或多个孔隙层所执行的沉积和构图。下文提供了这种制造工艺的具体示例的细节。可以在美国专利申请No.13/920,037(其全部内容以引用方式并入本文中以实现通用)中找到用于生产集成分析器件阵列的方法的其它示例。
在上述每个示例性精密加工技术中，从清洁的衬底层开始处理。本方法中所使用的衬底层可以是任何合适的刚性材料。衬底层材料可以包括例如无机氧化物材料(比如，二氧化硅)。优选地，衬底层材料包括诸如CMOS晶片(即，由CMOS传感器或CCD阵列组成的晶片)之类的检测器层。例如，参见CMOS Imagers From Phototransduction to ImageProcessing(2004)Yadid-Pecht and Etienne-Cummings,eds.；Springer；CMOS/CCDSensors and Camera Systems(2007)Holst and Lomheim；SPIE Press。
如上所述，在一些情况下,本发明的方法利用光刻技术使用抗蚀剂来限定和制造结构。这些抗蚀剂可以是例如光致抗蚀剂或电子束抗蚀剂。可以使用UV、深UV、G线、H线、I线或其它合适的波长或一组波长来使光致抗蚀剂显影。所使用的抗蚀剂的类型以及由此而用于工艺的仪器的类型将取决于所生成的特征的尺寸。在本文所述的许多工艺中，将使用较高分辨率抗蚀剂和装置来生产与反应体相对应的纳米孔，其中，纳米孔的尺寸可以在10nm至500nm的量级上，并且可以使用较低分辨率抗蚀剂和相关联的仪器来生成集成分析器件的其余部分，其可以具有1微米至20微米尺寸的特征。许多抗蚀剂在本领域中是已知的，并且许多抗蚀剂可从诸如Rohm和Haas和Shipley的公司商业获得。本发明的工艺中所使用的抗蚀剂可以是负性光致抗蚀剂或正性光致抗蚀剂。虽然本文中对使用负性光致抗蚀剂的工艺进行了描述，但是应当理解，在实际情况中也可以使用合适的正性光致抗蚀剂，反之亦然。在适当的情况下，也可以使用化学增幅抗蚀剂来增加抗蚀剂的敏感度。可以根据本领域中的教导和已知的方式而视情况地执行抗蚀剂的去除、衬底的清洗、漂洗、灰化和干燥。
在一些情况下，用于对纳米孔进行光刻的工具为光刻曝光工具，其能够生成具有尺寸为约10nm至约100nm的特征的结构。这样的系统包括例如ASML XT1250曝光工具。
本发明的一些方面中使用了蚀刻工艺，用以在衬底或其它层中生成三维特征，从而形成例如光学元件或透镜、或诸如纳米孔的反应体。所使用的蚀刻工艺将取决于所使用的材料的类型、特征的尺寸和抗蚀剂体系。在某些情况下，采用湿法蚀刻或湿法化学蚀刻。也可以采用电化学蚀刻。在一些实施例中，将等离子体蚀刻或反应离子蚀刻(RIE)用作蚀刻工艺。例如，在需要具有高纵横比的结构的情况下，也可以采用深反应离子蚀刻(DRIE)。也可以使用诸如利用二氯化氙而进行蚀刻的干法气相蚀刻。可以适当地使用体微加工或表面微加工来生成本公开的器件结构。在本公开的方法中使用的蚀刻可以是灰度蚀刻。对抗蚀剂形成和蚀刻的条件进行控制以生成具有所期望的几何图形(例如，具有所期望的侧壁角度)的侧壁。
本发明的一些工艺涉及反射层或包覆层的沉积。可以通过湿法工艺(包括在各层上旋转溶液)或通过气相工艺来实现这些反射层的沉积。合适的工艺包括电镀、溅射沉积、物理气相沉积、蒸发、分子束外延、原子层沉积和化学气相沉积。可以将金属用作反射层和包覆层。合适的金属包括金、镍、铝、铬、钛、铂和银。反射层和/或覆层可以包括铝，其可以通过使用可从CVC、Novellus或MRC获得的商业获得溅射工具进行溅射来实现沉积。
当在本发明的工艺期间沉积层时，在某些情况下，在移动到该工艺的下一步骤之前处理这些层。例如，可以对沉积层进行退火、平面化、清洁、钝化或轻微蚀刻，以改善其性能。
在本发明的一些方法中，沉积保护层或牺牲层。保护层可以是聚合物层、或可以是无机层。合适的保护层或牺牲层包括锗(Ge)和非晶硅(a-Si)。可以使用保护层来生成如本文所述的特征。可以针对保护层或牺牲层的选择反应性(例如，对湿法化学蚀刻剂的反应性)来选择用于保护层或牺牲层的材料的类型。例如，在一些情况下，在二氧化硅和铝存在的情况下，利用加热的过氧化氢来选择性地对锗进行蚀刻的能力使得可以利用其来生成与纳米孔相结合的光学结构。
