CN114230621A - N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了N‑乙酰氨基葡萄糖基甘油酯，其结构式如式Ⅰ所示，所述R1、R2独立地为脂肪酸形成的酰基；所述脂肪酸选自短链脂肪酸、中链脂肪酸或长链脂肪酸。制备时，先利用N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶的逆水解活性催化甘油和N‑乙酰氨基葡萄糖合成糖基甘油，再利用脂肪酶催化糖基甘油与不同的酰基供体酰化，合成N‑乙酰氨基葡萄糖基甘油酯。本发明还提供了N‑乙酰氨基葡萄糖基甘油，N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明首次合成了N‑乙酰氨基葡萄糖基甘油及其糖基甘油酯，丰富了糖基甘油酯产品的种类，该化合物有望应用于医药、食品等领域，作为药物或膳食补充剂。

Description

N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯及其制备方法
技术领域
本发明涉及N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯，及其制备方法，属于生物催化技术领域。
背景技术
糖基甘油酯(glyceroglycolipid)是糖类以还原末端通过糖苷键连接在单酰基或者二酰基甘油上形成的一类化合物，广泛存在于动物、植物、微生物中，具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、调节免疫等多种生理活性。视糖基和脂肪酰基种类和数目的不同，糖基甘油酯的活性表现出较大的差异性。一般而言，糖基数目较少、酰基数目较多、酰基不饱和度较高的糖基甘油酯表现出更好的生理活性。
糖基甘油酯的来源包括天然来源和人工合成两种，天然来源是从植物和藻类等生物体内进行分离提取，由于其在生物体内含量较低，往往需要消耗大量的植物和藻类资源。另外，糖基甘油酯的存在形式也较为复杂，分离纯化困难，需要在纯化精制上花费比较多的成本和精力，限制了其在精细化工、保健药物方面的应用，也不利于研究其构-效关系。近年来，许多研究者在人工合成糖基甘油酯方面取得了可喜的进展。在众多人工合成方法中，酶法由于其催化特异性高、副反应少、反应条件温和等优点，受到越来越多的关注，也为特定类型糖基甘油酯的设计和合成提供了可能。
N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-glucosamine)是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，在临床上也具有多种生理活性，可用于增强人体免疫系统，抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长，对于各种炎症，如骨关节炎及关节疼痛也有治疗作用。因此，利用酶法催化合成N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯对于新型药物的开发具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种新的糖基甘油酯——N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯，本发明的还提供了其制备方法。本发明先利用N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的逆水解活性催化甘油和N-乙酰氨基葡萄糖合成糖基甘油，再利用脂肪酶催化糖基甘油与不同的酰基供体酰化，合成N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯。本发明还提供了N-乙酰氨基葡萄糖基甘油、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。
本发明是通过以下技术方案实现的：
N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0003440331820000021
其中，所述R1、R2独立地为脂肪酸形成的酰基；所述脂肪酸选自短链脂肪酸、中链脂肪酸或长链脂肪酸。
进一步地，所述脂肪酸选自己酸、月桂酸、棕榈酸、二十二碳六烯酸乙酯。
所述N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯的制备方法，包括以下步骤：
(1)在N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550的作用下，甘油与N-乙酰氨基葡萄糖逆水解合成N-乙酰氨基葡萄糖基甘油；
所述N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550，来源于杆菌状链霉菌(Streptomycesbacillaris)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述N-乙酰氨基葡萄糖基甘油的结构式如式Ⅰ所示，其中，R1＝R2＝H；
