CN109549959A - 一种利用纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的方法 - Google Patents

一种利用纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用纤维素酶‑超声波协同提取黑木耳黑色素的方法，其最优条件为：酶添加量12mg，酶解温度40℃，酶解pH5.0，酶解时间120min，NaOH浓度1.27mol/L，料液比1:40 g/ml，超声功率300W，超声时间52min，超声温度60℃。在最优条件下，黑木耳黑色素提取得率可达到10.48%，相比于实验设置的未添加纤维素酶的超声波组黑色素提取得率提高了12.93%。抗氧化结果表明，采用纤维素酶‑超声波协同提取的黑色素相比于未加纤维素酶提取的黑色素清除ABTS、DPPH和羟基自由基的能力更强，为黑木耳黑色素的高效提取及其产品的应用开发奠定了基础。

Description

一种利用纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的方法
技术领域
本发明涉及黑色素提取技术领域，具体涉及一种利用纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的方法。
背景技术
黑木耳（Auricularia heimuer F. Wu, B.K. Cui & Y.C. Dai），又名云耳、光木耳等，隶属于担子菌门，伞菌纲，木耳科，木耳属。它是一种常见的食药用真菌（Wu et al.2015; 吴芳等 2015），具有丰富的营养价值和药理活性。黑木耳具有多种活性成分，如黑色素、蛋白质、多糖、氨基酸、膳食纤维、钙、铁等（栾淑莹 2016）。其中，黑色素是黑木耳的主要活性成分之一（武志超等 2017），在其药理活性上发挥着重要的作用。天然黑色素是由酚或吲哚类化合物氧化聚合形成的非均质高分子量化合物，传统上将黑色素分为三种：第一种是真黑色素，一般不含硫元素，颜色一般为深黑；第二种是棕黑色素，含有硫元素，颜色棕黑色、黄棕色、棕色；第三种是异黑色素，主要存在于植物体中（Riley 1997；Langfelder et al. 2003；Tarangini et al. 2013）。黑木耳子实体中的黑色素在分类上属于第一种，为真黑色素（李斌 2011）。大量研究表明，黑木耳子实体中的黑色素具有良好的抗氧化、抗辐射、抗衰老、抗病毒及调节免疫等生物功效（邹宇 2011；李斌 2011），对人体的健康有着重要的意义，如何有效地从黑木耳子实体中获取黑色素就显得尤为重要。
由于黑木耳黑色素只溶于碱，而不溶于水和其它常见的有机溶剂，因此在传统上常采用氢氧化钠提取黑色素（李琦等 2010）。2011年，何长川等人采用浸提法对黑木耳黑色素提取工艺进行了研究，结果表明其黑色素粗品提取率可达到6.90％（何长川等 2011）。2016年，张艳荣等人采用超声波辅助法提取了黑木耳黑色素，其黑色素粗品提取率达到了9.11％（张艳荣等 2016）。纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复合酶系，可以有效的破坏微生物细胞壁，进而达到提高活性物质的提取效率，其已在食药用真菌活性物质提取中得到了广泛的应用（吴关威等 2010；凡军民等 2013；程伟等 2012）。但目前尚未见将纤维素酶应用于黑木耳黑色素提取的研究报道。因此，本文探究了纤维素酶与超声波协同提取黑木耳黑色素的工艺，并进一步对所提取的黑木耳黑色素抗氧化活性进行了分析，以期为黑木耳黑色素高效提取及其产品的应用开发提供依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的方法。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种利用纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的方法，包括以下步骤：
（1）将干燥的黑木耳子实体粉碎，过80目标准筛，备用；
