CN110204924A - 一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法 - Google Patents

一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种辐照‑酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，该方法包括将食用菌干燥粉碎后进行低剂量γ射线处理，然后加水进行复合酶酶解，酶解液经非热高压提取处理后，除去不溶物得提取液；提取液经调节pH、浓缩、水浴后，离心收集沉淀，获得黑木耳黑色素粗品。相对于传统方法，本发明使得提取黑木耳黑色素的时间大大缩短至5h以内，同时显著提高了黑木耳黑色素的溶出率，从而大幅度提高了产品收率，并且制备的黑色素稳定性和生物活性高，有利于商业化应用。

Description

一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法
技术领域
本发明属于食用菌深加工技术领域，具体而言，涉及一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法。
背景技术
黑色素是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的天然色素，通常呈黑色或褐色。现代研究发现黑色素是由吲哚或酚类化合物氧化聚合而成的非均质高分子化合物，其具有分子量高、结构复杂等特点。此外，研究表明天然黑色素具有多种生理活性，如清除DPPH自由基、清除超氧阴离子自由基、清除羟自由基、保护生物大分子、抑制流感病毒、延缓衰老、延缓油脂酸败和抗紫外线等。目前，天然黑色素已广泛应用于饮料、糖果、糕点、巧克力、果酱等食品工业以及黑发剂、防晒霜、面膜等化工领域。
黑木耳(Auricularia auricula)是我国传统的食药两用菌，具有益气强身、补气血、润肺、止血、止痛、通便等功效，被誉为“菌中之冠”。黑木耳营养丰富，含有多种生物活性成分，其中黑色素是黑木耳中最重要的功效成分之一。目前，黑木耳黑色素主要是从黑木耳子实体中获得。但黑木耳人工栽培存在生产周期长，劳动强度大，产量及质量受气候等因素的影响；此外，需要繁琐的浸提工艺以及提取率低下等，这些都是黑木耳黑色素的应用和商业化受限制的因素。
由于黑木耳黑色素只溶于碱溶液，因此在传统上常采用氢氧化钠提取黑色素。何长川等人采用浸提法对黑木耳黑色素提取工艺进行了研究，结果表明其黑色素粗品提取率可达到6.90％(黑木耳黑色素提取纯化及性质研究，青岛农业大学，优秀硕博士论文，2011年)；张艳荣等人采用超声波辅助法提取了黑木耳黑色素，其黑色素粗品提取率达到了9.11％(木耳黑色素碱法提取工艺优化及表征，《食品科学》，2016年12期)；中国专利CN109549959A公开了一种纤维素酶与超声波协同提取黑木耳黑色素的工艺，经过近13小时的超长时间处理，粗品提取率能达到10.48％。
通过检索国内外现有技术发现，目前已公开的工艺有的存在提取率较低的问题，有的提取物生物活性被破坏，有的虽然提取率较高，但是耗时较长，不利于工业化生产。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法。采用该方法大大提高了黑木耳黑色素的溶出率和纯度，制备的黑色素稳定性好，生物活性高。
为了实现本发明的目的，发明人在前期研究中意外发现，低剂量的辐照可以提高黑木耳黑色素的提取率和纯度，进一步地，本发明人将结合低剂量辐照处理、复合酶解技术破坏黑木耳子实体细胞壁和细胞膜，并利用非热高压设备促使黑色素溶出，大大提高了黑色素的提取率并节约了提取时间。
具体地，本发明的技术方案概况如下：一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，该方法包括如下步骤：
(1)将黑木耳原料干燥、粉碎并过筛，所得料粉放入60Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为4～8kGy；
(2)取辐照后的料粉，加入10～30倍量的热水浸泡，使粉末充分吸水膨胀，调节pH值为5.8～6.2，加入复合酶，酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶80～150万U、纤维素酶10～20万U及果胶酶30～60万U，35～37℃条件下酶解1～2h；
(3)用NaOH调节酶解液pH至10～12，然后将酶解液真空密封，放入非热高压装置的反应釜内，设置温度40～60℃，压力200～600MPa，处理时间为10～30min；
(4)非热高压提取结束后，提取液8000～12000r/min离心4～8min，收集上清液，加酸液调节pH至1.4～1.6，将上清液浓缩后，86～92℃水浴1～2h，完成后8000～12000r/min离心4～8min，收集沉淀，获得黑木耳黑色素粗品。