(2)在脂肪酶的作用下，糖基甘油与脂肪酸进行酰化反应，合成N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯。
进一步地，所述步骤(1)具体如下：将甘油和N-乙酰氨基葡萄糖加入水中，混匀，加入N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，在40～60℃温度下，反应12～36h；其中，甘油与N-乙酰氨基葡萄糖的质量比为2～12:1，优选10:1；水与N-乙酰氨基葡萄糖的用量比为4～10:1(单位μl:mg)，优选7:1。
更进一步地，所述N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的用量为：5～30U/g N-乙酰氨基葡萄糖，优选25U/g N-乙酰氨基葡萄糖。
更进一步地，反应时控制pH值在4.6～6.6，优选5.0。
更进一步地，反应条件为：在50℃下反应24h。
进一步地，所述步骤(2)中，所述脂肪酶选自固定化脂肪酶Novozyme 435。
进一步地，所述步骤(2)中，所述脂肪酸选自己酸、月桂酸、棕榈酸、二十二碳六烯酸乙酯。
所述N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯在作为/制备补充多不饱和脂肪酸的膳食补充剂中的应用。
所述N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯在制备药物中的应用；所述药物为具有预防或治疗炎症功效的药物，或具有增强免疫力功效的药物，或具有抑制癌症功效的药物。
N-乙酰氨基葡萄糖基甘油，其结构式如式Ⅰ所示，其中，R1＝R2＝H。
所述N-乙酰氨基葡萄糖基甘油在制备药物中的应用；所述药物为具有预防或治疗炎症功效的药物，或具有增强免疫力功效的药物，或具有抑制癌症功效的药物。
一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550，来源于杆菌状链霉菌(Streptomycesbacillaris)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550的氨基酸序列如下所示(如SEQ ID NO:1所示)：
MSPTRGALVTGAAVTVAAAAVLTVVVWPEGSGSHPSRDAASPSGTSASAAAPSPSRSYPLSSAPSTIPAVREHTAARGPGWQPGENSTVVIAKGSEVLADEAQLLARELNIHYRGAEDAREGDVQLALGAKDQGPAESYTLTVRDRKVRITGPDESGVFYGTRTLKQSLKADRTVPEGVVNDRPDRPQRGLNLDIARKHYSAEWIEDRIREMGDLKLNQLGLHFSDDQAFRIESKTHPEVVSDEALTQDEVRRIVGLANSLHIEVVPEIDSPGHLGAVLRAHPDLQLRNTQGRESRGSIDISKPGAAKLIDELLDEYTDLFPGKFWHLGADEYQALMVRDPAASYPQLQRAAEQKHGSGATIEDLATGWLNDRAAVVEPKGRTAKAWNDGLFRDTKVVADKNIEIEYWTGKEIGARPPQEYLAAGYKMLNLNDEFLYYVLGEPNEFVYPTGKRIYEQWTPMVLRGTEPVAARYSPQILGGRFAVWGDLPNAQTVQQVADGIRMPLVATSQKLWDPREPELTWDQFQELAARTGSAG。
编码上述N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
编码N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550的基因的核苷酸序列如下所示(如SEQ IDNO:2所示)：
5-’atgtc gccca cgcga ggtgc cctcg tcacc ggcgc ggccg tcacg gtcgc ggccgccgcc gtcct caccg tcgtc gtctg gccgg aaggc tccgg cagcc acccg tcccg cgacg ccgcgtcgcc gtccg ggacc tccgc atcgg cggcc gcccc gtcgc cctcc cgcag ctacc cgctc tccagcgccc cgagc accat cccgg cggtc cgtga gcaca ccgcc gcgcg cgggc ccggc tggca gcccggcgag aacag cacgg tcgtc atcgc caagg gcagc gaggt cctcg cggac gaggc ccagc tgctcgccag ggagc tgaac atcca ctacc ggggc gccga ggacg cccgc gaggg ggatg tccag ctggcgctcg gggcg aagga ccagg ggccc gccga gtcgt acacg ctcac cgtcc gcgac cggaa ggtgcggatc accgg ccccg acgag tcggg ggtgt tctac ggcac ccgca