CN102121017A - 水稻温敏雄性不育基因、其编码蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水稻温敏雄性不育基因、其编码蛋白及其应用。该基因具有下列核苷酸序列之一：1.具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列，2.与SEQIDNO3所示的拟南芥基因的碱基序列的同源性最高，期望值达到1.8e-27，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。本发明的基因OsATMS1的转录表达具有对环境温度敏感的特性，能够使植物雄性育性具备温敏特征，预示着它在作物杂交育种以及产量提高方面的应用价值。

Description

水稻温敏雄性不育基因、其编码蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种水稻温敏雄性不育基因、其编码蛋白及其应用。

背景技术

杂交育种技术: 雄性不育是植物界非常普遍的现象，受内、外源多种因素控制和影响。由于雄性不育品种为农业生产上异花授粉提供了极大的便利，所以成为杂交育种和生产的基础。上世纪70年代，以袁隆平为代表的我国一批水稻育种学家在细胞质雄性不育野败系基础上，相继育种成功恢复系和保持系，创建了所谓杂交育种三系法（不育系，恢复系和保持系），至今基于三系法的杂交水稻单在我国已播种5亿公顷，增加水稻产量20%以上，为我国的粮食安全做出巨大贡献。三系法虽然功勋卓著，然而其基因型单一，同时细胞质雄性不育来源于线粒体或者叶绿体发育的缺陷，在一定的遗传背景下可能会引发植物整体上生长和适应力上的隐患。与三系法相比，基于核基因突变的光敏雄性不育或者温敏雄性不育的两系法杂交稻种子生产的程序简化，种子成本低，基因型配套多样，有利于推广，因此光敏、尤其以温敏为主的核不育水稻目前已成为我国超级杂交稻的雄性不育系的主力。

但是，尽管在应用上以温敏雄性不育系为代表的对外界环境因素敏感的条件型雄性不育系列已经崭露头角，但和原先的三系法比较，因为这类雄性不育特性的不稳定，在出现反常低温，或者高温的情况下育性会有一定程度的恢复，因此，这类雄性不育系列的使用受气候条件的制约大，也因此严重限制了应用的范围。解决这个问题的根本出路在于从基因水平了解温敏雄性不育的遗传学机制，明晰其育性随外界条件变化的特性，从而因地制宜地选择合适的基因型雄性不育品种；或者根据这类基因编码蛋白，比如酶类的理化特点，在出现育性恢复的反常天气时，能够针对性地采取相应手段，比如使用酶类化学抑制剂抑制其蛋白活性，从而抑制不育系恢复育性。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种十字花科的小型野草，早在16世纪被发现，19世纪末，科学家就注意到了它的研究价值。它是国际上第一个完成全部基因组序列测定的高等植物，其研究成果对于其它高等植物包括农作物的研究，产生了重大的影响，因此拟南芥的研究越来越受到国际植物学界及各国政府的重视。通过对拟南芥基因组的研究，推动了许多其它植物相关基因的研究，尤其是推动经济作物中相关基因的研究，给人类带来巨大的经济效益。我们实验室目前克隆鉴定了一个对环境温度敏感的雄性不育突变体atms1，发现控制表型的基因ATMS1编码一种脂酰辅酶A合成酶。

水稻中，脂酰辅酶A合成酶构成一个大家族，其中，只有OsATMS1基因（LOC_Os04g24530）在花药中特异表达，而且编码的蛋白与拟南芥花药特异基因ATMS1高度同源。通过对拟南芥ATMS1基因功能的研究，以及通过比较基因组学的手段，证明水稻OsATMS1是拟南芥ATMS1的同源基因。它们的蛋白同源性在97%的保守区域内达到76.4%， 基因表达模式十分相近，所以，我们认为OsATMS1与ATMS1在功能上也十分相近。最重要的是OsATMS1基因的转录表达对环境温度高度敏感，有望将该基因进行功能修饰后选育水稻温敏雄性不育系。因此，水稻OsATMS1的克隆及功能鉴定对于提高我国水稻产量以及简化杂交稻种子生产程序都有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了一个水稻温敏雄性不育基因，该基因是从水稻中分离出来的一个DNA分子，称为OsATMS1。

