CN115141730A - 一种分离式测序芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分离式测序芯片，所述测序芯片包括反应层、光学层以及信号收集层；所述反应层包括包覆层及设置在包覆层上的反应材料层，所述包覆层内部设有光波导，所述反应材料层上设置有反应孔；所述光学层包括光学收集元件；所述信号收集层包括像素元件和设在所述像素元件上方的信号收集区；所述反应层与所述信号收集层分离设置。所述测序芯片采用分离式架构，所述反应层为可抛弃耗材，所述光学层与信号收集层为循环使用的部件，大大降低了测序芯片的成本。本发明还提供了一种制备分离式测序芯片反应层的方法，用于制备所述反应层，制备方法复杂程度较低。

Description

一种分离式测序芯片及其制备方法

技术领域

本发明属于基因测序领域，尤其涉及一种分离式测序芯片及其制备方法。

背景技术

生物芯片技术是一项综合性的高新技术，它涉及生物、化学、医学、精密加工、光学、微电子技术、信息等领域，是一个学科交叉性很强的研究项目。虽然生物芯片的研究已有了巨大的发展，但一些相关技术如检测技术的发展制约了生物芯片技术的进一步发展。

生物芯片的制备主要依赖于微细加工、自动化及化学合成技术。根据不同的使用要求，可以采用微加工技术在芯片的基底材料上加工出各种微细结构，然后再施加必要的生物化学物质并进行表面处理。

基因测序的最关键的部分主要依赖基因测序芯片完成。而反应结构是测序芯片必不可少缺少的一部分，测序芯片是DNA分子的载体，在反应结构中通过特定的光学系统对荧光标记的碱基进行激发，其性能直接影响测序的正确性。

大多数的DNA芯片分析采用的是荧光检测，测序反应在芯片内发生。现有的基因测序芯片，是利用半导体工艺在基板（硅片）上形成纳米阱或微米阱作为反应池。在反应池中通过特定的光学系统对荧光标记的碱基进行激发，被荧光基团标记的某一类碱基(腺嘌呤、胸腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤中的一种)，在特定波长的光照的情况下被激发而发出特定颜色的光。通过信号收集结构采集相应荧光标记物发射的荧光信号，检测接收并对碱基序列进行分析，进而推断出基因中碱基的排序。

目前比较典型的DNA芯片制备方法有4种。第一种是Affymetrix公司开发的光引导原位合成法，该方法是微加工技术中光刻工艺与光化学合成法相结合的产物。第二种方法是Incyte Pharmaceutical公司采用的化学喷射法，该方法是将合成好的寡核苷酸探针定点喷射到芯片上并加以固定化来制作DNA芯片。第三种方法是斯坦福大学研制的接触式点涂法，在DNA芯片制备中通过高速精密机械手的精确移动让移液头与玻璃芯片接触而将DNA探针涂敷在芯片上。第四种方法是通过使用4支分别装有A、T、G、C核苷的压电喷头在芯片上并行合成DNA探针。

在现有技术中，测序芯片的制备工艺复杂，进而导致测序成本高。测序领域一直追求成本更低，速度更快，精度更高，读长更长的新型测序技术。测序成本的大幅降低，可以促进测序快速的发展，进而推动了精准医疗和个性化医疗的发展。因此，科学家们仍然一直在追求更加完美的测序技术，力求解决成本高，精度低的缺点。

发明内容

鉴于以上所述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于：提供一种分离式测序芯片，采用分离式架构，可实现部分结构循环使用，降低芯片的制备成本。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种分离式测序芯片，所述测序芯片包括反应层、光学层以及信号收集层；所述反应层包括包覆层及设置在包覆层上的反应材料层，所述包覆层内部设有光波导，所述反应材料层上设置有反应孔；所述光学层包括光学收集元件；所述信号收集层包括像素元件和设在所述像素元件上方的信号收集区；所述反应层与所述信号收集层分离设置。所述测序芯片采用分离式架构，所述反应层为可抛弃耗材，所述光学层与信号收集层为循环使用的部件，大大降低了测序芯片的成本。