（2）精确称取黑木耳子实体粉末1.00g溶于一定pH和料液比1:20 g/ml的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液中，摇匀，加入一定量的纤维素酶，在适宜的温度下水浴反应一段时间，反应结束后，10000r/min离心5min，去除上清液，保留沉淀物；
（3）在步骤（2）得到的沉淀物中，按一定料液比加入NaOH溶液，在一定的超声功率和超声温度下提取黑木而黑色素，提取结束后，于10000r/min离心5min，收集上清液，得黑色素提取液；
（4）将黑色素提取液用HCl调节pH=1.5，80℃水浴10h，10000r/min离心3min，收集沉淀，将沉淀依次用蒸馏水、体积浓度95%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚和体积浓度75%乙醇洗至溶液无色，6000r/min离心去除清洗溶剂，将沉淀用NaOH溶解，再用HCl调节pH=1.5，重新沉淀，离心收集沉淀，将沉淀用0.1M NaOH复溶，接着用0.1M HCl调节pH至中性，溶液流水透析48h，冷冻干燥，得干燥的黑木耳黑色素纯品。
步骤（2）中酶添加量12mg，酶解温度40℃，酶解pH5.0，酶解时间120min。
步骤（3）中NaOH浓度1.27mol/L，料液比1:40 g/ml，超声功率300W，超声时间52min，超声温度60℃。
本发明的优点：本发明的纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的方法，黑木耳黑色素提取得率可达到10.48%，相比于实验设置的未添加纤维素酶的超声波组黑色素提取得率提高了12.93%。抗氧化结果表明，采用纤维素酶-超声波协同提取的黑色素相比于未加纤维素酶提取的黑色素清除ABTS、DPPH和羟基自由基的能力更强。
附图说明
图1为黑木耳黑色素紫外全吸收光谱图（A）及其含量标准曲线（B）；
图2为各酶解单因素对黑木耳黑色素提取得率的影响，注：A：酶添加量；B：酶解温度；C：酶解pH；D：酶解时间；与前一条件相比较，*p＜0. 05；
图3为各超声单因素对黑木耳黑色素提取得率的影响，注：A：NaOH浓度；B：料液比；C：超声功率；D：超声时间；E ：超声温度；与前一条件相比较，*p＜0. 05；
图4为响应面法立体分析图；
图5为纤维素酶-超声波协同提取法与超声波法、浸提法、纤维素酶酶解法的黑色素提取得率对比， 注：A: 纤维素酶-超声波协同提取法；B: 超声波法；C: 浸提法；D: 纤维素酶酶解法；
图6为纤维素酶-超声波协同提取与未加纤维素酶提取的黑色素抗氧化活性，注：A:ABTS自由基清除能力；B: DPPH自由基清除能力；C: 羟基自由基清除能力；图例a：纤维素酶-超声波协同提取的黑色素；图例b：超声波提取的黑色素。
具体实施方式
材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
1.1.1 材料：黑木耳子实体（购于福建省福州市大润发超市）。
试剂和仪器：黑木耳黑色素纯品。氢氧化钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、硫酸亚铁、水杨酸等试剂均为国产分析纯。纤维素酶（源叶生物），二苯基苦味酰基苯肼（DPPH）（Sigma公司），PS-G60洁康超声波清洗机，高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），FE-20型pH计（梅特勒托利多仪器有限公司），ST16R型离心机（美国Thermo公司），CP-214型电子天平（奥豪斯仪器有限公司）。
提取液黑色素含量测定
通过扫描黑木耳黑色素纯品的紫外全吸收光谱，确定了黑木耳黑色素紫外的最大吸收波长在215 nm处（图1中A），在此波长下检测吸光度，以氢氧化钠溶液为空白，绘制了黑木耳黑色素含量标准曲线（图1中B）。依据标准曲线计算提取液中黑色素含量。根据公式（1）计算黑木耳黑色素提取得率。
提取得率（%）=提取液中黑色素质量/黑木耳子实体粉末质量*100% （1）
1.3 黑木耳黑色素的提取
