CN114181919A

CN114181919A - 一种提高淀粉分支酶热稳定性的方法

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Publication number: CN114181919A
Application number: CN202210019805.5A
Authority: CN
Inventors: 李兆丰; 范文娟; 班宵逢; 顾正彪; 李才明; 程力; 洪雁
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN114181919B

Abstract

本发明公开了一种提高淀粉分支酶热稳定性的方法，属于酶工程技术领域。为了得到一种较高温度下保持较高的活力，及在高盐、高温条件下保持较高活力的淀粉分支酶，本发明提供了一种淀粉分支酶突变体，所述淀粉分支酶突变体是将来源于热葡糖苷酶地衣芽孢杆菌的淀粉分支酶的第137位或第123位的氨基酸进行突变得到的。与野生型淀粉分支酶相比，本发明所得的淀粉分支酶突变体K137E在60℃的半衰期比野生型提高了71％。在高盐条件下，本发明所得的淀粉分支酶突变体D123E和D123R在55℃时保温120min分别保持80％和65％左右的活力，在60℃下的半衰期分别延长了接近3.3和2.1倍。

Description

一种提高淀粉分支酶热稳定性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高淀粉分支酶热稳定性的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme；EC 2.4.1.18)是属于糖苷水解酶家族13(GH 13)的一类糖基转移酶，能够催化淀粉分子中α-1,4-糖苷键的断裂，再通过转糖苷作用将切割下的短链以α-1,6-糖苷键的形式连接于受体链上，在淀粉分子原主链上形成新的α-1,6-分支点。淀粉分支酶可以通过这种转糖基反应增加淀粉的分支度，改变淀粉分子中直链/支链比例，从而提高淀粉的抗消化性和慢消化性，延缓淀粉的回生过程，增强淀粉的稳定性并改善淀粉的使用性能，可用于生产具有良好应用价值的淀粉衍生物。

在淀粉改性过程中，淀粉分支酶的热稳定性是一个关键因素，淀粉分支酶的热稳定性增强不仅有利于延长酶的贮藏时间、减少酶在保存、运输过程中活力的损失，还可以使得其在较高温度下保持较高的活力，从而提高反应效率，缩短生产周期，进而降低生产成本。

发明内容

由于现有技术当中，一些反应是需要在高盐、高温条件下进行的，因此，得到一种能够在高盐条件下，具有较高的热稳定性的突变体，对于工业生产具有重要的意义。

为了得到一种较高温度下保持较高的活力，及在高盐、高温条件下保持较高活力的淀粉分支酶，本发明提供了一种淀粉分支酶突变体，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第137位或第123位的氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示的淀粉分支酶的第137位的赖氨酸突变为谷氨酸，命名为：K137E。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示的淀粉分支酶的第123位的天冬氨酸突变为精氨酸，命名为：D123R，该突变体能够在高盐条件下，具有较高的热稳定性。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示的淀粉分支酶的第123位的天冬氨酸突变为谷氨酸，命名为：D123E，该突变体能够在高盐条件下，具有较高的热稳定性。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶来源于热葡糖苷酶地衣芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidans STB02)。

在本发明的一种实施方式中，编码上述淀粉分支酶亲本酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供了一种编码上述淀粉分支酶突变体的基因。

本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是商业载体pET-20b(+)为表达载体。

本发明还提供了一种表达上述突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。

本发明还提供了一种提高高盐条件下淀粉分支酶热稳定性的方法，所述方法为，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第123位的天冬氨酸进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示的淀粉分支酶的第123位的天冬氨酸突变为精氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示的淀粉分支酶的第123位的天冬氨酸突变为谷氨酸。

本发明还提供了一种提高淀粉分支酶热稳定性的方法，所述方法为，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第137位的赖氨酸进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第137位的赖氨酸突变为谷氨酸。

本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在水解淀粉方面的应用。

本发明还提供了携带上述基因的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-20b(+)为表达载体，以Escherichia coli BL 21(DE3)为表达宿主。

本发明提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在制备淀粉水解产品方面的应用。

有益效果

(1)与野生型淀粉分支酶相比，本发明所得的淀粉分支酶突变体K137E在60℃的半衰期t_1/2(min，60℃)为72.1min，比野生型提高了71％。

(2)本发明对提高酶的工业应用价值具有非常重要的意义，且本发明操作简单、安全无毒，具有良好的可遗传性，应用前景良好。

(3)在高盐条件下，野生型淀粉分支酶在55℃时的半衰期为85min，而本发明所得的淀粉分支酶突变体D123E和D123R在55℃时保温120min分别保持80％和65％左右的活力，在60℃下的半衰期t_1/2(min，60℃)分别延长了接近3.3和2.1倍。

附图说明

图1：本发明实施例中淀粉分支酶突变体及野生型淀粉分支酶的SDS-PAGE凝胶图，其中，A为突变体D123R、D123E的SDS-PAGE凝胶图；B为突变体K137E、Q73D的SDS-PAGE凝胶图。

图2：本发明实施例中淀粉分支酶突变体及野生型淀粉分支酶在60℃的热稳定性曲线。

图3：本发明实施例中淀粉分支酶突变体及野生型淀粉分支酶在55℃的热稳定性曲线。

图4：本发明实施例中淀粉分支酶突变体及野生型淀粉分支酶的内源荧光光谱。

图5：本发明实施例中淀粉分支酶突变体及野生型淀粉分支酶处理直链淀粉形成的淀粉-碘复合物的吸光度谱；其中，A为野生型淀粉分支酶处理直链淀粉形成的淀粉-碘复合物的吸光度谱；B为突变体D123R处理直链淀粉形成的淀粉-碘复合物的吸光度谱；C为突变体D123E处理直链淀粉形成的淀粉-碘复合物的吸光度谱。