所述光学层设在所述反应层与所述信号收集层之间。所述光学层与所述反应层设置为一体式结构，则所述信号收集层为独立结构可重复使用。所述光学层与所述反应层通过键合方式形成一体式结构。

或所述光学层与所述信号收集层设置为一体式结构，则所述反应层为可抛弃结构。所述光学层与所述信号收集层通过封装形成一体式结构。

所述信号收集区包括滤光层，所述滤光层为单一光学性质的滤光层或不同光学性质的滤光层。当所述滤光层为单一光学性质的滤光层时，所述信号收集区还包括分光元件。所述分光元件为棱镜或光栅。所述像素元件为多像素元件或单像素元件。所述滤光层为单一光学性质的滤光层时，只滤除激发光，根据荧光信号的强度来判断碱基的身份。当所述像素元件为多像素元件时，所述滤光层还可以为不同光学性质的滤光层，用于检测不同碱基的荧光信号；或使用分光元件对不同的发射波段的光学信号进行分离，将荧光信号在空间上展开，投射在不同的像素元件上，实现不同波段信号的检测。

所述信号收集层包括包围信号收集区的挡光侧壁。所述挡光侧壁的材料优选为氮化钛。

所述反应材料层的厚度取值范围为10 nm-1000 nm，优选为50nm-200nm。

所述包覆层从下往上包括光波导层，第二材料层。所述光波导设在所述光波导层。所述光波导层下面还包括表面处理平整的第一材料层。

所述反应材料层的材料为第一聚合物、金或铝中的一种；所述包覆层的材料为二氧化硅或第二聚合物。当所述反应材料层和所述包覆层均选为聚合物时，所述第一聚合物不同于所述第二聚合物。所述第一聚合物与所述第二聚合物选自聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸、硅酮胶、SU-8高分子聚合物、水凝胶等，但不限于所例举出的聚合物。所述反应材料层和包覆层均优选使用聚合物，所述聚合物容易制备且价格低廉，可以降低反应层的制备成本，且所述反应材料层和包覆层的聚合物材质不同，方便实现聚合物的选择性孔底修饰。

所述反应孔对应设置在所述光波导的正上方。所述反应孔底部与所述光波导上表面的距离不大于200nm。所述光波导由氮化硅、铌酸锂、钽酸锂中的任一种材料制成，且不限于这几种材料。使用如耦合光栅，端面耦合等方式，将激发光耦合进入所述光波导中，所述光波导表面的近场消逝波作为激发光源，进入所述反应孔的底部，激发反应孔内荧光分子产生不同波段或不同强度的荧光信号。所述反应孔对应设置在所述光波导的正上方，减少了光波损失，耦合效率高。

所述反应孔的孔径取值范围为10 nm-500 nm，优选为80nm-100 nm；所述反应孔的深度取值范围为10 nm-500 nm，优选为80 nm-200 nm。所述测序芯片包括多个所述反应孔，所述反应孔之间的中心距离取值范围为200 nm-10 mm，优选为1μm-100μm。 所述反应孔剖视图可以为各种形状，一般优选为正方形、半圆形、半椭圆形或多边形中的一种。对应的，所述反应孔俯视图的形状分别为正方形、圆形、椭圆形或多边形。

所述光学收集元件用于将所述反应孔内的荧光信号收集并投射至信号收集层。所述光学层材料选为聚合物，可以降低芯片的制备成本。所述光学收集元件为微透镜阵列、菲涅尔透镜阵列、超透镜阵列、固体浸没透镜阵列中的一种。