cgctc aagca gtccc tgaaggcgga cagga ccgtg ccgga gggag tggtc aacga ccgcc ccgac cgccc gcagc gcgga ctgaacctcg acatc gcccg caagc actac agcgc ggagt ggata gagga ccgca tacgg gagat gggcgacctc aagct caacc agctc ggcct gcact tctcc gacga ccagg cgttc cggat cgagt ccaagaccca ccccg aggtg gtctc ggacg aggcc ctgac ccagg acgag gtccg ccgta tcgtc gggctcgcca acagc ctgca catcg aggtc gtccc cgaga tcgac tcgcc cggac acctc ggcgc ggtgctgcgc gccca ccccg atctc cagct ccgca acacc caggg ccggg agtcg cgcgg ctcca tcgacatctc caagc cgggg gcggc gaagc tgatc gacga gctgc tcgac gagta caccg acctg ttcccgggga agttc tggca cctgg gcgcc gacga gtacc aggcg ctgat ggtcc gcgac ccggc cgcctcctac ccgca gctcc agcgc gccgc cgagc agaag cacgg ctccg gcgcc acgat cgagg acctcgccac cggct ggctc aacga ccggg cggcg gtggt ggagc ccaag ggccg caccg ccaag gcgtggaacg acggc ctctt ccggg acacg aaggt cgtcg cggac aagaa catcg agatc gagta ctggaccggc aagga gatcg gcgcc cggcc cccgc aggag tacct ggcgg ccggc tacaa gatgc tcaacctcaa cgacg agttc ctcta ctacg tgctc ggcga gccga acgag ttcgt ctacc cgacc ggcaagcgga tctac gagca gtgga ccccg atggt gctgc gcggc accga gccgg tggcg gcccg ctactcgccg cagat cctcg gcggc cggtt cgcgg tctgg ggcga cctcc ccaac gcgca gacgg tacagcaggt cgcgg acggc atcag gatgc cgctc gtggc gacct cgcag aagct gtggg acccg cgggagccgg agctg acctg ggacc agttc cagga gctgg cggcc cggac gggca gcgcg ggctg a-3’。
所述N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550在催化N-乙酰氨基葡萄糖与甘油合成N-乙酰氨基葡萄糖基甘油中的应用。
本发明首次合成了N-乙酰氨基葡萄糖基甘油及其糖基甘油酯，丰富了糖基甘油酯产品的种类，为本研究领域提供了更多的参考。糖基甘油酯本身很容易被机体吸收利用，在发挥作用的基础上，甘油骨架也完全不会对机体造成代谢压力。由于所含糖基的特殊性，N-乙酰氨基葡萄糖基甘油及其糖基甘油酯有望被用于预防和治疗炎症、增强免疫、抑制癌症；同时，富含多不饱和脂肪酸的糖基甘油酯还可以作为膳食补充剂用于补充多不饱和脂肪酸。因此，本发明的N-乙酰氨基葡萄糖基甘油及其糖基甘油酯有望应用于医药、食品等领域，作为药物或膳食补充剂。
本发明的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550，是首个催化N-乙酰氨基葡萄糖基甘油合成的糖苷酶(糖苷酶多用于催化糖苷键的断裂，仅在少数研究中用于催化糖苷键的形成；对于N-乙酰氨基葡萄糖苷酶而言，目前已有的研究仅有利用酶催化合成寡糖的，还没有利用该酶合成糖基甘油的报道)，具有较高的逆水解活性，可催化N-乙酰氨基葡萄糖合成糖基甘油，在24h内其转化率可以达到32.51％。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：N-乙酰氨基葡萄糖基甘油的液相及质谱检测结果，其中，A：液相；B：质谱。
图2：反应体系中甘油含量对逆水解反应转化率的影响示意图。
图3：反应体系中含水量量对逆水解反应转化率的影响示意图。
图4：反应体系中pH值对逆水解反应转化率的影响示意图。
图5：反应体系中温度对逆水解反应转化率的影响示意图。
图6：反应体系中加酶量对逆水解反应转化率的影响示意图。
