CN114216886B - 一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法及应用，该方法选用104spores/mL的三七圆斑病菌分生孢子悬浮液喷洒接种植物叶片，分别取接种后0h、6h、12h、24h、48h和96h的植物叶片样品，并将一个叶片切成若干小块，取一块载玻片，用移液枪吸取卡尔科弗卢尔荧光增白剂点滴到载玻片上，再分别取相同量的10％的KOH溶液点滴到卡尔科弗卢尔荧光增白剂液滴上，将小块叶片正面朝下放于卡尔科弗卢尔荧光增白剂和KOH的混合液的液面上，在放有叶片的载玻片上，放上另外一个载玻片，用回形针将两个玻片固定在一起，静置放置1min，用倒置荧光显微镜在10×10倍和10×20倍镜下进行观察，该方法可用于观察真菌分生孢子在寄主植物叶部表面的萌发至侵入过程。

Description

一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法及应用
技术领域
本发明涉及真菌侵染叶片的观察方法，具体是指一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法及应用。
背景技术
植物叶部病害的研究是植物病理学非常重要的组成部分，植物叶部一旦生病，会严重影响植株的光合作用，物质积累和品质产量等。特别对于农作物来说，部分严重的叶部病害可能会导致作物大面积减产甚至绝收。因此对植物叶部病害的研究一直是植物病理学研究的重点，研究内容主要包括病原菌的发生发展、传播规律和防治方法等。特别是当病原孢子传播到叶片上之后的萌发，生长和侵入时间规律是研究植物病害的首要步骤，这可为后期的深入研究以及探索病害的防治方法提供重要的基础数据；
对于植物叶部真菌病害分生孢子侵染过程的研究，传统的研究方法有很多，但总体上包括样品接种，取样固定，脱色，染色和制片观察等步骤，也有通过转入绿色荧光蛋白菌株不经染色直接观察的方法，传统研究植物叶部病原真菌侵染植物叶片的方法未能完全观察到病原孢子在叶片表面的整个发育过程，往往只能观察到某一时间点的侵染状态，而无法对分生孢子悬浮液接种到叶片上之后一直到新的孢子产生的整个循环过程进行观察；传统研究方法需要对叶片组织进行固定和脱色，在这个过程很容易将侵染前期未侵入到植物细胞内部的分生孢子洗掉，观察不到前期分生孢子的发育情况；传统研究方法在固定和脱色过程中会用到三氯乙酸、氯仿和水和氯酸等有毒试剂，影响操作人员健康；传统研究方法用显微镜观察叶子表面，由于叶表不平整致使拍照视野不在一个平面上，造成拍照不清晰模糊等现象；此外传统研究方法从取样，固定，脱色和最后在显微镜下观察至少需要1天以上时间，耗时过长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述技术的缺陷，提供一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法，包括以下步骤：
步骤1)接种：选用104spores/mL的三七圆斑病菌分生孢子悬浮液喷洒接种植物叶片；
步骤2)取样：分别取接种后0h、6h、12h、24h、48h和96h的植物叶片样品，并将一个叶片切成若干小块；
步骤3)染色：取一块载玻片放在实验桌上，用移液枪吸取卡尔科弗卢尔荧光增白剂(CalcofluorWhite Stain)点滴到载玻片上，再分别取相同量的10％的KOH溶液点滴到卡尔科弗卢尔荧光增白剂液滴上，然后取步骤2中小块叶片正面朝下放于卡尔科弗卢尔荧光增白剂和KOH的混合液的液面上；
步骤4)制片：在步骤3中所得放有叶片的载玻片上，放上另外一个载玻片，然后用回形针将两个玻片固定在一起，静置放置1min；
步骤5)显微镜观察：用倒置荧光显微镜在10×10倍和10×20倍镜下进行观察。
作为改进，所述步骤1中所选的病菌为三七圆斑病的病原菌分生孢子。
作为改进，所述步骤2中将叶片切割成5mm×5mm的平整小块，切割时需避开叶脉。
作为改进，所述步骤3中移液枪每次吸取的量为5μl，在载玻片上滴加6滴卡尔科弗卢尔荧光增白剂，均匀的分布在载玻片上。
作为改进，所述步骤3中每次吸取10％的KOH溶液的量为5μl，总计取用6滴10％的KOH溶液，采用点滴的方法，将其分别滴到卡尔科弗卢尔荧光增白剂液滴上。
作为改进，所述步骤3中选小块叶片的数量为6个。
作为改进，所述步骤4中两个载玻片需充分贴合，且使小块叶片下面无气泡，采用回形针将两个玻片固定连接。
作为改进，所述步骤5中需要用荧光倒置显微镜观察，观察调节为在紫外光下，观察时间控制在0.5h内。
本发明同时还提供上述方法在观察真菌分生孢子在寄主植物叶部表面的萌发至侵入过程中的应用。
本发明与现有技术相比的优点在于：本发明提供了一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法，包括荧光染色及制片方法，与现有技术相比，首先本发明不需要对叶片组织进行脱色就可以获得分生孢子和背景叶片良好的对比效果，节约了大量时间，可以做到随制随用；其次运用本方法可以观察到分生孢子从接触叶片到侵入叶子的整个过程，而不仅仅只观察到某一个阶段；此外本发明提供的方法不仅可用于观察三七圆斑病，其他通过分生孢子传播的植物叶部真菌病害，也可以运用本发明提供的方法进行观察本发明操作步骤简单，染色效果好，通用性强，在植物病理学研究领域具有很好的应用前景。
附图说明
图1是本发明一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法及应用的真菌孢子萌发和入侵观察图；
