CN114213865A - 一种纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素的方法。本发明方法，包括如下步骤：(1)将梯棱羊肚菌子实体粉碎后溶于水中，加入纤维素酶进行酶解；(2)对酶解后的体系进行超声处理；(3)在超声处理后的体系中加入碱进行碱提，碱提结束后离心，收集上清液，得到黑色素提取液；加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到黑色素粗品；(4)将黑色素粗品溶于水中，加入蛋白酶进行水解以去除蛋白质，然后去除油脂；加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到梯棱羊肚菌黑色素。本发明通过单因素试验、PB试验和响应面法得出了梯棱羊肚菌黑色素的最佳提取工艺，并以黑色素得率和蛋白质含量为指标，筛选出最优除蛋白方法。

Description

一种纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素的方法

技术领域

本发明涉及一种黑色素的提取方法，尤其涉及一种纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素的方法，属于食用菌深加工技术领域。

背景技术

羊肚菌俗称羊雀菌、蜂窝磨或羊肚，隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellacea)、羊肚菌属(Morchella)。羊肚菌按照子实体颜色大致分为3个支系，分别为变红羊肚菌、黄羊肚菌、黑羊肚菌。梯棱羊肚菌(Morchella importuna)属于黑羊肚菌支系中的一种。梯棱羊肚菌(M.importuna)富含多种人体所需要的氨基酸、多糖、黑色素、皂苷类、酮、醛、酯等活性物质，其营养价值丰富，有明显的抗癌、补脑、增强人体免疫力的作用，且是我国人工栽培的主要品系。

黑色素是一种常见的生物色素，是吲哚类和酚类聚合而成的生物大分子，易与蛋白质、油脂和多糖类结合，不溶于水、酸性溶液及大多数有机溶剂。天然黑色素来源广泛，动物、植物以及微生物中均有黑色素的相关研究报道。黑色素具有抗肿瘤、抗辐射、提高免疫力等生理活性，因此黑色素在医药、化妆品、生物材料等方面的应用价值不言而喻。

目前大部分羊肚菌的加工方式以干制等初加工方式为主。对羊肚菌的深加工多集中在多糖，对其黑色素相关研究还非常少。羊肚菌在干制过程中会产生一些残次品和破损的下脚料，对其充分加工利用可进一步提高羊肚菌的附加值。由于黑色素具有易溶于碱，在酸性条件下会形成沉淀的特性，碱溶酸沉法是黑色素提取常用的方法。但在试验过程中，使用传统的碱溶酸沉法所需时间长，效率低。此外，由于黑色素易与蛋白质、油脂和多糖类结合，以及其异质性和不均一性，导致黑色素在纯化时难度较大。黑色素的提取方法根据黑色素的种类、来源、产生部位、含量多少以及其杂质含量而定。如何对梯棱羊肚菌中的黑色素进行提取纯化，以实现羊肚菌黑色的提取开发，是当前需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素的方法。

本发明提供的一种梯棱羊肚菌黑色素的提取方法，包括如下步骤：

(1)将梯棱羊肚菌子实体粉碎后溶于水中，加入纤维素酶进行酶解；

(2)对步骤(1)酶解后的体系进行超声处理；

(3)在步骤(2)超声处理后的体系中加入碱进行碱提，碱提结束后离心，收集上清液，得到黑色素提取液；在所述黑色素提取液中加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到梯棱羊肚菌黑色素粗品；

(4)将步骤(3)得到的梯棱羊肚菌黑色素粗品溶于水中，加入蛋白酶进行酶解以去除蛋白质，调节体系pH至碱性，然后去除油脂；在去除蛋白和油脂的体系中加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到所述梯棱羊肚菌黑色素。

本发明中，通过单因素试验、PB试验和响应面法从而得出梯棱羊肚菌黑色素的最佳提取工艺如下：

步骤(1)中，所述纤维素酶与所述梯棱羊肚菌子实体的质量比为20mg：1g；所述纤维素酶酶解的温度为40℃；所述纤维素酶酶解的时间为78.6min；

步骤(2)中，所述超声的功率为200W，时间为80min；

步骤(3)中，以在步骤(2)超声处理后的体系中加入碱后形成的体系为碱提体系；所述碱在所述碱提体系中的浓度为1.54mol/L；所述梯棱羊肚菌子实体与所述碱提体系的料液比为1g：30mL。所述碱具体可为NaOH。

在上述最佳工艺下，黑色素的得率为10.003％，色价为480.24。

上述的提取方法，步骤(3)中，所述加入酸性试剂步骤中调节体系pH至1～2。

所述酸沉的温度为80℃，时间为10h。

本发明中，以黑色素得率和蛋白质含量为指标，通过比较不同除蛋白方法，筛选最优除蛋白方法如下：

步骤(4)中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。

进一步地，所述碱性蛋白酶与所述梯棱羊肚菌黑色素粗品的比例为400000u：1g；

所述酶解的温度可为40～50℃，具体可为45℃；pH可为9.0～12.0，具体可为10.5；时间可为1h；

所述调节体系pH至碱性具体可调节pH至14；

所述去除油脂可使用乙酸乙酯。

本发明进一步提供上述任一项所述的提取方法提取得到的梯棱羊肚菌黑色素。

本发明具有如下有益效果：

本发明通过单因素试验、PB试验和响应面法得出了梯棱羊肚菌黑色素的最佳提取工艺，并以黑色素得率和蛋白质含量为指标，通过比较不同除蛋白方法，筛选出最优除蛋白方法。在最佳工艺下，黑色素得率为10.003％。此外，通过与浸提组(除未添加纤维素酶、未使用超声波辅助外，在试验条件控制等方面与验证组均相同)相比，纤维素酶-超声波协同提取法提取黑色素得率比浸提组黑色素得率提高了85.24％，表明纤维素酶-超声波协同优化法能够有效提高梯棱羊肚菌黑色素得率。