图7：N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯的质谱检测结果，其中，A、B、C、D分别是：1,2-二己酰-3-N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯、1-月桂酰-3-N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯、1-棕榈酰-3-N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯以及1-二十二碳六烯酰-3-N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯[M+Na]+的分子峰。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1：N-乙酰氨基葡萄糖苷酶片段的克隆表达
本发明在实验前期从山东省海洋微生物菌种保藏与应用工程技术研究中心购买了杆菌状链霉菌(Streptomyces bacillaris)，并对其进行了全基因组测序，通过氨基酸序列预测分析，从中找到了一个假定的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶片段sbnag2550(前期实验中，本发明还对实验室保存的两株链霉菌的基因组数据进行了筛选，包括Streptomycesbacillaris与Streptomyces violascens；经过克隆表达获得了多个假定的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，在对其逆水解活性进行筛选后，找到了效果较好的SbNag2550，其它的效果均不佳，明显不如SbNag2550，故不再赘述)。本发明对该片段进行了异源表达，载体使用pET-28a(+)，宿主采用大肠杆菌Bl21，利用同源重组原理构建N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的重组质粒。质粒线性化引物为：
28a-F：5-’aagcttgcggccgcactcgag-3’，如SEQ ID NO:3所示；
28a-R：5-’ggatccgcgacccatttgctgtcc-3’，如SEQ ID NO:4所示。
片段扩增引物为：
sbnag2550-F：5-’agcaaatgggtcgcggatccatgtcgcccacgcgaggtgc-3’，如SEQ IDNO:5所示；
sbnag2550-R：5-’agtgcggccgcaagcttgcccgcgctgcccgtc-3’，如SEQ ID NO:6所示。
将该重组工程菌接种LB培养基后于37℃培养至OD 600达到0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG后于20℃培养24h。收集菌体后用培养液五分之一体积的超纯水重悬菌体，360W超声破碎10min，以pNP-GlcNAc为底物进行酶活检测，结果表明破碎液的酶活可以达到15.8U/mL。
实施例2：利用SbNag2550催化逆水解反应合成N-乙酰氨基葡萄糖基甘油
称取1000mg甘油于反应瓶中，继续称取100mg N-乙酰氨基葡萄糖加入反应瓶，再加入100μL破碎液(实施例1制备得到的破碎液)。反应体系密封后于50℃，180rpm反应24h，取样100μL，加入1mL去离子水进行稀释，煮沸10min灭酶，利用0.45μm针式滤器除去不溶性杂质后用于液相和质谱检测。
液相检测条件为：岛津高效液相色谱仪，采用示差折光检测器，色谱柱为SHODEXSUGAR KS801，柱温箱设置为75℃，采用纯水进行洗脱，流速为1mL/min，分析时间为11min。底物甘油和N-乙酰氨基葡萄糖的出峰时间分别为8.522min和6.731min，产物N-乙酰氨基葡萄糖基甘油的出峰时间为6.276min，如图1A所示。
质谱检测条件：正离子模式，扫描范围为100-500eV，结果如图1B所示，图中318.1就是目的产物N-乙酰氨基葡萄糖基甘油[M+Na]+的分子峰，而244.1则是底物N-乙酰氨基葡萄糖[M+Na]+的分子峰。
实施例3：逆水解反应条件的优化
甘油添加量的优化：称取不同质量(200mg，400mg，600mg，800mg，1000mg和1200mg)的甘油于反应瓶中，称取100mg N-乙酰氨基葡萄糖加入各反应瓶，再加入2U SbNag2550(破碎液，以对pNP-GlcNAc的水解活性计)。反应体系密封后于50℃，180rpm反应48h，取样100μL，加入1mL去离子水进行稀释，煮沸10min灭酶后利用0.45μm针式滤器除去不溶性杂质，液相检测计算其转化率(由于没有标准品，转化率暂时以糖基甘油在N-乙酰氨基葡萄糖与糖基甘油面积之和中所占比例来计算)。结果表明(图2)，当甘油添加量从200mg逐渐增加至1000mg时，由于底物的比例不断升高，N-乙酰氨基葡萄糖的转化率也在不断升高。而当甘油添加量继续升高时，过多的甘油会影响体系的流动性，进而影响底物和酶分子之间的传质效果，转化率反而出现了下降。故选择添加1000mg甘油继续进行后续的反应优化，在该条件下，底物转化率达到23.16％。