将干燥的黑木耳子实体粉碎→过80目标准筛→精确称取黑木耳子实体粉末1.00g溶于不同pH和料液比1:20 g/ml的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液缓冲溶液中，摇匀→加入一定量的纤维素酶→在适宜的温度下水浴反应一段时间→反应结束后，10000r/min离心5min，去除上清液，保留沉淀物，按一定料液比加入NaOH溶液→在一定的超声功率和超声温度下提取黑木而黑色素→提取结束后，于10000r/min离心5min，收集上清液，得黑色素提取液→将黑色素提取液用HCl调节pH=1.5→80℃水浴10h→10000r/min离心3min，收集沉淀，将沉淀依次用蒸馏水、体积浓度95%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚和体积浓度75%乙醇洗至溶液无色，6000r/min离心去除清洗溶剂→将沉淀用NaOH溶解，再用HCl调节pH=1.5，重新沉淀→离心收集沉淀，将沉淀用0.1M NaOH复溶，接着用0.1M HCl调节pH至中性，溶液流水透析48h→冷冻干燥，得干燥的黑木耳黑色素纯品。
酶解单因素试验
在固定超声条件（超声温度30℃，超声时间30min，超声功率250W，料液比1:30 g/ml，NaOH浓度1.25M）的前提下，以黑色素提取率为指标，分别考察了酶添加量（8、10、12、14、16和18mg）、酶解温度（30、35、40、45、50和55℃）、酶解pH（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0）和酶解时间（20、40、60、80、100和120min）四个因素对黑木耳黑色素提取率的影响，每组实验重复3次。
酶解正交优化
对以上酶添加量、酶解温度、酶解pH以及酶解时间4个单因素进行筛选，从各因素筛选出3个水平进行正交实验，正交实验设计表见表1。
表1 酶解正交试验因素与水平
1.6 超声波单因素试验
在酶解最优条件的基础上，进一步探究超声提取条件，以黑色素提取得率为指标，分别考察了提取溶剂NaOH浓度（0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和1.75mol/L）、料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50和1:60 g/ml）、超声功率（200、250、300、350、400、450和500W）、超声时间（20、30、40、50、60、70、80 min）和超声温度（20、30、40、50、60、70和80℃）五个因素对黑木耳黑色素提取得率的影响，每组实验重复3次。
1.7 响应面优化
依据1.6小节中的单因素实验结果，采用Desig-expert 8.0.6软件，根据Box-Behnken中心组合原理进行实验设计，以优化纤维素酶-超声波协同提取的黑木耳黑色素的工艺参数。响应面设计表见表2。
表2 Box-Behnken试验因素与水平
1.8 黑木耳黑色素抗氧化性分析
1.8.1 ABTS自由基清除率的测定：参照孙晓琦等（孙晓琦等 2017）的研究方法。取1.5mL的ABTS工作液和100μL不同质量浓度（0.25、0.5、1、2、4mg/mL）的样品溶液，加入试管混匀，室温下避光反应1h，在波长734nm处测定吸光值吸光值记为AX；以蒸馏水替代样品溶液测定吸光值A0；以蒸馏水替代ABTS测定吸光值AX0。根据公式（2）计算清除率，实验每组重复3次，取平均值。
清除率（%）=[1-(AX- AX0)/ A0]*100% （2）
1.8.2DPPH自由基清除率的测定：参照Saiga等（Ai et al. 2003）的方法。取不同质量浓度（0.25、0.5、1、2、4mg/mL）的样品溶液2mL和2×10-4mol/L的DPPH无水乙醇溶液2mL，加入试管中摇匀，室温下密闭静置30min，于波长517nm处测得吸光度AX，以蒸馏水替代样品溶液测定吸光值A0；以蒸馏水替代DPPH测定吸光值AX0。根据公式（2）计算DPPH自由基的清除率。重复3次，取平均值。
1.8.3羟基自由基清除率的测定：参照白生文等（白生文等 2015）的方法，采用水杨酸-硫酸亚铁法测定。在试管中依次加入9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、9mmol/L的FeSO4溶液、不同质量浓度（0.25、0.5、1、2、4mg/mL）的样品溶液和8.8mmol/L的H2O2溶液各1mL，最后加蒸馏水补至15mL，摇匀，置于37℃水浴中反应15min，在波长510nm处测定吸光度AX，以蒸馏水1mL替代样品溶液测定吸光度A0，以蒸馏水1mL替代H2O2测定吸光度AX0，根据公式（2）计算清除率。重复3次，取平均值。