测序芯片在DNA测序应用的过程中，激发光在光波导中传播，光波导表面的近场消逝波作为激发光源，进入反应孔的底部，激发反应孔内核苷酸类似物上的荧光分子，产生不同波段或不同强度的荧光信号，分别对应不同的核苷酸身份信息；荧光信号被光学收集元件收集并投射至信号收集层，经信号解析后得到DNA的序列信息。

硅片的正面和反面根据加工工序不同区分，例如硅片正面加工工艺要求更精细，硅片反面加工工艺要求相对较低，可将具有较小弯曲度硅片的凸面作为反面，硅片的凹面作为正面。一种制备测序芯片的方法，用于制备所述测序芯片的反应层，所述方法包括以下步骤：

步骤S1.选取硅片，在硅片的正面形成第一材料层，表面处理平整；

步骤S2.在所述第一材料层表面蒸镀一层光学透明材料；通过反应离子刻蚀工艺将所述光学透明材料形成光波导；

步骤S3.在所述光波导上覆盖第二材料层，所述第一材料层与第二材料层将所述光波导包裹，构成包覆层；

步骤S4.在所述包覆层上形成第三材料层，作为反应材料层；

步骤S5.使用反应离子刻蚀方法在所述反应材料层刻蚀出反应孔。

所述步骤S1中形成的第一材料层厚度取值范围为10 nm -100μm，所述步骤S3中形成的第二材料层厚度取值范围为10 nm-1000 nm，优选为200nm-300nm。所述第一材料层与第二材料层为同种材料，所述同种材料为高折射率的二氧化硅或第二聚合物中的一种。所述步骤S4中形成的所述第三材料层的厚度取值范围为10 nm-1000 nm，优选为50nm-200nm。所述第三材料层的材料为第一聚合物、金或铝中的一种。

所述步骤S2中形成的光学透明材料的厚度取值范围为10 nm-1000 nm，优选为200nm。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

所述测序芯片采用分离式架构，所述反应层与所述信号收集层分离，所述反应层与所述信号收集层之间还设有光学层。所述光学层与所述反应层设置为一体式结构，或所述光学层与所述信号收集层设置为一体式结构，所述反应层为可抛弃耗材，所述光学层与信号收集层为循环使用的部件，大大降低了测序芯片的成本；其次，所述反应层与光学层的材料选为聚合物，进一步降低了测序芯片的成本。

本发明还提供了一种分离式测序芯片反应层的制备方法，用于制备所述反应层，制备方法复杂程度较低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种分离式测序芯片的结构示意图。

图2为本发明一实施例中一种分离式测序芯片的结构示意图。

图3为本发明另一实施例中一种分离式测序芯片的结构示意图。

图4为本发明一种分离式测序芯片的像素元件为单像素元件的结构示意图。

图5为本发明一种分离式测序芯片反应层的结构示意图。

图6为本发明一种分离式测序芯片反应层的不同形状的反应孔剖视图。

图7为本发明一实施例中一种分离式测序芯片反应层的制备方法流程图。

图8为本发明另一实施例中一种分离式测序芯片反应层的制备方法流程图。

附图标记：1-反应层，11-反应孔，12-反应材料层，13-光波导，14-包覆层，2-光学层，21-光学收集元件，3-信号收集层，31-信号收集区，32-挡光侧壁，33-多相素元件，34-单相素元件。

具体实施方式

下面将对本发明具体实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

还需要说明的是，在本文中，诸如术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

本发明提供的一种分离式测序芯片，参照图1，所述测序芯片采用分离式架构，包括反应层1、光学层2以及信号收集层3；所述反应层1与所述信号收集层3分离；所述反应层1包括包覆层14以及覆盖在包覆层上的反应材料层12，所述包覆层14内部设有光波导13，所述反应材料层12上设置有反应孔11；所述光学层2包括光学收集元件21，所述光学收集元件21为微透镜阵列、菲涅尔透镜阵列、超透镜阵列、固体浸没透镜阵列中的一种；所述信号收集层3包括像素元件，设在像素元件上方的信号收集区31，以及包围信号收集区31的挡光侧壁32。