本发明梯棱羊肚菌黑色素的色价为480.24，黑色素纯度较高；梯棱羊肚菌黑色素有较好的热稳定性、光稳定性和碱性稳定性，在氯化钠溶液和蔗糖溶液中也有较好的稳定性，但不宜长时间置于紫外辐射下。金属离子Fe³⁺对梯棱羊肚菌黑色素具有一定的增色作用，其他金属离子Fe²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺对黑色素的稳定性没有显著影响。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同除蛋白方法得到的梯棱羊肚菌黑色素的得率；图1中，不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

图2为本发明实施例1中蛋白质含量测定方法中的蛋白质标准曲线。

图3为本发明实施例1中分别采用氯仿法和碱性蛋白酶法除蛋白得到的梯棱羊肚菌黑色素中蛋白质的含量。

图4为本发明实施例2中不同NaOH溶液浓度的梯棱羊肚菌黑色素得率。

图5为本发明实施例3中不同纤维素酶添加量酶解的梯棱羊肚菌黑色素得率。

图6为本发明实施例4中不同纤维素酶酶解时间的梯棱羊肚菌黑色素得率。

图7为本发明实施例5中不同纤维素酶酶解温度的梯棱羊肚菌黑色素得率。

图8为本发明实施例6中不同料液比的梯棱羊肚菌黑色素得率。

图9为本发明实施例7中不同超声时间的梯棱羊肚菌黑色素得率。

图10为本发明实施例8中NaOH浓度和纤维素酶添加量对黑色素得率影响的响应曲面和等高线图。

图11为本发明实施例8中NaOH浓度和纤维素酶酶解时间对黑色素得率影响的响应面曲线和等高线图。

图12为本发明实施例8中纤维素酶添加量和纤维素酶酶解时间对黑色素得率影响的响应面曲线和等高线图。

图13为本发明实施例9中梯棱羊肚菌黑色素的紫外可见光谱图。

图14为本发明实施例9中梯棱羊肚菌黑色素除杂前扫描电子显微镜图片(A、B)和黑色素除杂后扫描电子显微镜图片(C、D)。

图15为本发明实施例9中pH对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响曲线。

图16为本发明实施例9中氯化钠浓度对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响曲线，不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

图17为本发明实施例9中蔗糖浓度对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响曲线，不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

图18为本发明实施例9中金属离子对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响曲线，不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性的前提下获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

本发明至少一实施例提供一种梯棱羊肚菌黑色素的提取方法，包括如下步骤：

(1)将梯棱羊肚菌子实体粉碎后溶于水中，加入纤维素酶进行酶解；

(2)对步骤(1)酶解后的体系进行超声处理；

(3)在步骤(2)超声处理后的体系中加入碱进行碱提，碱提结束后离心，收集上清液，得到黑色素提取液；在黑色素提取液中加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到梯棱羊肚菌黑色素粗品；

(4)将步骤(3)得到的梯棱羊肚菌黑色素粗品溶于水中，加入蛋白酶进行水解以去除蛋白质，调节体系pH至碱性，然后去除油脂；在去除蛋白和油脂的体系中加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到梯棱羊肚菌黑色素。

通过比较不同除蛋白方法，以黑色素得率和蛋白质含量为指标，筛选最优除蛋白方法进行黑色素的提取。并分别研究了NaOH溶液浓度、纤维素酶添加量、纤维素酶酶解时间、纤维素酶酶解温度、料液比和超声时间对黑色素得率的影响。在单因素试验结果的基础上，通过PB试验和响应面优化，得到黑色素的最佳提取工艺，为羊肚菌黑色的提取开发提供了理论依据；其中，NaOH溶液浓度为在步骤(2)超声处理后的体系中加入NaOH后形成的体系中NaOH的浓度；纤维素酶添加量为纤维素酶与梯棱羊肚菌子实体的质量比；料液比为梯棱羊肚菌子实体的质量与在步骤(2)超声处理后的体系中加入NaOH后形成的体系的体积的比例(g：mL)。

实施例1探究了不同除蛋白方法对提取得率和蛋白质含量的影响；实施例2-实施例7分别探究了不同NaOH溶液浓度、不同纤维素酶添加量、不同纤维素酶酶解时间、不同纤维素酶酶解温度、料液比、超声时间对黑色素得率的影响(单因素)；以上单因素试验的每个处理均重复三次，试验结果用SPSS 17.0软件进行方差分析，P<0.05表示显著性差异。实施例8在单因素试验的基础上，对6个单因素进行Plackett-Burman试验设计，以得率为判断指标，筛选出了影响梯棱羊肚菌黑色素得率的最为显著的影响因素；根据Plackett-Burman试验设计的最优结果作为中心点，以得率为响应值，采用Box-Behnken试验设计对梯棱羊肚菌黑色素的提取进行3因素3水平的响应面分析试验，得出了梯棱羊肚菌黑色素提取的最佳工艺条件，并进行了验证试验。实施例9对梯棱羊肚菌黑色素的理化性质进行了测定研究。