本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供该基因在水稻两系法育种中的应用。

为达到以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种水稻温敏雄性不育基因，其特征在于，该基因具有下列核苷酸序列之一：

1)      具有SEQ ID NO 1 所示的碱基序列；

2)      与SEQ ID NO 1 所示的碱基序列具有很高的同源性，期望值达到1.8e-27，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。

一种根据上述的水稻温敏雄性不育基因，其特征在于该蛋白具有下列氨基酸序列之一：

1)      具有SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列；

2)      通过将SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 2的蛋白具有相同的生物学功能。

一种上述的基因在控制水稻雄性育性中的作用。

一种上述的基因在水稻两系法育种中的应用。

一个获得上述基因的方法，该方法的具体步骤为：利用Rice Genome Annotation Project网站所提供的BLAST软件比对该网站的基因数据库后，得到与ATMS1同源性最高的水稻基因OsATMS1,其Gene ID为LOC_Os04g24530，进而得到该基因的碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列。

本发明的基因OsATMS1的转录表达具有对环境温度敏感的特性，能够使植物雄性育性具备温敏特征，预示着它在作物杂交育种以及产量提高方面的应用价值。

附图说明

图1为本发明的基因OsATMS1编码的蛋白的结构图，图中该蛋白的398位的甘氨酸在其催化功能中起着重要的作用；

图2为本发明的基因OsATMS1编码的蛋白的进化分析图，表明该编码蛋白与拟南芥ATMS1基因编码蛋白同属于脂酰辅酶A合成酶家族，二者在进化上很接近；

图3为本发明的基因OsATMS1基因在不同温度下的转录表达的RT-PCR检测：Actin是总cDNA水平的对照。

具体实施方式

下面结合具体实施，进一步阐明本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.）中所述条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：OsATMS1基因的获得：利用Rice Genome Annotation Project网站所提供的BLAST软件比对该网站的基因数据库后，得到与ATMS1同源性最高的水稻基因OsATMS1,其Gene ID为LOC_Os04g24530，进而得到该基因的碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列。

实施例二：生物信息学方法分析OsATMS1基因及其蛋白的结构：经RGAP 6.1的BLAST分析，水稻OsATMS1基因与拟南芥ATMS1基因的同源性很高，期望值达到1.8e-27。从Rice Genome Annotation Project得到其蛋白序列，经Vector NTI 9.1.0软件分析显示：该蛋白含有555个氨基酸，蛋白分子量大小约为59.4kDa，等电点为5.69。利用CN3D 4.1软件对OsATMS1基因编码的蛋白的三维结构分析表明，该蛋白含有四香豆酸辅酶A连接酶结构域和乙酰蛋白合成酶结构域，这是脂酰辅酶A合成酶均具备的特征，表明该蛋白是脂酰辅酶A合成酶，参见图1。进化分析表明，OsATMS1基因编码的蛋白属于脂酰辅酶A合成酶ACOS家族，参见图2。

实施例三：OsATMS1基因温敏特性的检测与分析：先在人工光照培养室20℃和30℃处理水稻，后采用传统的苯酚：氯仿：异戊醇、醋酸钠层析和异丙醇沉淀的方法提取处理后水稻花序的总RNA，然后利用Invitrogen公司的M-MLV First Strand Kit（cat no. c28025-032, lot no. 8210069）反转录出cDNA，根据目的基因内含子两端序列，在1117和1772位点处设计如下所示的上下游引物，PCR扩增后通过琼脂糖凝胶电泳技术检测。

Sense primer: TTCATCCTGCCGAACCTG

Anti-sense primer: ACGCCACTATCTCCTCCT

电泳结果表明：水稻中OsATMS1在20℃的转录表达比30℃高，参见图3。图中显示，20℃下用于检测的总cDNA模板数量要少于30℃下的总cDNA数量，而从中检测到的OsATMS1水平却显著高于30℃下的水平，意味着低温20℃下OsATMS1的表达显著高于高温30℃下的表达水平，所以，OsATMS1的转录表达具有温敏特性。