进一步优选地，上述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，还包括所述黑木耳黑色素粗品的纯化步骤：将黑色素粗品用pH7.8～8.2的NaOH溶液溶解，向溶解液中加入1～3倍体积的氯仿-异戊醇混合液，所述的混合液中氯仿：异戊醇的体积比为1:5，剧烈摇晃混匀，完成后3800～4200r/min离心收集沉淀；沉淀用盐酸溶液调节pH至1.9～2.1，再次3800～4200r/min离心收集沉淀，即得黑色素纯品。
进一步优选地，上述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其中步骤(1)中粉碎后的黑木耳原料过80～160目筛。
进一步优选地，上述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其中步骤(1)中辐照强度为4～6kGy。
进一步优选地，上述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其中步骤(2)中酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶90～120万U、纤维素酶12～15万U及果胶酶45～55万U。
进一步优选地，上述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其中步骤(3)中设置温度48～50℃，压力460～500MPa，处理时间为20～25min。
进一步优选地，上述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其中步骤(4)中所述的酸液为盐酸溶液。
再进一步优选地，上述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其中所述的黑木耳黑色素粗品的纯化步骤为：将黑色素粗品用pH7.8～8.2的NaOH溶液溶解，向溶解液中加入1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，所述的混合液中氯仿：异戊醇的体积比为1:5，剧烈摇晃混匀，完成后3800～4200r/min离心收集沉淀；沉淀用盐酸溶液调节pH至2.0，再次3800～4200r/min离心收集沉淀，即得黑色素纯品。
与现有技术相比，本发明将黑木耳原料采用低剂量γ射线(60Co)处理，并结合生物酶复合酶解、非热高压技术，使黑木耳黑色素的提取方法具有如下优点和显著进步性：
(1)从原料到黑色素纯品，提取时间大幅度缩短至5h以内；
(2)低剂量辐照处理协同非热高压技术，显著提高了黑木耳黑色素的溶出率，从而大幅度提高了产品收率。
(3)制备的黑色素稳定性和生物活性高，有利于商业化应用。
附图说明
图1提取的黑木耳黑色素扫描电镜图(a：×1000，b：×5000)；
图2黑木耳黑色素粒径分布图；
图3纯化后的黑木耳黑色素红外光谱；
图4纯化后的黑木耳黑色素紫外光谱图；
图5黑木耳黑色素在不同溶液中的溶解情况，其中，1-12号管依次为蒸馏水、1mol/L盐酸、1mol/L氯化钠、磷酸盐缓冲液(pH8.0)、无水乙醇、甲醇、丁醇、氯仿、二甲基亚砜、1mol/L氢氧化钠溶液、石油醚、乙酸乙酯；
图6温度(a)、光照(b)、氧化剂(c)、还原剂(d)和金属离子(e)对黑木耳黑色素的稳定性的影响；
图7黑木耳黑色素抗氧化活性(a：DPPH清除活性，b：OH·清除活性，c：还原力)。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明进行详细描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，但并不以任何方式限制本发明。在不背离本发明的技术解决方案前提下，凡是利用本发明说明书内容所作的、本领域普通科技人员易于实现的任何改动或改变都将包括在本发明的专利保护范围内。
实施例1
利用响应面法对未经辐照处理的黑木耳菇粉提取参数(料液比、压力大小、超高压处理时间)进行优化。提取方法如下：
将黑木耳原料干燥、粉碎并过80目筛子，取料粉，加入25-35倍热水浸泡，使粉末充分吸水膨胀，调节pH值为6.0，加入复合酶，酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶100万U、纤维素酶15万U及果胶酶50万U，37℃条件下酶解2h；用NaOH调节酶解液pH至10，完成后用聚乙烯塑料袋将酶解液真空密封，包装好后放入非热高压装置的反应釜内，设置反应温度50℃，压力400-600MPa，处理时间为15-25min；提取结束后，提取液10000r/min离心5min，收集上清液，用HCl调节pH至1.5，将上清液浓缩后，90℃水浴2h，完成后10000r/min离心5min，收集沉淀，获得黑木耳黑色素粗品，统计提取率。
表1：Box-Behnken试验因素与水平
表2：响应面试验设计及试验结果
表3：回归模型的方差分析及显著性检验
R2＝0.9841,R2 Adj＝0.9636,C.V.％＝1.44.