下面结合具体实施里对本发明进行详细说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的实验材料来源如下：

梯棱羊肚菌子实体，由山西农业大学食用菌中心提供，烘干后超微粉碎震荡研磨，密封袋保存于室温干燥处备用。

碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、纤维素酶和Bradford蛋白浓度测定试剂盒均商购于Solarbio公司。

实施例1、纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素

按照如下步骤提取梯棱羊肚菌黑色素：

(1)准确称取5.00g梯棱羊肚菌子实体粉末溶于20mL蒸馏水中，加入纤维素酶进行酶解，纤维素酶添加量为16mg/g，纤维素酶酶解温度为45℃，酶解时间为40min；

(2)酶解结束后，对酶解后的体系进行超声处理，超声功率为200W，时间为60min；

(3)超声结束后，在超声后的体系加入NaOH溶液配制成150mL浓度为1.5mol/L的NaOH溶液(料液比为1g：30mL)，60℃水浴2h进行碱提。碱提结束后，在10000r/min离心5min，收集上清液，得到黑色素提取液，将提取液用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴10h，10000r/min离心3min，将沉淀用蒸馏水反复清洗至中性，烘干即为黑色素粗品。

(4)将黑色素粗品溶于20mL蒸馏水中，按照表1分为七组去除杂蛋白，用0.1mol/LHCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH。于反应温度反应1h。继续用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节pH至14。使用乙酸乙酯去除油脂。用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴2h，将沉淀水洗至中性并烘干，得到梯棱羊肚菌黑色素纯品。测定各组黑色素得率，得率最高的两组进行蛋白质含量测定。筛选最佳除蛋白方法。其得率的计算见公式(1)。

表1、不同除蛋白方法及最适反应条件

实验结果如图1所示，七种除蛋白方法均对梯棱羊肚菌黑色素中的蛋白质有水解效果。氯仿法所得黑色素得率最高，碱性蛋白酶法所得黑色素得率次之，且差异显著(p<0.05)。因此，对氯仿法所得黑色素和碱性蛋白酶法所得黑色素进行蛋白质含量测定。

其中，蛋白质含量测定的具体步骤如下：

(1)考马斯亮蓝试剂配制

将5×G250染色液上下颠倒3-5次。准确量取10mL染色液，加入40mL双蒸水，混合均匀，配得1×G250染色液，置于4℃冰箱备用。

(2)标准蛋白溶液的配制

准确量取0.1mL牛血清蛋白(5mg/mL BSA)，加入2.4mL缓冲液(PBS)，混合均匀，即配得0.2mg/mL标准蛋白溶液(BSA)。

(3)蛋白质标准曲线绘制

分别向0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL BSA添加0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL、0mL PBS，同时分别添加5mL 1×G250染色液。充分混合均匀，室温静置3min，在590nm处测定吸光度值。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制蛋白质标准曲线。如图2所示。

(4)不同添加物处理所得黑色素中蛋白质含量测定

分别称取得率最高的两组黑色素，适当稀释，分别添加5mL1×G250染色液，室温静置3min后，在590nm处测定吸光度值。根据蛋白质标准曲线计算蛋白质含量。

实验结果如图3所示。由图3可知，氯仿法所得黑色素中蛋白质含量高于碱性蛋白酶法所得黑色素中蛋白质含量，这是由于氯仿去除游离蛋白时效果温和，蛋白质降解不充分，去除蛋白质效果不佳。碱性蛋白酶法测得蛋白质含量不足0.03mg/mL，除蛋白效果较为理想。相比氯仿法，碱性蛋白酶法更加安全，易于操作，成本更低。因此将碱性蛋白酶法定为梯棱羊肚菌黑色素提取工艺中除蛋白的方法。

实施例2、纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素

按照如下步骤提取梯棱羊肚菌黑色素：

(1)准确称取5.00g梯棱羊肚菌子实体粉末溶于20mL蒸馏水中，加入纤维素酶进行酶解，纤维素酶添加量为8mg/g，酶解温度为40℃，酶解时间为100min；

(2)酶解结束后，对酶解后的体系进行超声处理，超声功率为200W，时间为80min；

(3)超声结束后，在超声后的体系加入NaOH溶液配制成150mL浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mol/L的NaOH溶液(料液比为1g：30mL)，60℃水浴2h进行碱提。碱提结束后，在10000r/min离心5min，收集上清液，得到黑色素提取液，将提取液用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴10h，10000r/min离心3min，将沉淀用蒸馏水反复清洗至中性，烘干即为黑色素粗品。

(4)将黑色素粗品溶于20mL蒸馏水中，加入碱性蛋白酶，添加量为400000u/g，用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH至10.5，于反应温度45℃下反应1h，去除杂蛋白。继续用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节pH至14。使用乙酸乙酯去除油脂。用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴2h，将沉淀水洗至中性并烘干，得到梯棱羊肚菌黑色素纯品。其得率的计算见公式(1)。