2 结果与分析
2.1 酶解单因素试验
2.1.1 酶添加量对黑木耳黑色素提取得率的影响：在酶解温度30℃、pH5.0、酶解时间60min的条件下，酶添加量分别为8、10、12、14、16和18mg，研究酶添加量对黑色素提取得率的影响，结果如图2中 A所示。从图2中A可以看出，黑色素的提取得率会随着酶添加量的增加而呈现出逐渐上升的趋势，当酶添加量为12mg时提取得率达到最高，添加量大于12mg时，提取得率不再上升，表明达到饱和度。因此，在酶添加量为12mg的条件酶解提取黑木耳黑色素比较适宜。
2.1.2 酶解温度对黑木耳黑色素提取得率的影响：在酶添加量12mg、pH5.0、酶解时间60min的条件下，酶解温度分别为30、35、40、45、50和55℃，研究酶解温度对黑色素提取得率的影响，结果如图2中B所示。从图2中B可以看出，黑色素的提取得率会随着酶解温度的上升呈现先增后减的趋势，当酶解温度上升至35℃时，黑色素提取率达到最高。当温度过高，会引起酶的空间结构的改变和活性的丧失，进而影响了提取效率。因此，在温度为35℃时酶解提取黑木耳黑色素比较适宜。
2.1.3 酶解pH对黑木耳黑色素提取得率的影响：在酶解温度35℃、酶添加量12mg、酶解时间60min的条件下，酶解pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，研究酶解pH对黑色素提取得率的影响，结果如图2中C所示。从图2中C可以看出，黑色素的提取得率会随着pH的增加呈现出先增后减的趋势，在pH为5.0时黑色素提取得率达到最高。当pH过酸或过碱时，会抑制纤维素酶的活性，影响酶解效率。因此，在pH为5.0的条件下酶解提取黑木耳黑色素比较合适。
2.1.4 酶解时间对黑木耳黑色素提取得率的影响：在酶解温度35℃、酶添加量12mg、酶解pH5.0的条件下，酶解时间分别为20、40、60、80、100和120min，研究酶解时间对黑色素提取得率的影响，结果如图2中D所示。从图2中D可以看出，黑色素的提取得率会随着酶解时间的增加呈现出逐渐上升的趋势，在酶解时间100min时提取黑色素的提取得率达到最大。因此，选择酶解时间为100min较为适宜。
2.2 酶解正交试验
为了筛选出酶解提取黑色素各条件的最优组合，因此实验进一步采用正交试验进行分析。根据单因素实验结果，选取酶添加量、酶解温度、酶解pH和酶解时间中的3个较优水平进行四因素三水平的正交试验（表3）。
从表3中可以看出，酶添加量中的k0最大、酶解温度中的k1最大、酶pH中的k0最大和酶解时间中的k1最大，所以可得出黑木耳黑色素酶解提取条件的最优组合为：酶添加量12mg，酶解温度40℃，酶解pH为5.0，酶解时间120min。
通过对极差R进行分析可以发现，酶解时间的极差最大，为0.45，表明出酶解时间是影响酶解提取黑色素的主要因素，其次是酶解温度，然后是酶添加量，最后是酶pH。通过方差分析可以发现（表4），酶解时间的F值最大，为23.811，酶解温度其次，为20.315，然后是酶添加量，为11.894，最后是酶解pH，为0.454。所以4种因素的显著性差异大小顺序依次为酶解时间>酶解温度>酶添加量>酶解pH，这与直观分析结果一致。
表3 酶解提取正交试验结果直观分析
表4 酶解正交试验结果方差分析
2.3 超声波单因素试验
为进一步提高黑木耳黑色素的提取得率，实验在酶解最优条件的基础上，进一步探究了超声提取条件。以黑色素提取率为指标，分别考察了提取溶剂NaOH浓度、料液比、超声功率、超声时间和超声温度这五个因素对黑木耳黑色素提取得率的影响。
2.3.1 NaOH浓度对黑木耳黑色素提取得率的影响：在料液比1:30 g/ml、超声功率250W、超声时间30min、超声温度30℃的条件下，NaOH浓度分别为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和1.75mol/L，研究NaOH浓度对黑木耳黑色素提取得率的影响，结果如图3中A所示。从图3中A可以看出，黑木耳黑色素提取得率随着NaOH浓度的增加呈现先上升后下降的趋势，当NaOH浓度达到1.25mol/L时，黑色素提取得率达到最大。因此，在NaOH浓度1.25mol/L的条件下提取黑色素比较适宜。