序 列 表

<110>  上海大学

<120>  水稻温敏雄性不育基因、其编码蛋白及其应用

<160>  2

 

<210>  1

<211>  1667

<212>  DNA

<213>  水稻

<400>  1

ATGGG CGACG CCGCG GTACC CGCCA TGGTG GTGGA GGAGG AGGAA CAGGA GCACG TGTTC      60

CGGAG CAGGT TCCCG CCGGT GGCCG TGCCG GACGG CGTCA CCGTG CCGGA GTTCG TGCTG      120

GACGG CGCCG AGGCC TACGC CGACA GGGTG GCGCT CGTGG AGGCC GCGGC GGGCG GGCGG      180

TCGTA CACGT ACGGC GAGGT GGCGC GCGAC ACGGC GCGGT TCGCC AGGGC GCTCC GGTCG      240

GTGGG CGTCC GGAAG GGGCA CGTCG TCGTC GTCGC GCTCC CAAAC CTCGC CGTGT ACCCC      300

GTCGT GTCGC TCGGG ATCAT GTCGG CGGGG GCCGT GTTCT CCGGC GTGAA CCCGC GCGCG      360

CTCGC CGCGG AGATC AAGAA GCAGG TGGAG GACTC CGAGG CGAAG CTGGT CGTTG CCAAC      420

GAGGT CGCGT TCGAC AAGGT GAAGG ACGCC GGCGT GCCGG TGATC GGCGT CGGCG ACAGG      480

GAGCG GATGC CTGGG GCGAT CAGCT GGGAC GGGCT CCTCG CCGCG GCGGA CCGCA CCGGC      540

GCCGG GGTGG TGCCG GTGGA CGCGG CGCAG CAGTC CGACC TGTGC GCGCT CCCCT ACTCC      600

TCCGG CACCA CCGGC GTGTC CAAGG GCGTG ATGCT GAGCC ACCGC AACCT GGTGT CCAAC      660

CTCTG CTCGT CCATG TTCGC CGTGG CGCCG GAGAC GGCCG GGCAG GTGGT GACGC TGGGG      720

CTCAT GCCGT TCTTC CACAT CTACG GCATC ACCGG CATCT GCTGC GCCAC GCTCC GGCAC      780

AAGGG CACGG TGGTG GTGAT GGACC GCTTC GACCT CCGCA CGTTC CTCCG TGCGC TCGTC      840

GACCA CCGCG TCATG TTCGC GCCGC TGGTT CCCCC CGTGA TGCTC GCCAT GGTCA AGAGC      900

CCCGT CGCCG ACGAG TTCGA CCTCT CCGAC CTCGC CCTCA AGTCC GTCAT GACCG CCGCC      960

GCGCC GCTCG CCCCC GACCT CCTCG CCGCG TTCCA GCGCA AGTTC CCCGG CGTGC AGGTG     1020

GAGGA AGCCT ACGGC CTCAC CGAGC ACAGC TGCAT CACCC TCACG CACGC CGCCG GCGAC     1080

GGCCA CGGCC ACGTC GCCAA GAAGA GCTCG GTGGG GTTCA TCCTG CCGAA CCTGA GGTGA     1140

AGTTC GTGGA CCCGG ACACC GGGAG GTCGC TGCCG GCGAA CACGC CGGGG GAGCT GTGCG     1200

TGCGG AGCCA GAGCG TGATG CAGGG GTACT ACAAG AGGAA GGAGG AGACG GAGCG CACGG     1260

TGGAC GGCAA GGGGT GGCTG CACAC CGGCG ACGTT GGGTA CATCG ACGGC GACGG CGACG     1320

TGTTC ATCGT GGACA GGATC AAGGA GCTGA TCAAG TACAA GGGGT TTCAG GTCGC CCCCG     1380

CCGAG CTCGA GGCCG TCCTC CTCTC CCACC CCTCC GTTGA GGACG CCGCC GTCTT CGGGG     1440

TGCCG GACGA GGAGG CCGGC GAGGT GCCGG TGGCG TGCGT GGTGC GGCGG CACGG TGCGG     1500

AGGAG GGGGA GGAGG AGATA GTGGC GTACG TGGCG GAGAG GGTGG CGTCG TACAA GCGGG     1560

TCCGG GTGCT GCACA TCGTC GACGC CATCC CCAAG TCGGT GTCCG GGAAG ATCCT GAGGA     1620

GGCAG CTTAG GGACG AGTTC ATCAA GAGGA TGAAA CCGTC AGCTT GA                    1667

 