实验结果如图4所示，NaOH溶液浓度小于1.5mol/L时，随着NaOH溶液浓度的增大，黑色素得率也逐渐升高。NaOH溶液的浓度为1.5mol/L时，黑色素得率达到最大，是由于在纤维素酶的酶解作用下，梯棱羊肚菌细胞壁被破坏，胞内黑色素溶解较完全。NaOH溶液浓度超过1.5mol/L，溶液碱性增强，部分黑色素被破坏，同时碱溶性的杂质会随之增加。因此，选择NaOH溶液的最适浓度为1.5mol/L。

实施例3、纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素

按照如下步骤提取梯棱羊肚菌黑色素：

(1)准确称取5.00g梯棱羊肚菌子实体粉末溶于20mL蒸馏水中，分别按照8mg/g、12mg/g、16mg/g、20mg/g、24mg/g的纤维素酶添加量加入纤维素酶进行酶解，纤维素酶酶解温度为40℃，酶解时间为100min；

(2)酶解结束后，对酶解后的体系进行超声处理，超声功率为200W、超声时间为80min；

(3)超声结束后，在超声后的体系加入NaOH溶液配制成150mL浓度为1.5mol/LNaOH溶液(料液比为1:30)，60℃水浴2h进行碱提。碱提结束后，在10000r/min离心5min，收集上清液，得到黑色素提取液，将提取液用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴10h，10000r/min离心3min，将沉淀用蒸馏水反复清洗至中性，烘干即为黑色素粗品。

(4)将黑色素粗品溶于20mL蒸馏水中，加入碱性蛋白酶，添加量为400000u/g，用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH至10.5，于反应温度45℃下反应1h，去除杂蛋白。继续用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节pH至14。使用乙酸乙酯去除油脂。用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴2h，将沉淀水洗至中性并烘干，得到梯棱羊肚菌黑色素纯品。其得率的计算见公式(1)。

实验结果如图5所示，纤维素酶添加量为20mg/g时，黑色素得率最高。纤维素酶添加量少于20mg/g时，黑色素得率较低。因为酶添加量过少时，梯棱羊肚菌子实体细胞壁中的纤维素未能完全降解，胞内黑色素不能完全溶出。当纤维素酶添加量为20mg/g时，纤维素酶与梯棱羊肚菌子实体接触面积达到饱和，此时得率最高。当纤维素酶添大于20mg/g时，黑色素得率呈下降趋势。因为纤维素酶添加量过多时，会对细胞壁的降解形成阻碍作用，得率反而下降。本试验最优纤维素酶添加量为20mg/g。

实施例4、纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素

按照如下步骤提取梯棱羊肚菌黑色素：

(1)准确称取5.00g梯棱羊肚菌子实体粉末溶于20mL蒸馏水中，加入纤维素酶进行酶解，纤维素酶添加量为16mg/g，纤维素酶酶解温度为40℃，分别按照60min、80min、100min、120min、140min的纤维素酶解时间进行酶解。

(2)酶解结束后，对酶解后的体系进行超声处理，超声功率为200W、超声时间为80min；

(3)超声结束后，在超声后的体系加入NaOH溶液配制成150mL浓度为1.5mol/LNaOH溶液(料液比为1g：30mL)，60℃水浴2h进行碱提。碱提结束后，在10000r/min离心5min，收集上清液，得到黑色素提取液，将提取液用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴10h，10000r/min离心3min，将沉淀用蒸馏水反复清洗至中性，烘干即为黑色素粗品。

(4)将黑色素粗品溶于20mL蒸馏水中，加入碱性蛋白酶，添加量为400000u/g，用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH至10.5，于反应温度45℃下反应1h，去除杂蛋白。继续用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节pH至14。使用乙酸乙酯去除油脂。用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴2h，将沉淀水洗至中性并烘干，得到梯棱羊肚菌黑色素纯品。其得率的计算见公式(1)。

实验结果如图6所示，纤维素酶的酶解时间为80min时，黑色素得率达到最高。纤维素酶的酶解时间少于80min时，由于纤维素酶与梯棱羊肚菌子实体细胞壁反应尚未结束，黑色素得率较低。纤维素酶的酶解时间多于80min时，黑色素得率下降。纤维素酶解时间为100min时，纤维素酶将子实体细胞壁中纤维素降解完全，黑色素得率趋于水平。

实施例5、纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素

按照如下步骤提取梯棱羊肚菌黑色素：

(1)准确称取5.00g梯棱羊肚菌子实体粉末溶于20mL蒸馏水中，加入纤维素酶，纤维素酶添加量为16mg/g，纤维素酶酶解时间为100min，分别于30、35、40、45、50℃进行酶解。

(2)酶解结束后，对酶解后的体系进行超声处理，超声功率为200W、超声时间为80min；

(3)超声结束后，在超声后的体系加入NaOH溶液配制成150mL浓度为1.5mol/LNaOH溶液(料液比为1:30)，60℃水浴2h进行碱提。碱提结束后，在10000r/min离心5min，收集上清液，得到黑色素提取液，将提取液用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴10h，10000r/min离心3min，将沉淀用蒸馏水反复清洗至中性，烘干即为黑色素粗品。

(4)将黑色素粗品溶于20mL蒸馏水中，加入碱性蛋白酶，添加量为400000u/g，用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH至10.5，于反应温度45℃下反应1h，去除杂蛋白。继续用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节pH至14。使用乙酸乙酯去除油脂。用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴2h，将沉淀水洗至中性并烘干，得到梯棱羊肚菌黑色素纯品。其得率的计算见公式(1)。