在一些工艺中，可以采用回退(pull-back)工艺。回退工艺通常涉及从层内的特征的边缘处进行蚀刻，以便减小特征的尺寸。可以使用选择性地与具有暴露边缘的层进行反应的湿法化学试剂来进行回退。在某些情况下，使用过氧化氢来对锗层执行回退。
一些方法采用抛光步骤来从表面去除表面区域。合适的方法包括化学机械抛光或化学机械平面化(CMP)。
本发明的一些方法包括平坦化层。用于沉积平坦化层的方法取决于所用材料的类型。平坦化层可以是诸如无机材料的硬质材料(例如，氮化硅)；其可以是诸如铝的金属材料；或者其可以是诸如聚合物材料的软材料(例如，有机聚合物或硅基聚合物)。平坦化层可以是诸如二氧化硅材料的玻璃。在一些情况下，平坦化层包括旋涂玻璃(例如，硅酸盐、磷硅酸盐或硅氧烷材料)。合适的旋涂玻璃材料可从例如霍尼韦尔(Honeywell)公司获得。平坦化层可以包括例如掺杂有其它物质以控制其熔融性质的玻璃(例如，硼硅磷硅玻璃(BPSG))。合适的聚合物平面化材料包括例如聚酰亚胺。
比如在通过例如遵循下面示例的处理流程而完成本公开的阵列之后，比如可以通过例如将阵列分离成单独的芯片并准备将它们用于测序来对阵列进行进一步的处理。进一步的处理步骤将视情况而定，但是其通常可以包括以下处理：表面处理(用于设置将DNA聚合酶吸引至纳米孔的底部的特定表面的一系列湿/气相处理)；堆叠(用于保护表面经过处理的器件晶片的上表面的处理，在某些情况下，为测序混合物创建孔)；薄化(可以使复合的顶部镀过且表面处理过的器件晶片减薄的处理--包括磨光、抛光或其它处理)；切割(使用标准半导体切割锯来将复合的晶片分成单个芯片的处理)；以及封装(涉及标准拾取和放置工具将芯片安装到衬底上并建立用于数据采集的电/光输出的处理)。这些进一步的处理步骤是本领域已知的或者已经在诸如美国专利申请公开No.2008/0176769和No.2011/0183409(其全部内容以引用方式并入到本文中以实现通用)的参考文献中公开。
如上所述，可以将本发明的阵列并入到分析系统中以分析在阵列的纳米孔中发生的多重反应。本文描述的阵列通常具有流体可从顶部进入并且可从底部进行光学分析的纳米孔。因此，通常将阵列并入到其中引入了感兴趣的反应混合物的容器中。在一些情况下，各个纳米孔均与一定体积的流体相接触，其中，该流体可以具有例如可以被分析的多个核苷酸模板分子，并且可以具有核苷酸、辅因子和用于进行待分析的反应的其它添加剂。
可以将包括阵列的容器放置在具有适当的光学部件、计算机控制和数据分析系统的仪器内。可以将包括阵列的容器保留在该仪器内，以便可以控制反应条件(例如，容器温度和容器大气条件)。容器大气条件可以包括样品上方的气体的组成(例如，湿气)以及其它气态物质(比如，氧)的含量。
对于相关领域的普通技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范围或其任何实施例的情况下，可以对本文所述的方法和应用进行其它适当的修改和改变。现在已经对本发明进行了详细的描述，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，下面的实施例仅仅出于说明的目的而包括于此，其不旨在限制本发明。
示例
图26中示出了根据本发明的一个方面的示例性半导体制造工艺，其示出了集成分析器件阵列的制造，该集成分析器件阵列包括衍射光束成形元件，所述衍射光束成形元件用于在空间上将从纳米级发射体发射的光进行分离，并且将空间上分离的光引导穿过多个滤色器从而到达检测器层内的多个感测区域。
在示例性方法中，尽管阵列可被设计成附接到单独的检测器装置，但是该工艺均从干净的半导体衬底层处(优选地是集成的CMOS检测器层)开始。因此，衬底层可以是具有对于从反应孔发射的光而言的足够透明度的任何合适的刚性材料。对于适当的检测器层的示例，参见CMOS Imagers From Phototransduction to Image Processing(2004)Yadid-Pecht and Etienne-Cummings,eds.；Springer；CMOS/CCD Sensors and Camera Systems(2007)Holst and Lomheim；SPIE Press。