反应体系含水量的优化：称取1000mg甘油于反应瓶中，继续称取100mg N-乙酰氨基葡萄糖加入反应瓶，再加入2U SbNag2550(破碎液，以对pNP-GlcNAc的水解活性计)，补加去离子水使体系含水量分别为400μL，500μL，600μL，700μL，800μL，900μL和1000μL。反应体系密封后于50℃，180rpm反应48h，取样100μL，加入1mL去离子水进行稀释，煮沸10min灭酶后利用0.45μm针式滤器除去不溶性杂质，液相检测计算其转化率。结果表明(图3)，N-乙酰氨基葡萄糖的转化率在体系含水量为700μL时达到峰值，48h时的转化率为24.69％。当含水量较低时，会严重影响体系的流动性，不利于酶分子与两种底物之间的接触，而当含水量过高时，糖苷酶的水解活性会有所增强，催化逆水解反应的能力相应减弱，从而降低了底物的转化率。
反应体系pH的优化：称取1000mg甘油于反应瓶中，继续称取100mg N-乙酰氨基葡萄糖加入反应瓶，再加入2U SbNag2550(破碎液，以对pNP-GlcNAc的水解活性计)，使体系含水量为600μL，再分别向反应瓶中加入100μL不同pH(4.6,5.0,5.4,5.8,6.2和6.6)的1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，以水作为对照。反应体系密封后于50℃，180rpm反应48h，取样100μL，加入1mL去离子水进行稀释，煮沸10min灭酶后利用0.45μm针式滤器除去不溶性杂质，液相检测计算其转化率。结果表明(图4)，pH对反应转化率影响很大，当pH从6.6逐渐降低时，甘油糖苷合成活性逐渐提高，在5.0达到峰值，转化效率超过30％。当反应体系过酸(4.6)或者过碱(6.6)时，其转化率会大大降低，甚至远低于在纯水体系中的转化率。
反应温度的优化：称取1000mg甘油于反应瓶中，继续称取100mg N-乙酰氨基葡萄糖加入反应瓶，再加入2U SbNag2550(破碎液，以对pNP-GlcNAc的水解活性计)，使体系含水量为600μL，再分别向反应瓶中加入100μL pH 5.0的1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。反应体系密封后于不同温度，180rpm反应48h，取样100μL，加入1mL去离子水进行稀释，煮沸10min灭酶后利用0.45μm针式滤器除去不溶性杂质，液相检测计算其转化率。结果表明(图5)，从40℃到50℃，转化率稳步上升，55℃比50℃略有提升，达到30.87％，而当温度继续提升至60℃时，反应转化率急剧下降，仅达到13.40％，说明该酶在60℃时及其不稳定，会很快变性失活，从而无法继续催化甘油糖苷的合成。
反应体系加酶量的优化：称取1000mg甘油于反应瓶中，继续称取100mg N-乙酰氨基葡萄糖加入反应瓶，再分别加入0.5U，1U，1.5U，2U，2.5U和3U的SbNag2550(破碎液，以对pNP-GlcNAc的水解活性计)，使体系含水量为600μL，再分别向反应瓶中加入100μL pH 5.0的1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。反应体系密封后于55℃，180rpm反应48h，取样100μL，加入1mL去离子水进行稀释，煮沸10min灭酶后利用0.45μm针式滤器除去不溶性杂质，液相检测计算其转化率。结果表明(图6)，转化率随着加酶量的提高逐渐升高，且升高的趋势越来越平缓，考虑到酶的成本，最终选择2.5U作为最适加酶量，此时转化率达到32.51％。
实施例4：N-乙酰氨基葡萄糖基甘油的纯化及固定化
称取1000mg甘油于反应瓶中，继续称取100mg N-乙酰氨基葡萄糖加入反应瓶，加入2.5U的SbNag2550(破碎液，以对pNP-GlcNAc的水解活性计)，使体系含水量为600μL，再向反应瓶中加入100μL pH 5.0的1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。反应体系密封后于55℃，180rpm反应48h，煮沸10min灭酶后利用0.45μm针式滤器除去不溶性杂质，得到含有N-乙酰氨基葡萄糖基甘油的反应液。
采用活性炭吸附法对N-乙酰氨基葡萄糖基甘油进行纯化。将上述反应液稀释20倍，加入活性炭(2g/mL反应液)，于20℃，200rpm振荡吸附30min。离心去除上清，用水再漂洗两次后，用与原稀释液等体积的1％乙醇溶液将活性炭漂洗三次，去除活性炭上吸附的底物。再次离心后用50％乙醇溶液洗脱产物。洗脱液经过旋转蒸发除去乙醇，剩余液体于-80℃预冻后经过冷冻干燥得到目的产物。液相检测结果表明，N-乙酰氨基葡萄糖基甘油的回收率达到42.56％，纯度达到50％以上，甘油的含量低于10％。纯化后的糖基甘油与10倍质量的大孔吸附树脂在甲醇润湿条件下充分搅拌，混合均匀后自然晾干，帮助糖基甘油在后期合成反应(实施例5)所用的有机相反应体系中更好地分散开来。
实施例5：脂肪酶Novozyme435催化合成N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯
称取4份各100mg固定化后的N-乙酰氨基葡萄糖基甘油于反应瓶中，称取50mg脂肪酸(分别为己酸、月桂酸、棕榈酸、二十二碳六烯酸乙酯)分别加入各反应瓶，再分别加入固定化脂肪酶Novozyme 435(商品化酶，常规购买得到)，最后分别加入2mL二氯甲烷。反应体系密封充氮后于50℃，180rpm反应12h。反应结束后将体系12000rpm离心2min去除固定化酶，取上清样200μL，加入1mL甲醇进行稀释，过膜后用于质谱检测。