实验结果如图7所示，梯棱羊肚菌黑色素得率随着纤维素酶酶解温度的升高先上升后趋于水平。纤维素酶的酶解温度为30～40℃时，黑色素得率随温度升高而增大，是由于纤维素酶的动能随温度的增高而增高。纤维素酶的酶解温度为40℃时，黑色素得率最大。当纤维素酶的酶解温度超过40℃，酶蛋白会逐渐变性，酶活性逐渐降低，黑色素得率也逐渐降低。因此，40℃是纤维素酶酶解的最佳温度。

实施例6、纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素

按照如下步骤提取梯棱羊肚菌黑色素：

(1)准确称取5.00g梯棱羊肚菌子实体粉末溶于20mL蒸馏水中，加入纤维素酶进行酶解，纤维素酶添加量为16mg/g，纤维素酶酶解时间为100min，酶解温度为40℃。

(2)酶解结束后，对酶解后的体系进行超声处理，超声功率为200W、超声时间为80min；

(3)超声结束后，在超声后的体系加入NaOH溶液分别以1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的料液比配制成终浓度为1.5mol/L的NaOH溶液，60℃水浴2h进行碱提。碱提结束后，在10000r/min离心5min，收集上清液，得到黑色素提取液，将提取液用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴10h，10000r/min离心3min，将沉淀用蒸馏水反复清洗至中性，烘干即为黑色素粗品。

(4)将黑色素粗品溶于20mL蒸馏水中，加入碱性蛋白酶，添加量为400000u/g，用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH至10.5，于反应温度45℃下反应1h，去除杂蛋白。继续用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节pH至14。使用乙酸乙酯去除油脂。用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴2h，将沉淀水洗至中性并烘干，得到梯棱羊肚菌黑色素纯品。其得率的计算见公式(1)。

实验结果如图8所示，当料液比为1:10与1:20时，液体明显呈粘稠状，不利于黑色素的溶解。当料液比为1:30时，得率达到最高。料液比高于1:30，短时间内NaOH溶液对子实体中黑色素的提取达到平衡，黑色素得率趋于水平。料液比过高，浪费药品，增加后续试验工作量。因此，黑色素提取最佳料液比为1:30。

实施例7、纤维素酶超声波协同提取梯棱羊肚菌黑色素

按照如下步骤提取梯棱羊肚菌黑色素：

(1)准确称取5.00g梯棱羊肚菌子实体粉末溶于20mL蒸馏水中，加入纤维素酶进行酶解，纤维素酶添加量为16mg/g，纤维素酶酶解时间为100min，酶解温度为40℃。

(2)酶解结束后，对酶解后的体系进行超声处理，在超声功率为200W下分别超声40、60、80、100、120min。

(3)超声结束后，在超声后的体系加入NaOH溶液配制成150mL浓度为1.5mol/LNaOH溶液(料液比为1:30)，60℃水浴2h进行碱提。碱提结束后，在10000r/min离心5min，收集上清液，得到黑色素提取液，将提取液用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴10h，10000r/min离心3min，将沉淀用蒸馏水反复清洗至中性，烘干即为黑色素粗品。

(4)将黑色素粗品溶于20mL蒸馏水中，加入碱性蛋白酶，添加量为400000u/g，用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH至10.5，于反应温度45℃下反应1h，去除杂蛋白。继续用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节pH至14。使用乙酸乙酯去除油脂。用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴2h，将沉淀水洗至中性并烘干，得到梯棱羊肚菌黑色素纯品。其得率的计算见公式(1)。

实验结果如图9所示，超声时间为40～80min时，梯棱羊肚菌黑色素得率随超声时间增长而增高。超声时间为80min时，黑色素得率最高。超声时间继续增长，黑色素得率会逐渐降低，是由于超声时间过长，破坏了溶液中黑色素的结构，黑色素得率反而降低。因此，梯棱羊肚菌黑色素提取的最佳超声时间为80min。

实施例8、Plackett-Burman试验和Box-Benhnken响应面试验

一、Plackett-Burman试验

在单因素试验的基础上，对6个单因素进行Plackett-Burman试验设计(表2)，以A(NaOH浓度)、B(纤维素酶添加量)、C(纤维素酶酶解时间)、D(纤维素酶解温度)、E(料液比)、F(超声时间)作为影响因素，以得率为判断指标，用Design-Expert.V8.0.6设计PB试验，每个试验重复3次，筛选出影响梯棱羊肚菌黑色素得率的最为显著的影响因素。

表2 Plackett-Burman试验设计因素及水平表

A:NaOH浓度(mol/L)；B:纤维素酶添加量(mg/g)；C:纤维素酶酶解时间(min)；D:纤维素酶酶解温度(℃)；E:料液比；F:超声时间(min)

以得率为响应值，实验结果见表3，对试验结果进行方差分析见表4。

表3 Plackett-Burman试验结果

A～F：同表2

表4试验因子的重要性分析

A～F：同表2

由表3和表4可知，以得率为指标，具有显著性影响的因素为A(NaOH浓度)、B(纤维素酶酶解时间)、C(纤维素酶添加量)。按照重要性排序为A>C>B。因此将NaOH溶液浓度、纤维素酶添加量和纤维素酶酶解时间作为下一步响应面分析的重点考察因素，其它条件分别为：纤维素酶酶解温度为40℃，料液比为1:30，超声时间为80min。