其中：A-接种后0h；B-接种后6h；C-接种后12h；
图2是本发明一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法及应用的真菌菌丝入侵后在叶表的生长情况观察图；
其中：D-接种后24h；E-接种后48h；F-接种后96h。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法及应用做进一步的详细说明。
实施例1
首先采集三七圆斑病的病样带回实验室运用组织分离法分离病原菌，将纯化后的病原菌进行水培诱导产生分生孢子，然后收集分生孢子制成浓度为104spores/mL的分生孢子悬浮液；
准备10棵植株大小一致的一年生三七，用无菌水将叶片冲洗干净，之后将分生孢子悬浮液均匀的喷洒到三七叶面上，喷洒完后马上取3片三七叶片，切割成6片5mm×5mm平整的小块；
取一块载玻片放在实验桌上，用移液枪吸取5μl卡尔科弗卢尔荧光增白剂(CalcofluorWhiteStain)点滴到载玻片上，一共取6滴，再分六次取用6滴10％的KOH溶液，采用点滴的方法，将其分别滴到卡尔科弗卢尔荧光增白剂液滴上；
分别取6块5mm×5mm的叶片正面朝下盖在刚才的卡尔科弗卢尔荧光增白剂和KOH的混合液上，然后马上用另外一个载玻片压在放有植物叶片的载玻片上，并用回形针将两个载玻片压在一起，放置1min后马上放到倒置荧光显微镜下观察，选取合适的视野进行拍照，之后分别在接种后的0h、6h、12h、24h、48h、96h进行取样，分别采用上述方法进行荧光染色、制片、观察及拍照；
接种后0h，可在荧光显微镜下观察到尚未萌发的槭菌刺孢分生孢子(见图1A)；
接种后6h，可见分生孢子开始萌发(见图1B)；
接种后12h，附着孢在萌发的菌丝末端已经形成(见图1C)；
接种后24h，萌发的菌丝在叶面上扩展，附着孢子下面形成侵染钉，侵入三七叶片内部(见图2D)；
接种后48h菌丝已经入侵到叶片内部，叶表的菌丝继续扩张伸长，形成更多的附着孢和侵染钉来侵入三七叶内部(见图2E)；
接种后96h，被侵染的三七叶子病斑部位叶肉细胞内的菌丝体进一步生长发育穿透植物叶片细胞组织分化形成直立短柄状的分生孢子梗，分生孢子梗上长出更多的分生孢子，自此从接种到发病，再到病斑上长出新的分生孢子，标志着整个发病过程结束，产生新的分生孢子再通过雨水飞溅等传播途径开始新的一轮发病过程(见图2F)。
此外本发明提供的方法不仅可用于观察三七圆斑病，其他通过分生孢子传播的植物叶部真菌病害，也可以运用本发明提供的方法进行观察，本发明操作步骤简单，染色效果好，通用性强，在植物病理学研究领域具有很好的应用前景。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)接种：选用104spores/mL的三七圆斑病菌分生孢子悬浮液喷洒接种植物叶片；
步骤2)取样：分别取接种后0h、6h、12h、24h、48h和96h的植物叶片样品，并将一个叶片切成若干小块；
步骤3)染色：取一块载玻片放在实验桌上，用移液枪吸取卡尔科弗卢尔荧光增白剂(CalcofluorWhite Stain)点滴到载玻片上，再分别取相同量的10％的KOH溶液点滴到卡尔科弗卢尔荧光增白剂液滴上，然后取步骤2中小块叶片正面朝下放于卡尔科弗卢尔荧光增白剂和KOH的混合液的液面上；
步骤4)制片：在步骤3中所得放有叶片的载玻片上，放上另外一个载玻片，然后用回形针将两个玻片固定在一起，静置放置1min；
步骤5)显微镜观察：用倒置荧光显微镜在10×10倍和10×20倍镜下进行观察。
2.根据权利要求1所述的一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法，其特征在于：所述步骤1中所选的病菌为三七圆斑病的病原菌分生孢子。
3.根据权利要求1所述的一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法，其特征在于：所述步骤2中将叶片切割成5mm×5mm的平整小块，切割时需避开叶脉。
4.根据权利要求1所述的一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法，其特征在于：所述步骤3中移液枪每次吸取的量为5μl，在载玻片上滴加6滴卡尔科弗卢尔荧光增白剂，均匀的分布在载玻片上。
5.根据权利要求1所述的一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法，其特征在于：所述步骤3中每次吸取10％的KOH溶液的量为5μl，总计取用6滴10％的KOH溶液，采用点滴的方法，将其分别滴到卡尔科弗卢尔荧光增白剂液滴上。
6.根据权利要求1所述的一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法，其特征在于：所述步骤3中选小块叶片的数量为6个。
7.根据权利要求1所述的一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法，其特征在于：所述步骤4中两个载玻片需充分贴合，且使小块叶片下面无气泡，采用回形针将两个玻片固定连接。
8.根据权利要求1所述的一种观察植物病原真菌侵染叶片的方法，其特征在于：所述步骤5中需要用荧光倒置显微镜观察，观察调节为在紫外光下，观察时间控制在0.5h内。
9.权利要求1所述方法在观察真菌分生孢子在寄主植物叶部表面的萌发至侵入过程中的应用。
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