a***(p<0.001),**(p<0.01),*(p<0.05).
通过对上述试验结果的分析，可以预测黑色素最优提取条件及提取得率，由回归系数的显著性检验可知(表3)，模型的一次项B、C影响极显著(p≤0.001)，二次项A2、B2影响极显著(p≤0.001)，C2影响显著(p≤0.05)，交互项AB、AC、BC影响不显著(p>0.05)；根据一次项系数的绝对值可知，各因素对黑木耳黑色素提取得率的影响主次顺序依次为超高压压力>处理时间>料液比。
根据回归分析结果绘制响应曲面，以确定超声压力、处理时间、料液比对黑木耳黑色素提取得率的影响。通过该模型预测的最优提取条件为：超高压压力464.09MPa，处理时间22.28min，料液比1:30.19。在最优提取条件下，预测的黑木耳黑色素提取得率可达8.1％。为验证模型预测的准确性，实验对预测的参数进行了验证，为便于实际试验操作，我们对相关参数进行了取整，最终实际的提取条件为超高压压力500MPa，处理时间23min，料液比1:30，在此条件下重复3次实验，3次实验提取率的平均值为8.28±0.20％。由此可知，模型预测值和实际值之间有较好的拟合性，能够较好的预测和分析不同条件下黑木耳黑色素提取得率的变化。
实施例2
将黑木耳原料干燥、粉碎并过80目筛子，取100g料粉放入60Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为6kGy；取辐照后的料粉，加入30倍量的热水浸泡，使粉末充分吸水膨胀，调节pH值为6.0，加入复合酶，酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶100万U、纤维素酶15万U及果胶酶50万U，37℃条件下酶解2h；用NaOH调节酶解液pH至10，完成后用聚乙烯塑料袋将酶解液真空密封，包装好后放入非热高压装置的反应釜内，设置反应温度50℃，压力500MPa，处理时间为23min；提取结束后，提取液10000r/min离心5min，收集上清液，用HCl调节pH至1.5，将上清液浓缩后，90℃水浴2h，完成后10000r/min离心5min，收集沉淀，获得黑木耳黑色素粗品10.3g，提取率10.30％。
实施例3
将实施例2得到的黑木耳黑色素粗品，用pH8.0的NaOH溶液溶解，向溶解液中加入一倍体积的氯仿：异戊醇(1:5)剧烈摇晃混匀，完成后4000r/min离心收集沉淀(重复操作3次)；沉淀用1mol/LHCl溶液调节pH至2.0，再次4000r/min离心收集沉淀，即得黑色素纯品。以该纯品为实验原料，开展黑木耳黑色素理化性质实验。
(1)木耳黑色素扫描电镜观察：取少量黑色素粉末均匀粘在导电胶上，喷金制样后进行扫描电子显微观察，操作电压为5kV。
黑木耳黑色素微观结构如图1所示，其表面为比较致密且粗糙的形态，未见孔道结构，但表面有一些孔洞。
(2)木耳黑色素粒径测定：取一定量纯化的黑木耳黑色素，用0.1M的氢氧化钠溶液溶解后，用纳米颗粒分析仪(Brookhaven 90Plus)上测定纯化黑色素的平均直径。
黑木耳黑色素粒径分析结果如图2所示，扫描图里出现三个不同的峰，分别在200nm、1000nm、8000nm处各有一个峰，其中在1000nm处，峰面积为17％，其余两个峰面积都小于4％，这表明我们纯化的黑木耳黑色素粒径大部分在1000nm左右。Hou等研究发现粗毛纤孔菌(Inonotus hispidus)黑色素粒径大约在100nm左右，这表明黑色素粒径大小可能与食用菌种属有关。
(3)木耳黑色素红外光谱测定：采用溴化钾压片法，按1∶200的比例将烘干至恒质量的木耳黑色素和溴化钾粉末，混合均匀研成粉末，将粉末压成薄厚均匀、透明度高的薄片。在500～4000cm－1范围内进行红外光谱扫描。