<210>  2

<211>  537

<212>  PRT

<213>  水稻

<400>  2

MGDAA VPAMV VEEEE QEHVF RSRFP PVAVP DGVTV PEFVL DGAEA YADRV ALVEA AAGGR      60

SYTYG EVARD TARFA RALRS VGVRK GHVVV VALPN LAVYP VVSLG IMSAG AVFSG VNPRA      120

LAAEI KKQVE DSEAK LVVAN EVAFD KVKDA GVPVI GVGDR ERMPG AISWD GLLAA ADRTG      180

AGVVP VDAAQ QSDLC ALPYS SGTTG VSKGV MLSHR NLVSN LCSSM FAVAP ETAGQ VVTLG      240

LMPFF HIYGI TGICC ATLRH KGTVV VMDRF DLRTF LRALV DHRVM FAPLV PPVML AMVKS      300

PVADE FDLSD LALKS VMTAA APLAP DLLAA FQRKF PGVQV EEAYG LTEHS CITLT HAAGD      360

GHGHV AKKSS VGFIL PNLEV KFVDP DTGRS LPANT PGELC VRSQS VMQGY YKRKE ETERT      420

VDGKG WLHTG DVGYI DGDGD VFIVD RIKEL IKYKG FQVAP AELEA VLLSH PSVED AAVFG      480

VPDEE AGEVP VACVV RRHGA EEGEE EIVAY VAERV ASYKR VRVLH IVDAI PKSVS GKILR      520

RQLRD EFIKR MKPSA                                                             537

 

<210>  3

<211>  1629

<212>  DNA

<213>  拟南芥

<400>  3

ATGGAGAGTCAAAAGCAAGAAGATAATGAATACATTTTCCGCAGTTTGTATCCATCTGTGCCCATTCCTGACAAACTTACACTGCCTGAATTTGTGCTCCAAGGAGTTGAAGAATACACAGAGAATGTAGCGTTTGTAGAAGCGGTGACCGGAAAAGCTGTGACGTACGGTGATGTAGTGAGGGACACAAAGAGGCTAGCCAAAGCGTTGACATCTCTCGGACTAAGGAAAGGTCAAGTGATGGTTGTGGTCCTACCAAACGTCGCCGAGTATGGGATTATTGCCCTTGGTATTATGTCTGCCGGTGGAGTCTTCTCCGGTGCAAATCCGACGGCTCTTGTTTCCGAGATCAAGAAGCAAGTTGAAGCTTCCGGTGCTAGAGGAATCATCACTGATGCTACTAACTATGAAAAGGTGAAATCACTAGGTTTACCGGTGATAGTGTTAGGTGAAGAGAAGATAGAAGGAGCAGTAAACTGGAAAGATCTTCTAGAAGCAGGAGACAAATGCGGAGATACCGACAATGAAGAGATTCTTCAGACAGATCTTTGTGCACTTCCTTTTTCTTCAGGAACAACAGGATTACAAAAAGGAGTAATGCTCACACATCGCAATCTCATAGCCAATCTTTGCTCTACTCTCTTCGGTGTCAGGTCTGAAATGATCGGTCAGATCGTGACGCTTGGTTTGATCCCATTCTTTCATATTTACGGTATCGTTGGCATATGTTGTGCTACAATGAAGAATAAAGGCAAAGTTGTTGCTATGAGTCGGTACGATCTAAGGATTTTCTTGAATGCTTTGATTGCTCATGAGGTTTCGTTTGCGCCTATAGTTCCGCCGATTATATTGAATCTTGTTAAGAATCCGATAGTTGATGAGTTTGATCTTTCGAAGCTTAAACTTCAGTCTGTCATGACTGCTGCTGCTCCTTTAGCTCCTGAGCTTCTTACTGCCTTCGAAGCCAAGTTTCCTAATGTCCAAGTCCAAGAGGCTTATGGATTAACGGAGCATAGTTGCATTACGTTAACTCACGGAGATCCAGAGAAAGGACAAGGAATCGCGAAACGAAACTCGGTTGGTTTCATACTTCCGAATCTCGAGGTAAAGTTCATAGATCCTGACACCGGTAGATCACTCCCGAAGAACACTTCTGGTGAGCTATGTGTGAGGAGCCAATGTGTAATGCAAGGTTACTTCATGAACAAGGAAGAGACTGACAAGACAATTGATGAACAAGGTTGGCTTCACACAGGAGACATAGGTTACATCGATGATGATGGAGACATCTTCATCGTTGATCGTATCAAAGAACTTATTAAATACAAAGGTTTTCAGGTTGCTCCGGCCGAGCTTGAAGCTATTCTACTCACTCATCCATCCGTTGAAGACGTTGCCGTCGTGCCGTTACCGGACGAGGAAGCCGGGGAGATTCCGGCGGCTTGCGTGGTGATAAATCCGAAAGCGACAGAAAAGGAAGAAGACATTCTCAACTTTGTTGCAGCAAATGTGGCTCATTACAAGAAGGTTAGAGCCGTCCATTTTGTGGATTCAATCCCTAAATCTCTCTCTGGTAAAATCATGAGGAGGCTTCTTAGAGACAAGATCCTCAGCATCAACAAGAAGTAG