二、Box-Behnken试验

根据Plackett-Burman试验设计的最优结果作为中心点，以得率为响应值，采用Box-Behnken试验设计对梯棱羊肚菌黑色素的提取进行3因素3水平的响应面分析试验(表5)，每个试验进行3次重复，进行提取工艺优化。

表1 Box-Benhnken试验设计

A～C：同表2

试验设计及结果见表6。

表6 Box-Benhnken响应面试验设计与结果

A～C：同表2

通过表6梯棱羊肚菌黑色素得率的响应面分析，得到A(NaOH溶液浓度)、B(纤维素酶添加量)、C(纤维素酶酶解时间)3个因素与响应值之间的拟合回归方程为

Y＝-58.02415+18.61985A+2.86272B+0.63071C+0.091750AB+0.006725AC+0.00164062BC-6.82520A²-0.077800B²-0.00428888C²。

由表6、表7可知，模型的P值<0.0001，表明模型极显著。失拟值的P大于0.05，不显著，表明模型拟合较好，试验误差较小。该模型的相关系数R²＝0.9839，说明有98.39％的结果可以根据此模型得到解释。由表7中P值可知，A²、B²、C²项差异极显著，A项、C项差异显著，根据一次项P值可知，3个因素对得率影响的排序为：NaOH溶液浓度(A)>纤维素酶酶解时间(C)>纤维素酶添加量(B)。

表7得率方差分析表

A～C：同表1

等高线及响应曲面如图10、11、12所示，图10、11、12分别表示在A、B、C这三个因素中，当有一个因素为零时，另外两个因素之间的交互作用，等高线越趋于椭圆，则表示两因素的交互作用越显著，响应曲面的倾斜度越高。及坡度越陡，表示两因素的交互作用越明显。

通过模型得出，梯棱羊肚菌黑色素提取的最优条件是：NaOH溶液浓度为1.54mol/L、纤维素酶添加量为20.14mg/g、纤维素酶酶解时间为78.58min。

三、模型验证

在上述最优的提取工艺条件下，预测黑色素得率为9.89568％。考虑到试验操作的可行性，将提取条件调整为：NaOH溶液浓度为1.54mol/L、纤维素酶添加量为20mg/g、纤维素酶酶解时间为78.6min。采用最佳提取工艺条件进行验证试验，黑色素得率为10.003％，与理论预测值相对误差为0.99％以内，说明该模型较可靠。

对比例、浸提提取梯棱羊肚菌黑色素

为验证纤维素酶-超声波协同提取法对梯棱羊肚菌黑色素得率的作用，在进行最佳提取工艺验证的同时，还设置了一组浸提组，除未添加纤维素酶、未使用超声波辅助外，在试验条件控制等方面与验证组均相同，具体步骤如下：

(1)准确称取5.00g梯棱羊肚菌子实体粉末，加入NaOH溶液配制成150mL浓度为1.5mol/L NaOH溶液(料液比为1:30)，60℃水浴2h进行碱提。碱提结束后，在10000r/min离心5min，收集上清液，得到黑色素提取液，将提取液用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴10h，10000r/min离心3min，将沉淀用蒸馏水反复清洗至中性，烘干即为黑色素粗品。

(2)将黑色素粗品溶于20mL蒸馏水中，加入碱性蛋白酶，添加量为400000u/g，用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH至10.5，于反应温度45℃下反应1h，去除杂蛋白。继续用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节pH至14。使用乙酸乙酯去除油脂。用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴2h，将沉淀水洗至中性并烘干，得到梯棱羊肚菌黑色素纯品。其得率的计算见公式(1)。

试验结果表明，浸提组黑色素得率为5.4％。纤维素酶-超声波协同提取法提取黑色素得率比浸提组黑色素得率提高了85.24％，表明纤维素酶-超声波协同优化法能够有效提高梯棱羊肚菌黑色素得率。

实施例9、梯棱羊肚菌黑色素的表征和理化性质

将上述实施例8最优条件(NaOH溶液浓度为1.54mol/L、纤维素酶添加量为20mg/g、纤维素酶酶解时间为78.6min)下制备的梯棱羊肚菌黑色素进行紫外-可见光谱扫描、傅里叶红外光谱扫描、扫描电子显微镜观察其结构特征；通过对其色价、水溶性、溶解性、及稳定性的测定为梯棱羊肚菌黑色素的精深加工提供理论依据。

一、梯棱羊肚菌黑色素紫外-可见光谱扫描

取少量的黑色素样品溶解于1.5mol/L NaOH溶液中。40℃水浴1h，12000r/min离心2min。以1.5mol/L NaOH溶液为背景基线，采用全波段紫外分光光度计对上清液在200～900nm范围内进行扫描，根据结果，确定梯棱羊肚菌黑色素的最大吸收波长。

紫外可见光谱图如13所示。梯棱羊肚菌黑色素在230nm处有最大吸收峰。在260nm、280nm处没有明显的吸收峰，表明黑色素中核酸、蛋白质、脂肪含量较少。

二、梯棱羊肚菌黑色素红外光谱图分析

取少量黑色素样品按照1:200的比例加入干燥的溴化钾，研磨并混合均匀，压制成片，在4000cm^-1～500cm^-1的扫描范围内，采用傅里叶变换红外光谱仪进行红外光谱扫描。