2.3.2料液比对黑木耳黑色素提取得率的影响：在NaOH浓度1.25mol/L、超声功率250W、超声时间30min、超声温度30℃的条件下，料液比为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50和1:60 g/ml，研究料液比对黑色素提取得率的影响，结果如图3中B所示。从图3中B可以看出，黑木耳黑色素提取得率随料液比的增加呈现不断上升的趋势，当料液比超过1:40 g/ml后，提取率基本保持不变，考虑到料液比过大会造成溶剂浪费并且不利于后处理，所以本实验在料液比为1:40 g/ml的条件下提取黑色素比较适宜。
2.3.3超声功率对黑木耳黑色素提取得率的影响：在NaOH浓度1.25mol/L、料液比1:40 g/ml、超声时间30min、超声温度30℃的条件下，超声功率分别为200、250、300、350、400、450和500W，研究超声功率对黑色素提取得率的影响，结果如图3中C所示。从图3中C可以看出，随着超声功率的增大，黑色素的提取得率呈现逐渐上升的趋势，当超声功率为300W时，黑色素提取得率达到最高。当超声功率过高，黑色素的提取得率发生了下降，这可能是由于超声功率过大，破坏了黑色素的结构，所以在超声功率为300W的条件下提取黑色素较为适宜。
2.3.4超声时间对黑木耳黑色素提取得率的影响：在NaOH浓度1.25mol/L、料液比1:40 g/ml、超声功率300W、超声温度30℃的条件下，超声时间分别为20、30、40、50、60、70和80min，研究超声时间对黑木耳黑色素提取得率的影响，结果如图3中D所示。从图3中D可以看出，随着超声时间的推移，黑色素的提取得率逐渐提高，当超声时间超过50min时，黑色素的提取得率发生了降低，这可能是由于超声时间的过长，使得已经溶解出来的黑色素被破坏。因此，在超声时间为50min的条件下提取黑色素比较适宜。
2.3.5超声温度对黑木耳黑色素提取得率的影响：在NaOH浓度1.25mol/L、料液比1:40 g/ml、超声功率300W、超声时间50min的条件下，超声温度分别为20、30、40、50、60、70和80℃，研究超声温度对黑木耳黑色素提取得率的影响，结果如图3中E所示。从图3中E可以看出，黑色素的提取得率随超声温度的上升而逐渐提高，当超声温度上升至60℃后，黑色素的提取得率趋于平衡，当温度过高，可能会对黑色素的活性产生影响，并且会加大能源的消耗。因此，在超声温度为60℃的条件下提取黑色素比较适宜。
2.4 响应面试验设计及结果
在超声波单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取A（NaOH浓度）、B（超声功率）和C（超声时间）为自变量，以黑色素提取率（Y）为响应值，设计3因素3水平的响应面分析试验。试验设计及结果见表5。
通过Desig-expert 8.0.6数据处理软件对表5黑木耳黑色素得率进行响应面分析，得到A（NaOH浓度）、B（超声功率）、C（超声时间）3个因素与Y之间的回归方程：Y=10.32+0.16A+0.18B+0.17C-0.84A2-0.52B2-0.51C2 -0.1AB-0.13AC-0.08BC。对此回归模型进行方差分析，该模型的p＜0.0001，说明该模型具有高度的显著性。从表6可知，该回归方程的相关系数R2= 0.9965，说明该模型拟合度较好，可以真实的描述各个影响因子与响应值之间的关系。同时，失拟项不显著，说明回归方程与实际情况吻合的较好，实验误差小，因此可用该回归方程较好的分析和预测最佳提取条件。
表5 响应面试验设计及试验结果
2.5 响应面优化及模型验证
通过对上述试验结果的分析，可以预测黑色素最优提取条件及提取得率，由回归系数的显著性检验可知（表6），模型的一次项A、B、C影响极显著（p≤0.001），二次项A2、C2、B2影响极显著（p≤0.001），交互项AB、AC、BC影响极显著（p≤0.001）；根据一次项系数的绝对值可知，各因素对黑木耳黑色素提取得率的影响主次顺序依次为超声功率>超声时间>NaOH浓度。