为了兼顾测序的方便与快捷，所述测序芯片的架构可以设置为两层相对独立的结构，参照图2，所述光学层2与信号收集层3通过封装形成一体式结构，所述反应层1为可抛弃的部件，所述光学层2与所述信号收集层3可循环使用。

所述反应层1包括反应材料层12、包覆层14，在本实施例中，所述反应材料层12为第一聚合物，在其他实施例中，所述反应材料层12还可以是金层或铝层，金层或铝层使用半导体工艺中常用的金属沉积工艺，如磁控溅射，物理气相沉积镀膜工艺等。所述第一聚合物选自聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸、硅酮胶、SU-8高分子聚合物、水凝胶等。

所述反应材料层12上设置有反应孔11，在本实施例中，所述反应孔11的剖视图为正方形；参照图6，在其他实施例中，所述反应孔11的剖视图的形状还可以是半圆形、半椭圆形或多边形中的一种，所述反应孔11的边长取值选为200nm，其深度取值选为200nm。

所述包覆层14的材料可以为高光学折射率的二氧化硅，还可以为第二聚合物，所述第二聚合物例如聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸、硅酮胶、SU-8高分子聚合物、水凝胶等，值得注意的是，所述反应材料层12与所述包覆层14均选为聚合物时，所述包覆层14所选择第二聚合物与所述反应材料层12所选择第一聚合物为不同聚合物材料且活性基团不同。采用生物素-亲和素系统将DNA聚合酶固定在反应孔底部时，生物素上的活性基团与反应孔底部表面的包覆层材料上的活性基团发生反应，而生物素上的活性基团与反应孔侧壁表面的反应材料层上的活性基团不会发生反应，从而将DNA聚合酶选择性地固定在反应孔底部。例如，所述反应材料层材料选择聚合物中的二甲基硅氧烷，所述二甲基硅氧烷具有烷烃分子；所述包覆层材料选择聚甲基丙烯酸，所述聚甲基丙烯酸具有羧基活性基团；选择末端携带羟基的生物素；烷烃分子与羟基不能发生化学反应，羟基与羧基发生共价反应。

所述包覆层14内部设有光波导13，所述光波导13为低折射率的光学透明材料，如氮化硅、铌酸锂、钽酸锂中的一种，优选为氮化硅；所述光波导13设在所述反应孔11的正下方，减少了光波损失，耦合效率高；所述反应孔11底部与所述光波导13上表面的距离取值范围优选为0-100 nm。使用如耦合光栅方式，将激发光耦合进入所述光波导13中，所述光波导13表面的近场消逝波作为激发光源，进入所述反应孔11的底部，激发反应孔11内荧光分子产生不同波段或不同强度的荧光信号。

所述光学层2的材料选为聚合物，所述光学层2包括所述光学收集元件21，所述光学收集元件21选用微透镜阵列，但不限于微透镜阵列，还可以选为菲涅尔透镜阵列、超透镜阵列、固体浸没透镜阵列中的一种。所述光学收集元件21用于将所述反应孔11内的荧光信号收集并投射至信号收集层3。

所述信号收集层3包括信号收集区31、挡光侧壁32以及像素元件，所述信号收集区31设在像素元件上方，所述信号收集区31包括滤光层，所述滤光层为单一光学性质的滤光层或不同光学性质的滤光层。当所述滤光层为单一光学性质的滤光层时，只滤除激发光，根据荧光信号的强度来判断碱基的身份。当所述像素元件为多像素元件33时，所述滤光层还可以为不同光学性质的滤光层，用于检测不同碱基的荧光信号；或使用分光元件对不同的发射波段的光学信号进行分离，将荧光信号在空间上展开，投射在不同的像素元件上，实现不同波段信号的检测。所述分光元件可以是光栅或棱镜。所述挡光侧壁32将所述信号收集区31包围，所述挡光侧壁32的材料为氮化钛。所述像素元件可以为多像素元件33，参照图4，所述像素元件也可以为单像素元件34。