质谱检测条件：正离子模式，扫描范围为100-1000eV。结果如图7所示，图7中A、B、C、D分别是：1,2-二己酰-3-N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯、1-月桂酰-3-N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯、1-棕榈酰-3-N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯以及1-二十二碳六烯酰-3-N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯[M+Na]+的分子峰。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯及其制备方法
<141> 2021-12-28
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 536
<212> PRT
<213> Streptomyces bacillaris
<400> 1
Met Ser Pro Thr Arg Gly Ala Leu Val Thr Gly Ala Ala Val Thr Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Val Leu Thr Val Val Val Trp Pro Glu Gly Ser Gly
20 25 30
Ser His Pro Ser Arg Asp Ala Ala Ser Pro Ser Gly Thr Ser Ala Ser
35 40 45
Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ser Arg Ser Tyr Pro Leu Ser Ser Ala Pro
50 55 60
Ser Thr Ile Pro Ala Val Arg Glu His Thr Ala Ala Arg Gly Pro Gly
65 70 75 80
Trp Gln Pro Gly Glu Asn Ser Thr Val Val Ile Ala Lys Gly Ser Glu
85 90 95
Val Leu Ala Asp Glu Ala Gln Leu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ile His
100 105 110
Tyr Arg Gly Ala Glu Asp Ala Arg Glu Gly Asp Val Gln Leu Ala Leu
115 120 125
Gly Ala Lys Asp Gln Gly Pro Ala Glu Ser Tyr Thr Leu Thr Val Arg
130 135 140
Asp Arg Lys Val Arg Ile Thr Gly Pro Asp Glu Ser Gly Val Phe Tyr
145 150 155 160
Gly Thr Arg Thr Leu Lys Gln Ser Leu Lys Ala Asp Arg Thr Val Pro
165 170 175
Glu Gly Val Val Asn Asp Arg Pro Asp Arg Pro Gln Arg Gly Leu Asn
180 185 190
Leu Asp Ile Ala Arg Lys His Tyr Ser Ala Glu Trp Ile Glu Asp Arg
195 200 205
Ile Arg Glu Met Gly Asp Leu Lys Leu Asn Gln Leu Gly Leu His Phe
210 215 220
Ser Asp Asp Gln Ala Phe Arg Ile Glu Ser Lys Thr His Pro Glu Val
225 230 235 240
Val Ser Asp Glu Ala Leu Thr Gln Asp Glu Val Arg Arg Ile Val Gly
245 250 255
Leu Ala Asn Ser Leu His Ile Glu Val Val Pro Glu Ile Asp Ser Pro
260 265 270
Gly His Leu Gly Ala Val Leu Arg Ala His Pro Asp Leu Gln Leu Arg
275 280 285
Asn Thr Gln Gly Arg Glu Ser Arg Gly Ser Ile Asp Ile Ser Lys Pro
290 295 300
Gly Ala Ala Lys Leu Ile Asp Glu Leu Leu Asp Glu Tyr Thr Asp Leu
305 310 315 320
Phe Pro Gly Lys Phe Trp His Leu Gly Ala Asp Glu Tyr Gln Ala Leu
325 330 335