可以通过例如湿条法或其它合适的清洁步骤来准备用于沉积的衬底的表面。如图26A的步骤1-3所示的那样，通过SiN层的钝化来打开接合焊盘，并且利用氧化物对表面进行填充，并且使表面平坦化。
接下来，如图26A的步骤4-6所示，利用氧化物对传感器衬底层进行构图以生成图案零层对准标记。图案结构与CMOS顶部金属对准标记相对准，并且零标记了用于后续叠层图案构图的最低级别对准层。如图26A的步骤7-12所示，沉积孔隙1。如上面更详细指出的，该层用于从衍射光束成形元件中筛选出低角度信号噪声。此外，孔隙1层还可以对零标记进行装饰，以使其更容易可见以用于随后的对准。在这个示例中，孔隙层由氮化钛组成，且其厚度约为100nm。图26B中示出了传感器衬底和孔隙1层的图形表示。
接下来，如图26C的步骤13-15所示，沉积激光抑制滤光层。如所示沉积后那样，该滤光层包括非晶硅和二氧化硅的交替层。图26D示出了传感器衬底、孔隙1层和激光抑制层的图示。注意，步骤14还包括沉积CF1(滤色层的第一部分)。图26D中未示出该滤色层。
如图26E的步骤16-26所示，在激光抑制滤光层的顶部设置有滤色层。对于该示例，在阵列的每个器件的检测器层上均存在两个单独的感测区域，因此，如图26F中形象地示出的那样，每个器件中的滤色层包括两个不同的滤色器CF1和CF2。如所示沉积后那样，各滤光器自身包括非晶硅和二氧化硅的交替层。滤色器CF1作为激光抑制滤光器沉积的一部分而被沉积。在该工艺的步骤16-19中对该滤色器CF1进行构图和蚀刻。在该工艺的步骤20中沉积滤色器CF2，并在步骤22至25中对其进行构图和蚀刻。图26F示出了传感器衬底、孔隙1层、激光抑制滤光层和滤色层的图示。在该示例中，滤光器CF1和CF2的不同之处仅在于两个氧化物层厚度不同。
如图26G的步骤27至32所示，制备本示例中的第二孔隙层(孔隙2)，并且如步骤33至36所示，第二孔隙层的顶部制备有透镜隔垫氧化层。图26H中示出了传感器衬底、孔隙1层、激光抑制层、滤色层、孔隙2层和透镜隔垫氧化层的图示。
通过对透镜隔垫氧化层进行光刻构图(如图26I的步骤37-46所示)且随后沉积富碳非晶硅并抛光(如图26I的步骤47-48所示)来制备包括衍射光束成形元件的透镜元件层。图26J中提供了在对透镜隔垫氧化层进行光刻构图之后和沉积富碳非晶硅之前形成的中间衬底的图示。
接下来，如图26K的步骤49-56所示，对构图、填充和抛光后的透镜层进行构图、向其沉积氮化钛、并再次构图以形成孔隙3。图26L图形化地示出了所得到的衬底，其包括传感器衬底、孔隙1层、激光抑制滤光层、滤色层、孔隙2层、透镜隔垫氧化层、透镜层和孔隙3层。
随后的如图26M中所提供的步骤57-68表示反射器氧化层的沉积。图26N中示出了这种沉积的结果。
如图26O的步骤69-78所示，向衬底添加激发波导层。在该示例中，在步骤69中，沉积包括氮化硅波导的材料，在步骤71和74中，对该波导进行蚀刻，并且在步骤76和78中，沉积氧化物包覆层。图26P中形象地示出了这些工艺步骤的产物，其包括传感器衬底、孔隙1层、激光抑制滤光层、滤色层、孔隙2层、透镜隔垫氧化层、透镜层、孔隙3层和波导层。
图26Q的步骤79-91示出了零模式波导(ZMW)层的制造。具体地，该图示出了在步骤79中沉积铝/氮化钛表面层，以及随后在步骤86中对ZMW孔进行光刻开口。图26R形象地示出了添加零模式波导(ZMW)层所形成的产物，其包括上述所有层以及ZMW/纳米孔层。应当注意，图26中的任何一种图中所示出的尺寸仅是处于说明的目的而示出的，不应将其视为任何方式的限制。
在所有其它工艺流程步骤完成后，使用清洁工艺步骤来处理阵列以去除所有残余物。附加步骤可以包括例如深蚀刻步骤，以生成到CMOS接合焊盘的接线，并将阵列耦接到器件的其它部件。
本文提及的所有专利、专利公布和其它出版的参考文献均通过引用方式将其整体并入到本文中，就如同以引用方式来单独且专门地将它们中的每一个并入到本文中一样。
虽然已经提供了具体实施例，但是上述描述是说明性的而非限制性的。先前描述的实施例的任何一个或多个特征可以以任何方式与本发明中的任何其它实施例的一个或多个特征组合。此外，本领域技术人员在阅读本说明书之后，本发明的许多变型对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，应该通过参考所附权利要求及其等同物的全部范围来确定本发明的范围。