所述测序芯片在DNA测序应用的过程中，激发光在所述光波导13中传播，所述光波导13表面的近场消逝波作为激发光源，进入所述反应孔11的底部，激发所述反应孔11内核苷酸类似物上的荧光分子，产生不同波段或不同强度的荧光信号，分别对应不同的核苷酸身份信息，荧光信号被所述光学收集元件21收集并投射至信号收集层3，经信号解析后得到DNA的序列信息。

在另一实施例中，参照图3，与上述实施例不同之处为：所述信号收集层3作为一个独立的结构可重复循环使用，所述反应层1与光学层2作为一体式结构。本实施例中所述反应层1与光学层2是由价格低廉且容易制备的聚合物材料制备而成，从工艺的角度来看，所述反应层1与光学层2可以通过键合方式形成一体式结构。

本发明提供了一种制备分离式测序芯片反应层的方法，结合参照图5与图7，所述反应层的制备应采取从下而上的方法：步骤S1.选取硅片，在硅片的正面形成第一材料层，表面处理平整；步骤S2.在所述第一材料层表面蒸镀一层光学透明材料；通过反应离子刻蚀工艺将所述光学透明材料形成光波导；步骤S3.在所述光波导上覆盖第二材料层，所述第一材料层与第二材料层将所述光波导包裹，构成包覆层；步骤S4.在所述包覆层上形成第三材料层，作为反应材料层；步骤S5.使用反应离子刻蚀方法在所述反应材料层刻蚀出反应孔。

具体做法为：选取硅片，硅片为4、8、12英寸的一种，但不限于4、8、12英寸；在硅片正面旋涂一层厚度优选为500 nm的第二聚合物，所述第二聚合物例如聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸、硅酮胶、SU-8高分子聚合物、水凝胶等；表面处理平整，在第二聚合物表面再次蒸镀一层厚度优选为200 nm的氮化硅薄膜，所述氮化硅薄膜表面旋涂光刻胶，电子束曝光制作掩模版，使用反应离子刻蚀将氮化硅薄膜刻蚀成光波导13，所述光波导13的材料还可以选择铌酸锂、钽酸锂等，再次在所述光波导13的表面旋涂一层厚度优选200 nm的第二聚合物，所选200 nm的第二聚合物与上述硅片正面旋涂一层厚度优选为500 nm的第二聚合物相同，所述第二聚合物将所述光波导13包裹，构成包覆层14。

在所述包覆层14的表面再次旋涂一层第一聚合物，所选第一聚合物也可以选自聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸、硅酮胶、SU-8高分子聚合物、水凝胶等，作为反应材料层12。所选反应材料层12的聚合物材料具有柔韧性、延展性和弯曲性，且还具有优秀的光学透明性质，所述反应材料层12还可以是金或铝中的一种，所述反应材料层12的厚度优选150nm；在反应材料层12表面旋涂光刻胶，电子束曝光制作掩模版，使用反应离子刻蚀方法在反应材料层刻蚀出呈正方形的反应孔11。

本发明提供的另一种制备分离式测序芯片反应层的方法，参照图5与图8，所述反应层的制备应采取从下而上的方法：步骤S1.选取硅片，在硅片的正面形成第一材料层，表面处理平整；步骤S2.在所述第一材料层表面蒸镀一层光学透明材料；通过反应离子刻蚀工艺将所述光学透明材料形成光波导；步骤S3.在所述光波导上覆盖第二材料层，所述第一材料层与第二材料层将所述光波导包裹，构成包覆层；步骤S4.在所述包覆层上形成第三材料层，作为反应材料层；步骤S5.使用反应离子刻蚀方法在所述反应材料层刻蚀出反应孔。