梯棱羊肚菌黑色素红外光谱图如图14所示。黑色素是一种结构复杂的生物大分子，官能团较多。基团内部电子效应、氢键的相互影响致使红外光谱图形成一系列宽而强的吸收峰。梯棱羊肚菌黑色素在1631.58cm^-1处有天然真黑色素的典型的特征吸收峰，说明梯棱羊肚菌黑色素属于天然黑色素。梯棱羊肚菌黑色素的吸收峰主要有：

(1)在2922.88cm^-1和2852.62cm^-1处的中等强度的尖峰是由于C-H伸缩振动形成，是CH₂官能团的特征吸收峰，2922.88cm^-1处的吸收峰是反对称伸缩振动形成，2852.62cm^-1处的吸收峰是对称伸缩振动形成。

(2)在1631.58cm^-1处的强吸收峰，可能是芳环骨架上的C＝C共轭，即CH₂＝CH-CH＝CH₂骨架振动，或是羧酸盐以及含氮的杂环，说明很有可能是含有吲哚基团；在1631.58cm^-1附近出现的吸收峰也可能是C＝O的非对称振动以及N-H的变角振动，说明可能存在-COOH官能团。

(3)在1589.34cm^-1和1512.18cm^-1处出现吸收峰，表明存在-NH弯曲振动，而在1384.13cm^-1处出现的吸收峰，表明存在C-N的伸缩振动，这也是黑色素典型的吲哚结构。

(4)在1349.67cm^-1处的吸收峰，表明有多个CH₃单键弯曲振动。

三、梯棱羊肚菌黑色素扫描电子显微镜

取少量的梯棱羊肚菌黑色素纯化前的粗品样品和梯棱羊肚菌黑色素纯品样品固定于导体胶上，放置于喷金台上进行真空喷金镀膜90s，并使用扫描电子显微镜进行扫描观察。

由图14可知，A、B为除杂前粗黑色素样品扫描电子显微镜图片；C、D为除杂后纯黑色素样品扫描电子显微镜图片。在不同放大倍数下，样品均呈块状、表面不规则的结晶体结构，且之间相互粘连。

由图A、B可以看出，黑色素结构表面附着粘连杂质，可能是多糖、油脂、蛋白质。黑色素晶体之间纤维状的相连或带有孔洞的褶皱是黑色素表面附着的多糖；图C、D是去除杂质后较纯的黑色素晶体结构，可以明显看出，其为表面光滑，结构清晰的晶体结构。

四、梯棱羊肚菌黑色素色价的测定

准确称取0.010g黑色素样品溶解于5mL pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液中，混合均匀，40℃水浴1h，12000r/min离心2min。上清液稀释4倍，在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

色价的计算见公式(2)。

(2)式中：A为吸光度值；r为测定吸光度值时所吸取样品的稀释倍数；m为样品质量(g)。

色价是天然色素的主要质量指标之一，能从一定程度上反应色素含量的高低。根据公式(2)得出，梯棱羊肚菌黑色素的色价E1％1cm为480.24。高于黑芝麻黑色素的色价(326)和花椒籽种皮黑色素的色价(341.73)。

五、梯棱羊肚菌黑色素水溶性、溶解性的测定

称取一定量的黑色素样品于2mL的蒸馏水中，30℃震荡1h。每隔20min上下颠倒一次，1h后仍有沉淀。12000r/min离心5min，上清液冷冻干燥，所得粉末进行称重并记录，计算溶解度。在30℃的水浴条件下，梯棱羊肚菌黑色素几乎不溶解于水。

准确称取0.002g黑色素样品分别于20mL 1mol/L NaOH溶液、20mL1 mol/L HCl、20mL蒸馏水、20mL无水乙醇、20mL75％乙醇、20mL正丁醇和20mL氯仿中，30℃震荡水浴1h，1200r/min离心2min，观察各组颜色变化及沉淀情况。由表8可知，黑色素只能溶解于碱性溶液，微溶于无水乙醇和75％乙醇，不溶于蒸馏水、HCl、冰乙酸等酸性溶液和正丁醇、氯仿、异丙醇等有机溶剂。

表8梯棱羊肚菌黑色素的溶解性

注：+表示微溶，++表示溶解，-表示不溶

六、稳定性

1、温度对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响

准确称取0.010g黑色素样品于100mL 0.2mol/L pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液中，于20、40、60、80、100℃进行反应。以pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液为空白对照，每隔20min在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

由表9可知，梯棱羊肚菌黑色素溶液的吸光度值在不同温度(20～100℃)下差异很小，均保持在0.4～0.6之间。表明梯棱羊肚菌黑色素有良好的热稳定性。耐热能力强，高温条件下保存能力好。

表9温度对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响

2、光照对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响

准确称取0.010g黑色素样品于100mL 0.2mol/L pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中。分别置于自然光、避光和紫外光环境下反应0h、24h、48h、72h。以pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液为空白对照，每隔24h在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

由表10可知，梯棱羊肚菌黑色素溶液在自然光和避光条件下的吸光值均在0.64～0.68的范围内波动，趋势稳定。在紫外光照射下，随着时间的延长，黑色素吸光度值逐渐降低，说明紫外光对梯棱羊肚菌黑色素的稳定性有一定的影响。表明在自然光和避光环境下，羊肚菌黑色素损失较小，成分稳定。黑色素在紫外光下稳定性较差，不适合长期紫外条件保存。