黑木耳黑色素红外光谱分析结果如图3所示，在波数3398cm-1处都有较宽而强的吸收峰，说明存在-OH和-NH结构，吸收峰宽而强可能由于-OH和-NH之间的氢键连接；波数2924cm-1与2854cm-1处的吸收峰是由于C－H伸缩振动形成，即为-CH和-CH2的共振吸收峰。1711cm-1处的吸收峰是自由羧基基团－COOH引起的振动；1655cm-1处吸收峰是C＝O的非对称振动及N－H变角振动形成，说明可能存在－COOH；1315cm-1处吸收峰是C－CH3的弯曲和骨架振动吸收参与形成；600～700cm-1范围的吸收带很弱，表明苯环被取代，形成共轭体系。根据红外谱图的类似性可将黑木耳黑色素归为3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)类黑色素。
(4)木耳黑色素紫外光谱测定：称取1.00g木耳黑色素，加入到0.1M的氢氧化钠溶液中，60℃水浴加热并搅拌，维持30min，使色素完全溶解，然后3000r/min离心10min，取上清液在200～600nm的波长范围内进行紫外光谱扫描。
将木耳黑色素在200～600nm内进行紫外光谱扫描，结果见图4，在210nm波长处有最大吸收峰，与相关报道中黑色素的最大吸收峰在210nm左右一致。光谱在紫外区域吸收力最强，从210nm处开始，随着波长的不断提高，吸光度表现出下降趋势，这是黑色素紫外吸收图像的典型特点。在紫外扫描的过程中没有其他杂峰出现，说明本实验采用的提取与纯化方法收到良好效果。
(5)木耳黑色素溶解性分析：分别称取0.01g纯化黑木耳黑色素置于试管中，在室温条件下(20℃)分别加入蒸馏水、1mol/L盐酸、1mol/L氯化钠、磷酸盐缓冲液(pH8.0)、无水乙醇、甲醇、丁醇、氯仿、二甲基亚砜、1mol/L氢氧化钠溶液、石油醚、乙酸乙酯各10mL搅拌混匀，静置30min，观察其在溶液中的溶解性和溶液的颜色。
如图5所示，黑木耳黑色素在不同溶剂中的溶解性不同。经研究，黑木耳黑色素不溶于蒸馏水、1mol/L盐酸、1mol/L氯化钠、磷酸盐缓冲液(pH8.0)、无水乙醇、甲醇、丁醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯等溶剂中，微溶于二甲基亚砜溶液，能够完全溶解在1mol/L氢氧化钠溶液。
(6)木耳黑色素稳定性分析：①温度的影响：将0.1g木耳黑色素用1mol/L的氢氧化钠溶液定容至1L，分别置于0、20、40、60、80、100℃不同条件下，于暗处放置，每个1h取样1次，等温度恢复至室温条件，在波长212nm处测定吸光度；②光照的影响：将0.1g木耳黑色素用1mol/L的氢氧化钠溶液定容至1L，分别置于暗处(对照)、自然光照和白炽灯下照射，每隔1h取样一次测定吸光度；③氧化剂的影响：配制质量分数为0.03％、0.30％和3.00％的H2O2溶液，分别量取2mL加入到8mL木耳黑色素溶液中，于室温暗处放置，每隔1h测定吸光度，对照组中将H2O2溶液换成蒸馏水；④还原剂的影响：配制质量分数为0.02％、0.20％和2.00％的亚硫酸钠溶液，分别量取2mL加入到8mL木耳黑色素溶液中，于室温暗处放置，每隔1h测定吸光度，对照组中将亚硫酸钠溶液换成蒸馏水；⑤金属离子的影响：将0.5mg木耳黑色素溶解在10mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液中，该溶液分别含有0.01mol/L的Ca2+、Fe2+、Zn2+、Na2+、Al3 +、K+、Mg2+、Fe3+和Cu2+，每隔12h测定吸光度。
如图6所示，本发明制备的黑木耳黑色素对温度、光照不敏感；在低浓度氧化剂(≤0.3％H2O2溶液)中稳定性较好，在3％H2O2溶液发生部分降解；黑木耳黑色素对还原剂不敏感，在3％亚硫酸钠溶液中降解较少；Ca2+、Zn2+、Al3+、K+等金属离子对黑木耳黑色素稳定性几乎无影响。