Met Val Arg Asp Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Gln Leu Gln Arg Ala Ala
340 345 350
Glu Gln Lys His Gly Ser Gly Ala Thr Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly
355 360 365
Trp Leu Asn Asp Arg Ala Ala Val Val Glu Pro Lys Gly Arg Thr Ala
370 375 380
Lys Ala Trp Asn Asp Gly Leu Phe Arg Asp Thr Lys Val Val Ala Asp
385 390 395 400
Lys Asn Ile Glu Ile Glu Tyr Trp Thr Gly Lys Glu Ile Gly Ala Arg
405 410 415
Pro Pro Gln Glu Tyr Leu Ala Ala Gly Tyr Lys Met Leu Asn Leu Asn
420 425 430
Asp Glu Phe Leu Tyr Tyr Val Leu Gly Glu Pro Asn Glu Phe Val Tyr
435 440 445
Pro Thr Gly Lys Arg Ile Tyr Glu Gln Trp Thr Pro Met Val Leu Arg
450 455 460
Gly Thr Glu Pro Val Ala Ala Arg Tyr Ser Pro Gln Ile Leu Gly Gly
465 470 475 480
Arg Phe Ala Val Trp Gly Asp Leu Pro Asn Ala Gln Thr Val Gln Gln
485 490 495
Val Ala Asp Gly Ile Arg Met Pro Leu Val Ala Thr Ser Gln Lys Leu
500 505 510
Trp Asp Pro Arg Glu Pro Glu Leu Thr Trp Asp Gln Phe Gln Glu Leu
515 520 525
Ala Ala Arg Thr Gly Ser Ala Gly
530 535
<210> 2
<211> 1611
<212> DNA
<213> Streptomyces bacillaris
<400> 2
atgtcgccca cgcgaggtgc cctcgtcacc ggcgcggccg tcacggtcgc ggccgccgcc 60
gtcctcaccg tcgtcgtctg gccggaaggc tccggcagcc acccgtcccg cgacgccgcg 120
tcgccgtccg ggacctccgc atcggcggcc gccccgtcgc cctcccgcag ctacccgctc 180
tccagcgccc cgagcaccat cccggcggtc cgtgagcaca ccgccgcgcg cgggcccggc 240
tggcagcccg gcgagaacag cacggtcgtc atcgccaagg gcagcgaggt cctcgcggac 300
gaggcccagc tgctcgccag ggagctgaac atccactacc ggggcgccga ggacgcccgc 360
gagggggatg tccagctggc gctcggggcg aaggaccagg ggcccgccga gtcgtacacg 420
ctcaccgtcc gcgaccggaa ggtgcggatc accggccccg acgagtcggg ggtgttctac 480
ggcacccgca cgctcaagca gtccctgaag gcggacagga ccgtgccgga gggagtggtc 540
aacgaccgcc ccgaccgccc gcagcgcgga ctgaacctcg acatcgcccg caagcactac 600
agcgcggagt ggatagagga ccgcatacgg gagatgggcg acctcaagct caaccagctc 660
ggcctgcact tctccgacga ccaggcgttc cggatcgagt ccaagaccca ccccgaggtg 720
gtctcggacg aggccctgac ccaggacgag gtccgccgta tcgtcgggct cgccaacagc 780
ctgcacatcg aggtcgtccc cgagatcgac tcgcccggac acctcggcgc ggtgctgcgc 840
gcccaccccg atctccagct ccgcaacacc cagggccggg agtcgcgcgg ctccatcgac 900
atctccaagc cgggggcggc gaagctgatc gacgagctgc tcgacgagta caccgacctg 960
ttcccgggga agttctggca cctgggcgcc gacgagtacc aggcgctgat ggtccgcgac 1020