Claims (34)

1.一种集成分析器件阵列，每个器件包括：
纳米级发射体；
检测器层，其光学地耦接到所述纳米级发射体，其中，所述检测器层包括两个感测区域，每个感测区域具有与另一感测区域的边缘相邻的边缘或具有与另一感测区域的角部相邻的角部；和
衍射光束成形元件，其设置在所述纳米级发射体和所述检测器层之间；
其中，所述纳米级发射体位于所述两个感测区域的所述相邻边缘或所述相邻角部上方；
其中，通过所述发射体内的多个发射物从所述纳米级发射体发射光；并且
其中，所述衍射光束成形元件在空间上分离从所述纳米级发射体发射的光，并且将空间上分离的光引导到所述两个感测区域。
2.根据权利要求1所述的阵列，其中，所述衍射光束成形元件是混合透镜。
3.根据权利要求1所述的阵列，其中，所述衍射光束成形元件包括菲涅耳透镜。
4.根据权利要求1所述的阵列，还包括设置在所述衍射光束成形元件和所述检测器层之间的滤色层。
5.根据权利要求4所述的阵列，其中，所述滤色层包括多个滤色元件，每个滤色元件光学地耦接到一个检测器层感测区域，并且专用于一定范围的光波长。
6.根据权利要求1所述的阵列，还包括：
光学地耦接至所述纳米级发射体的激发源。
7.根据权利要求6所述的阵列，还包括：
设置在所述激发源和所述检测器层之间的至少一个孔隙层。
8.根据权利要求6所述的阵列，还包括：
激光抑制滤光层，其设置在所述激发源和所述检测器层之间。
9.根据权利要求1所述的阵列，还包括：
波导激发源，其光学地耦接到所述纳米级发射体。
10.根据权利要求9所述的阵列，其中，所述纳米级发射体在所述波导激发源上方直接对准。
11.根据权利要求9所述的阵列，其中，所述感测区域相对于所述波导激发源共线。
12.根据权利要求9所述的阵列，其中，所述感测区域相对于所述波导激发源不共线。
13.根据权利要求9所述的阵列，其中，所述感测区域相对于所述波导激发源成对角。
14.根据权利要求9所述的阵列，其中，所述感测区域相对于所述波导激发源垂直。
15.根据权利要求9所述的阵列，包括光学地耦接到多个纳米级发射体的多个波导激发源。
16.根据权利要求15所述的阵列，其中，所述多个波导激发源彼此平行地定向。
17.根据权利要求15所述的阵列，其中，所述多个纳米级发射体在所述多个波导激发源上方直接对准。
18.根据权利要求17所述的阵列，其中，所述纳米级发射体以规则的网格图案的形式排列。
19.根据权利要求17所述的阵列，其中，所述纳米级发射体以偏移的网格图案的形式排列。
20.根据权利要求15所述的阵列，其中，所述感测区域相对于所述波导激发源共线。
21.根据权利要求15所述的阵列，其中，所述感测区域相对于所述波导激发源不共线。
22.根据权利要求21所述的阵列，其中，所述感测区域相对于所述波导激发源成对角。
23.根据权利要求22所述的阵列，其中，与第一波导激发源相关联的感测区域相对于该第一波导激发源成+45°的对角，并且与相邻的第二波导激发源相关联的检测器感测区域相对于该相邻的第二波导发源成-45°的对角。
24.根据权利要求21所述的阵列，其中，所述感测区域相对于所述波导激发源垂直。
25.根据权利要求1所述的阵列，其中，所述检测器层集成至所述器件。
26.根据权利要求1所述的阵列，其中，所述检测器层未集成至所述器件。
27.根据权利要求1所述的阵列，其中，所述衍射光束成形元件使从所述发射体发射的光准直。
28.根据权利要求1所述的阵列，其中，所述感测区域是矩形的。
29.根据权利要求1所述的阵列，其中，所述检测器层是CMOS传感器的一部分。
30.根据权利要求1所述的阵列，还包括设置在所述纳米级发射体内的分析物。
31.根据权利要求30所述的阵列，其中，所述分析物包括生物样品。
32.根据权利要求31所述的阵列，其中，所述生物样品包括核苷酸。
33.根据权利要求31所述的阵列，其中，所述生物样品包含聚合酶。
34.根据权利要求1所述的阵列，其中，所述阵列包括至少1000个、至少10000个、至少100000个、至少1000000个、或至少10000000个纳米级发射体。
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