与上述实施例不同之处为所述包覆层14还可以选用二氧化硅，具体做法为：选取硅片，硅片为4、8、12英寸的一种，但不限于4、8、12英寸；使用化学气相沉积法在硅片正面蒸镀一层厚度优选为500 nm 的二氧化硅，表面处理平整后，在所述二氧化硅的表面蒸镀一层厚度优选为200 nm的氮化硅薄膜，所述氮化硅薄膜表面旋涂光刻胶，电子束曝光制作掩模版，使用反应离子刻蚀将所述氮化硅薄膜刻蚀成光波导13，所述光波导13的材料还可以选择铌酸锂、钽酸锂等，再次使用化学气相沉积法在所述光波导13表面沉积厚度优选200nm的二氧化硅，所述二氧化硅将所述光波导13包裹，构成包覆层14。

使用化学机械将形成包覆层14表面研磨平整后，在所述包覆层14表面沉积反应材料层12。所述反应材料层12为第一聚合物，还可以是金或铝中的一种；所述反应材料层12的厚度优选150 nm；在反应材料层12表面旋涂光刻胶，电子束曝光制作掩模版，使用反应离子刻蚀方法在反应材料层12刻蚀出呈正方形的反应孔11，所述反应孔11还可以刻蚀为其他形状。

以上对本发明所提供的一种分离式测序芯片进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的结构及工作原理进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护的范围内。

Claims (10)

1.一种分离式测序芯片，其特征在于，所述测序芯片包括反应层、光学层以及信号收集层；

所述反应层包括包覆层及设置在包覆层上的反应材料层，所述包覆层内部设有光波导，所述反应材料层上设置有反应孔；

所述光学层包括光学收集元件；

所述信号收集层包括像素元件和设在所述像素元件上方的信号收集区；

所述反应层与所述信号收集层分离设置。

2.根据权利要求1所述的一种分离式测序芯片，其特征在于，所述光学层与所述反应层设置为一体式结构，或所述光学层与所述信号收集层设置为一体式结构。

3.根据权利要求1或2所述的一种分离式测序芯片，其特征在于，所述信号收集区包括滤光层，所述滤光层为单一光学性质的滤光层或不同光学性质的滤光层。

4.根据权利要求3所述的一种分离式测序芯片，其特征在于，当所述滤光层为单一光学性质的滤光层时，所述信号收集区还包括分光元件。

5.根据权利要求1或2所述的一种分离式测序芯片，其特征在于，所述像素元件为多像素元件或单像素元件。

6.根据权利要求1或2所述的一种分离式测序芯片，其特征在于，所述信号收集层包括包围信号收集区的挡光侧壁。

7.根据权利要求1或2所述的一种分离式测序芯片，其特征在于，所述反应材料层的材料为第一聚合物、金或铝中的一种；所述包覆层的材料为二氧化硅或第二聚合物。

8.根据权利要求1或2所述的一种分离式测序芯片，其特征在于，所述反应孔对应设置在所述光波导的正上方，所述反应孔底部与所述光波导上表面的距离不大于200nm。

9.根据权利要求8所述的一种分离式测序芯片，其特征在于，所述测序芯片包括多个所述反应孔，所述反应孔之间的中心距离取值范围为200 nm-10 mm。

10.一种制备权利要求1-9任一项所述的测序芯片的方法，包括以下步骤：

步骤S1.选取硅片，在硅片的正面形成第一材料层，表面处理平整；

步骤S2.在所述第一材料层表面蒸镀一层光学透明材料；通过反应离子刻蚀工艺将所述光学透明材料形成光波导；

步骤S3.在所述光波导上覆盖第二材料层，所述第一材料层与第二材料层将所述光波导包裹，构成包覆层；

步骤S4.在所述包覆层上形成第三材料层，作为反应材料层；

步骤S5.使用反应离子刻蚀方法在所述反应材料层刻蚀出反应孔。

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