 

<210>  4

<211>  542

<212>  PRT

<213>  拟南芥

<400>  4

MESQKQEDNEYIFRSLYPSVPIPDKLTLPEFVLQGVEEYTENVAFVEAVTGKAVTYGDVVRDTKRLAKALTSLGLRKGQVMVVVLPNVAEYGIIALGIMSAGGVFSGANPTALVSEIKKQVEASGARGIITDATNYEKVKSLGLPVIVLGEEKIEGAVNWKDLLEAGDKCGDTDNEEILQTDLCALPFSSGTTGLQKGVMLTHRNLIANLCSTLFGVRSEMIGQIVTLGLIPFFHIYGIVGICCATMKNKGKVVAMSRYDLRIFLNALIAHEVSFAPIVPPIILNLVKNPIVDEFDLSKLKLQSVMTAAAPLAPELLTAFEAKFPNVQVQEAYGLTEHSCITLTHGDPEKGQGIAKRNSVGFILPNLEVKFIDPDTGRSLPKNTSGELCVRSQCVMQDYFMNKEETDKTIDEQGWLHTGDIGYIDDDGDIFIVDRIKELIKYKGFQVAPAELEAILLTHPSVEDVAVVPLPDEEAGEIPAACVVINPKATEKEEDILNFVAANVAHYKKVRAVHFVDSIPKSLSGKIMRRLLRDKILSINKK。

Claims (5)

1.一种水稻温敏雄性不育基因，其特征在于，该基因具有下列核苷酸序列之一：

a.具有SEQ ID NO 1 所示的碱基序列；

b.与SEQ ID NO 1 所示的拟南芥基因的碱基序列的同源性最高，期望值达到1.8e-27，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。

2.一种根据权利要求1所述的水稻温敏雄性不育基因，其特征在于该蛋白具有下列氨基酸序列之一：

a.具有SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列；

b.通过将SEQ ID NO 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 2所示的拟南芥突变蛋白具有相同的生物学功能。

3.一种根据权利要求1所述的基因在控制水稻雄性育性中的作用。

4.一种根据权利要求1所述的基因在水稻两系法育种中的应用。

5.一种获得根据权利要求1所述的基因的方法，该方法的具体步骤为：利用Rice Genome Annotation Project网站所提供的BLAST软件比对该网站的基因数据库后，得到与ATMS1同源性最高的水稻基因OsATMS1,其Gene ID为LOC_Os04g24530，进而得到该基因的碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列。

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