表10光照对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响

3、pH值对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响

准确称取0.010g黑色素样品分别溶于100mL pH为3.0、5.0、7.0、8.0、9.0、1.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中。室温静置2h。以相应的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液为空白对照，在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

由图15可知，pH对黑色素的稳定性影响较大。随着梯棱羊肚菌黑色素溶液pH值的增大，其溶液吸光度值呈上升趋势。在酸性环境中，即pH值在2.0～7.0的范围内，色素保存率较低。在pH值为2.0、3.0和5.0时，黑色素几乎不溶解。当溶液的pH大于8时，溶液的吸光度值快速升高，溶液颜色逐渐加深，黑色素的溶解度逐渐增大。试验表明，梯棱羊肚菌黑色素在酸性条件下不稳定，在碱性条件下溶解度较大，较稳定。

4、氯化钠和蔗糖对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响

配制pH为8.0，1g/L黑色素溶液，取10mL黑色素溶液于100mL容量瓶中，分别用浓度为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％的氯化钠溶液(g/mL)定容，充分混合。分别于室温静置24h、48h、72h。以相应的氯化钠溶液为空白对照，每隔24h在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

取10mL黑色素溶液于100mL容量瓶中，分别用浓度为2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％的蔗糖溶液(g/ml)定容，充分混合。分别于室温静置24h、48h、72h。以相应的蔗糖溶液为空白对照，每隔24h在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

不同浓度的氯化钠溶液对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响结果见图16。由图16可知，在氯化钠溶液浓度为0.2％～0.8％(g/mL)的范围内时，室温静置24h、48h及36h后，溶液的吸光度值均保持在0.6～0.8的范围内，波动较小。表明梯棱羊肚菌黑色素在一定的氯化钠溶液浓度范围内有良好的稳定性。

不同浓度的蔗糖溶液对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响结果见图17。由图17可知，在蔗糖溶液浓度为2％～12％(g/mL)的范围内时，室温静置24h、48h及36h后，溶液的吸光度值均保持在0.5～0.7的范围内，波动较小。表明梯棱羊肚菌黑色素在一定的蔗糖溶液浓度范围内有良好的稳定性。

5、金属离子对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响

配制pH为8.0，1g/L黑色素溶液，取10mL黑色素溶液于100mL容量瓶中，分别用浓度为0.01％的金属离子Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺的溶液(g/mL)定容，充分混合。每隔两个小时，即在混合均匀后2h和4h时，以相应的金属离子溶液为空白对照，在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

金属离子对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响结果见图18。由图18可知，向梯棱羊肚菌黑色素溶液中添加金属离子Fe³⁺后，与其他金属离子黑色素溶液相比，其吸光度值明显增高。且随着时间的延长，添加了Fe³⁺的色素溶液的吸光度值也有所增加。这可能是由于，Fe³⁺可能与梯棱羊肚菌你黑色素中的某个基团发生结合，增强了黑色素的结构，且有显著的增色效果。添加了Fe²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺的黑色素溶液，与对照组样品相比，吸光度值均没有明显的变化，说明Fe²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺对黑色素的稳定性没有显著影响。

本发明梯棱羊肚菌黑色素的色价为480.24，黑色素纯度较高；梯棱羊肚菌黑色素有较好的热稳定性、光稳定性和碱性稳定性，在氯化钠溶液和蔗糖溶液中也有较好的稳定性，但不宜长时间置于紫外辐射下。金属离子Fe³⁺对梯棱羊肚菌黑色素具有一定的增色作用，其他金属离子Fe²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺对黑色素的稳定性没有显著影响。

Claims (6)

1.一种梯棱羊肚菌黑色素的提取方法，包括如下步骤：

(1)将梯棱羊肚菌子实体粉碎后溶于水中，加入纤维素酶进行酶解；

(2)对步骤(1)酶解后的体系进行超声处理；

(3)在步骤(2)超声处理后的体系中加入碱进行碱提，碱提结束后离心，收集上清液，得到黑色素提取液；在所述黑色素提取液中加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到梯棱羊肚菌黑色素粗品；

(4)将步骤(3)得到的梯棱羊肚菌黑色素粗品溶于水中，加入蛋白酶进行水解以去除蛋白质，调节体系pH至碱性，然后去除油脂；在去除蛋白和油脂的体系中加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到所述梯棱羊肚菌黑色素。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：

步骤(1)中，所述纤维素酶与所述梯棱羊肚菌子实体的质量比为20mg：1g；所述纤维素酶酶解的温度为40℃；所述纤维素酶酶解的时间为80min；

步骤(2)中，所述超声的功率为200W，时间为80min；

步骤(3)中，以在步骤(2)超声处理后的体系中加入碱后形成的体系为碱提体系；所述碱在所述碱提体系中的浓度为1.54mol/L；所述梯棱羊肚菌子实体与所述碱提体系的料液比为1g：30mL。

3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述加入酸性试剂步骤中调节体系pH至1～2；

所述酸沉的温度为80℃，时间为10h。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，所述碱性蛋白酶与所述梯棱羊肚菌黑色素粗品的比例为400000u：1g；

所述水解的温度为40～50℃，pH为9.0～12.0，时间为1h。

6.权利要求1-5中任一项所述的提取方法提取得到的梯棱羊肚菌黑色素。

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