(7)木耳黑色素抗氧化分析：①DPPH自由基清除能力：分别吸取2.0mL不同浓度的样品溶液加入2.0mL 0.2mmol/LDPPH溶液中，充分混匀后25℃避光反应30min，于517nm处测定吸光值。根据下列公式计算黑木耳黑色素对DPPH自由基的清除率：DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A样品-A对照)/A空白]×100；②羟自由基清除能力：分别吸取0.1mL不同浓度的样品溶液加入0.5mL 1.5mmol/LFeSO4溶液和0.15mL 0.02mol/L水杨酸钠溶液，充分混匀过程中再加入0.35mL3.0％(V/V)H2O2溶液，37℃反应30min后于562nm处测定吸光值。根据下列公式计算黑木耳黑色素对羟自由基的清除率：羟自由基清除率(％)＝[1-(A样品-A对照)/A空白]×100；③还原力：取黑色素溶液1mL，依次加入3mL 0.5M磷酸盐缓冲液(pH6.6)和2.5mL 1％六氰合铁酸钾溶液，50℃保温20min，再加入2.5mL 10％三氯乙酸溶液，3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸馏水，0.5mL 0.1％三氯化铁溶液，静置10min，700nm下测定吸光度值。
如图7所示，在一定浓度范围内，黑木耳黑色素对DPPH自由基清除能力、对羟自由基清除能力以及还原力随着浓度的增大而成正比例上升。其中黑木耳黑色素对DPPH自由基清除能力较强，在1mg/mL时，可清除80％左右DPPH自由基；而在1mg/mL时，对羟自由基清除能力也达到60％以上。实验结果表明本发明制备的黑木耳黑色素具有较强的抗氧化性。
对比例1(无辐照处理)
将黑木耳原料干燥、粉碎并过80目筛子，取100g料粉加入30倍量的热水浸泡，使粉末充分吸水膨胀，调节pH值为6.0，加入复合酶，酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶100万U、纤维素酶15万U及果胶酶50万U，37℃条件下酶解2h；用NaOH调节酶解液pH至10，完成后用聚乙烯塑料袋将酶解液真空密封，包装好后放入非热高压装置的反应釜内，设置反应温度50℃，压力500MPa，处理时间为23min；提取结束后，提取液10000r/min离心5min，收集上清液，用HCl调节pH至1.5，将上清液浓缩后，90℃水浴2h，完成后10000r/min离心5min，收集沉淀，获得黑木耳黑色素粗品7.8g，提取率7.80％。
对比例2(高剂量辐照处理)
将黑木耳原料干燥、粉碎并过80目筛子，取100g料粉放入60Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为18kGy；取辐照后的料粉，加入30倍量的热水浸泡，使粉末充分吸水膨胀，调节pH值为6.0，加入复合酶，酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶100万U、纤维素酶15万U及果胶酶50万U，37℃条件下酶解2h；用NaOH调节酶解液pH至10，完成后用聚乙烯塑料袋将酶解液真空密封，包装好后放入非热高压装置的反应釜内，设置反应温度50℃，压力500MPa，处理时间为23min；提取结束后，提取液10000r/min离心5min，收集上清液，用HCl调节pH至1.5，将上清液浓缩后，90℃水浴2h，完成后10000r/min离心5min，收集沉淀，获得黑木耳黑色素粗品6.8g，提取率6.80％。
对比例3(无复合酶酶解处理)
将黑木耳原料干燥、粉碎并过80目筛子，取100g料粉放入60Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为6kGy；取辐照后的料粉，加入30倍量的热水浸泡，使粉末充分吸水膨胀，用NaOH调节混合液pH至10，完成后用聚乙烯塑料袋将酶解液真空密封，包装好后放入非热高压装置的反应釜内，设置反应温度50℃，压力500MPa，处理时间为23min；提取结束后，提取液10000r/min离心5min，收集上清液，用HCl调节pH至1.5，将上清液浓缩后，90℃水浴2h，完成后10000r/min离心5min，收集沉淀，获得黑木耳黑色素粗品8.4g，提取率8.40％。
对比例4(无高压处理)