ccggccgcct cctacccgca gctccagcgc gccgccgagc agaagcacgg ctccggcgcc 1080
acgatcgagg acctcgccac cggctggctc aacgaccggg cggcggtggt ggagcccaag 1140
ggccgcaccg ccaaggcgtg gaacgacggc ctcttccggg acacgaaggt cgtcgcggac 1200
aagaacatcg agatcgagta ctggaccggc aaggagatcg gcgcccggcc cccgcaggag 1260
tacctggcgg ccggctacaa gatgctcaac ctcaacgacg agttcctcta ctacgtgctc 1320
ggcgagccga acgagttcgt ctacccgacc ggcaagcgga tctacgagca gtggaccccg 1380
atggtgctgc gcggcaccga gccggtggcg gcccgctact cgccgcagat cctcggcggc 1440
cggttcgcgg tctggggcga cctccccaac gcgcagacgg tacagcaggt cgcggacggc 1500
atcaggatgc cgctcgtggc gacctcgcag aagctgtggg acccgcggga gccggagctg 1560
acctgggacc agttccagga gctggcggcc cggacgggca gcgcgggctg a 1611
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aagcttgcgg ccgcactcga g 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggatccgcga cccatttgct gtcc 24
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
agcaaatggg tcgcggatcc atgtcgccca cgcgaggtgc 40
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agtgcggccg caagcttgcc cgcgctgccc gtc 33

Claims (10)

1.N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure FDA0003440331810000011
其中，所述R1、R2独立地为脂肪酸形成的酰基；所述脂肪酸选自短链脂肪酸、中链脂肪酸或长链脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯，其特征在于：所述脂肪酸选自己酸、月桂酸、棕榈酸、二十二碳六烯酸乙酯。
3.权利要求1或2所述的N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550的作用下，甘油与N-乙酰氨基葡萄糖逆水解合成N-乙酰氨基葡萄糖基甘油；
所述N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)在脂肪酶的作用下，糖基甘油与脂肪酸进行酰化反应，合成N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体如下：将甘油和N-乙酰氨基葡萄糖加入水中，混匀，加入N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，在40～60℃温度下，反应12～36h；其中，甘油与N-乙酰氨基葡萄糖的质量比为2～12:1，水与N-乙酰氨基葡萄糖的用量比为4～10:1；
和/或：所述步骤(2)中，所述脂肪酶选自固定化脂肪酶Novozyme 435；
和/或：所述步骤(2)中，所述脂肪酸选自己酸、月桂酸、棕榈酸、二十二碳六烯酸乙酯。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的用量为：5～30U/g N-乙酰氨基葡萄糖；
和/或：反应时控制pH值在4.6～6.6；
和/或：反应条件为：在50℃下反应24h。
6.权利要求1或2所述的N-乙酰氨基葡萄糖基甘油酯在作为/制备补充多不饱和脂肪酸的膳食补充剂中的应用，或在制备药物中的应用。
7.N-乙酰氨基葡萄糖基甘油，其结构式如式Ⅰ所示，其中，R1＝R2＝H。
8.一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
9.编码权利要求8所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
10.权利要求8所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶SbNag2550在催化N-乙酰氨基葡萄糖与甘油合成N-乙酰氨基葡萄糖基甘油中的应用。
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