根据回归分析结果绘制响应曲面，以确定NaOH浓度、超声功率和超声时间对黑木耳黑色素提取得率的影响（图4）。通过该模型预测的最优提取条件为：NaOH浓度1.27mol/L、超声功率308.93W、超声时间51.75min，在最优提取条件下，预测的黑木耳黑色素提取得率可达10.36%。
为验证模型预测的准确性，实验对预测的参数进行了验证，为便于实际试验操作，我们对超声功率和超声时间参数进行了取整，最终实际的提取条件为NaOH浓度1.27mol/L、料液比1:40 g/ml、超声功率300W、超声时间52min、超声温度60℃，在此条件下重复3次实验，3次实验提取率的平均值为10.48±0.10%，与理论预测值的相对误差在±1.16%内，由此可知，模型预测值和实际值之间有较好的拟合性，能够较好的预测和分析不同条件下黑木耳黑色素提取得率的变化。
表6 回归模型的方差分析及显著性检验
2.6 纤维素酶-超声波协同提取法与超声波法、浸提法和酶解法提取黑色素得率比较
为了验证纤维素酶-超声波协同提取法对黑木耳黑色素提取得率的促进作用，在进行最优条件验证的同时，还设置了单一的超声波组、浸提组和纤维素酶组进行对比（在实验条件控制上，除需要对比的条件不同外，各组其它条件均相同）。实验结果显示（图5），单一的超声波法黑色素的提取得率为9.28±0.12%，浸提法黑色素提取得率为7.13±0.23%，纤维素酶酶解法的黑色素提取得率为9.12±0.38%。纤维素酶-超声波协同提取法的黑色素提取得率相比于超声波法、浸提法和纤维素酶酶解法分别提高了12.93%、46.98%和14.91%，表明纤维素酶-超声波协同提取法可以有效的提高黑木耳黑色素提取得率。
2.7 纤维素酶-超声波协同提取的黑木耳黑色素抗氧化活性分析
实验进一步对纤维素酶-超声波协同提取的黑色素与未加纤维素酶提取的黑色素抗氧化活性进行了对比分析。实验结果显示，采用纤维素酶-超声波协同提取的黑色素相比于未加纤维素酶提取的黑色素清除ABTS、DPPH和羟基自由基的能力更强（图6），表明纤维素酶-超声波协同提取工艺是提取活性黑木耳黑色素的有效方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种利用纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将干燥的黑木耳子实体粉碎，过80目标准筛，备用；
（2）精确称取黑木耳子实体粉末1.00g溶于一定pH和料液比1:20 g/ml的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液中，摇匀，加入一定量的纤维素酶，在适宜的温度下水浴反应一段时间，反应结束后，10000r/min离心5min，去除上清液，保留沉淀物；
（3）在步骤（2）得到的沉淀物中，按一定料液比加入NaOH溶液，在一定的超声功率和超声温度下提取黑木而黑色素，提取结束后，于10000r/min离心5min，收集上清液，得黑色素提取液；
（4）将黑色素提取液用HCl调节pH=1.5，80℃水浴10h，10000r/min离心3min，收集沉淀，将沉淀依次用蒸馏水、体积浓度95%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚和体积浓度75%乙醇洗至溶液无色，6000r/min离心去除清洗溶剂，将沉淀用NaOH溶解，再用HCl调节pH=1.5，重新沉淀，离心收集沉淀，将沉淀用0.1M NaOH复溶，接着用0.1M HCl调节pH至中性，溶液流水透析48h，冷冻干燥，得干燥的黑木耳黑色素纯品。
2.根据权利要求1所述的一种利用纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的方法，其特征在于，步骤（2）中酶添加量12mg，酶解温度40℃，酶解pH5.0，酶解时间120min。
3.根据权利要求1所述的一种利用纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的方法，其特征在于，步骤（3）中NaOH浓度1.27mol/L，料液比1:40 g/ml，超声功率300W，超声时间52min，超声温度60℃。
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