将黑木耳原料干燥、粉碎并过80目筛子，取100g料粉放入60Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为6kGy；取辐照后的料粉，加入30倍量的热水浸泡，使粉末充分吸水膨胀，调节pH值为6.0，加入复合酶，酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶100万U、纤维素酶15万U及果胶酶50万U，37℃条件下酶解2h；用NaOH调节酶解液pH至10，10000r/min离心5min，收集上清液，用HCl调节pH至1.5，将上清液浓缩后，90℃水浴2h，完成后10000r/min离心5min，收集沉淀，获得黑木耳黑色素粗品5.8g，提取率5.8％。

Claims (8)

1.一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将黑木耳原料干燥、粉碎并过筛，所得料粉放入60Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为4～8kGy；
(2)取辐照后的料粉，加入10～30倍量的热水浸泡，使粉末充分吸水膨胀，调节pH值为5.8～6.2，加入复合酶，酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶80～150万U、纤维素酶10～20万U及果胶酶30～60万U，35～37℃条件下酶解1～2h；
(3)用NaOH调节酶解液pH至10～12，然后将酶解液真空密封，放入非热高压的反应釜内，设置温度40～60℃，压力200～600MPa，处理时间为10～30min；
(4)非热高压提取结束后，提取液8000～12000r/min离心4～8min，收集上清液，加酸液调节pH至1.4～1.6，将上清液浓缩后，86～92℃水浴1～2h，完成后8000～12000r/min离心4～8min，收集沉淀，获得黑木耳黑色素粗品。
2.根据权利要求1所述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其特征在于，还包括所述黑木耳黑色素粗品的纯化步骤：将黑色素粗品用pH7.8～8.2的NaOH溶液溶解，向溶解液中加入1～3倍体积的氯仿-异戊醇混合液，所述的混合液中氯仿：异戊醇的体积比为1:5，剧烈摇晃混匀，完成后3800～4200r/min离心收集沉淀；沉淀用盐酸溶液调节pH至1.9～2.1，再次3800～4200r/min离心收集沉淀，即得黑色素纯品。
3.根据权利要求1所述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其特征在于，步骤(1)中粉碎后的黑木耳原料过80～160目筛。
4.根据权利要求1所述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其特征在于，步骤(1)中辐照强度为4～6kGy。
5.根据权利要求1所述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其特征在于，步骤(2)中酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶90～120万U、纤维素酶12～15万U及果胶酶45～55万U。
6.根据权利要求1所述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其特征在于，步骤(3)中设置温度48～50℃，压力460～500MPa，处理时间为20～25min。
7.根据权利要求1所述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的酸液为盐酸溶液。
8.根据权利要求2所述的一种辐照-酶解辅助非热高压法制备黑木耳黑色素的方法，其特征在于，所述的黑木耳黑色素粗品的纯化步骤为：将黑色素粗品用pH7.8～8.2的NaOH溶液溶解，向溶解液中加入1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，所述的混合液中氯仿：异戊醇的体积比为1:5，剧烈摇晃混匀，完成后3800～4200r/min离心收集沉淀；沉淀用盐酸溶液调节pH至2.0，再次3800～4200r/min离心收集沉淀，即得黑色素纯品。
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