图6：本发明实施例中淀粉分支酶突变体及野生型淀粉分支酶的最适反应pH。

图7：本发明实施例中淀粉分支酶突变体及野生型淀粉分支酶改性麦芽糊精溶液储存不同时间的实时状态图。

图8：本发明实施例中淀粉分支酶突变体及野生型淀粉分支酶改性前后麦芽糊精溶液的透明度稳定性。

具体实施方式

本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

LB固体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，1.5％(w/v)琼脂。

TB液体培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，KH₂PO₄ 17mM，K₂HPO₄72mM，pH 7.0。

下述实施例所涉及的检测方法如下：

淀粉分支酶热稳定性的分析方法：

将淀粉分支酶在一定温度下保温不同时间，取样，迅速冷却至0℃，测定酶的残余活力，以未保温酶液的活力为100％，绘制相对酶活-时间曲线。

淀粉分支酶活力的测定方法：

用990μL浓度为10mM磷酸缓冲液(pH 7.5)配制0.25％(w/v)的马铃薯支链淀粉溶液，加入10μL淀粉分支酶后混合均匀并置于50℃水浴条件下准确反应15min。反应结束后沸水浴灭酶。取300μL反应混合液加入5.0mL显色液(0.05％(w/v)KI，0.005％(w/v)I₂，pH7.5)混匀后与室温下避光显色15min。显色15min后在530nm处测定吸光值。

一个酶活力单位定义为：在530nm处，吸光值每分钟降低1％所需加入酶的量为一个酶活力单位。

实施例1：表达淀粉分支酶突变体基因序列的制备

(1)以表达载体pET-20b(+)-gbe(所述gbe核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，表达载体pET-20b(+)-gbe的构建方法记载于公开号为CN105950579B的中国发明专利文本)为模板，设计实验所需的互补引物链(见表1)，引物由金唯智生物科技有限公司合成，参照TaKaRa公司STAR Primer GXL试剂盒说明书所示方法进行定点突变。

表1淀粉分支酶突变位点的引物序列

引物	引物序列(5'-3')<sup>1</sup>
		K137E-Rev	gacgg<u>gag</u>aaacagcgaaagcga
K137E-For	gttt<u>ctc</u>ccgtcgccatgt
		Q73D-Rev	taat<u>gac</u>ggtgtatggacg
Q73D-For	acacc<u>gtc</u>attacttacttttac
		D123R-For	tttat<u>cct</u>gtagacgatggaggcagtac
D123R-Rev	ccatcgtctac<u>agg</u>ataaaaggttatcaatgg
		D123E-For	ccatcgtctac<u>gag</u>ataaaaggttatcaatgg
D123E-Rev	tttat<u>ctc</u>gtagacgatggaggcagtac

¹下划线碱基对应于相应突变氨基酸。

其中，PCR反应体系依照STAR Primer试剂盒说明书中所设定条件：5×PrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)10μL，模板DNA 1μL，正向和反向引物(10μM)均为1μL，PrimeSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，最后加入超纯水32.5μL。

PCR扩增条件为：98℃条件下预变性5min；随后以98℃10s，55℃10s，72℃7min为一个循环，在以上条件下进行35个循环；最后4℃下保温10min。

将PCR产物用DpnI在37℃下处理2h，随后将处理好的PCR产物按照E.coli JM109感受态转化方法转入到E.coli JM109中，制备得到转化子，挑取阳性单克隆转化子接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基并于37℃下培养10～12h，提取质粒，并送公司测序，分别获得含有突变基因的重组质粒：pET-20b(+)-K137E、pET-20b(+)-Q73D、pET-20b(+)-D123R，pET-20b(+)-D123E。

实施例2：含有表达淀粉分支酶突变体基因的基因工程菌的构建及突变体的表达及分离纯化

具体步骤如下：

(1)分别将实施例1中得到的重组质粒pET-20b(+)-gbe、pET-20b(+)-K137E、pET-20b(+)-Q73D、pET-20b(+)-D123R、pET-20b(+)-D123E导入E.coli BL21(DE3)宿主感受态中，分别制备得到重组菌株：E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-gbe，E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-K137E，E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-Q73D、E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-D123R，E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-D123E；

(2)将重组菌株在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养12h，挑取阳性单菌落接种于含有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中。将该三角瓶置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养8～10h，制备得到种子液；

(3)将种子液按2％(v/v)的接种量，接种于含有50mL TB液体培养基的250mL三角瓶中，并置于回转式摇床中以200r/min的速率，在30℃下诱导48h，分别制备得到含有野生型gbe的粗酶液、含有K137E的粗酶液、含有Q73D的粗酶液、含有D123E的粗酶液、含有D123R的粗酶液。

各培养基在使用前添加终浓度为100μmg/mL的氨苄青霉素。

(4)淀粉分支酶突变体的纯化

纯化步骤如下：采用0.45μm的水系滤膜过滤淀粉分支酶粗酶液以除去大分子杂质，而后采用HisTrap TM excel镍离子亲和层析柱(5mL)完成纯化。用6倍柱体积的缓冲液A液(20mM咪唑，10mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.4)以2mL/min的流速平衡镍柱，接着流速不变，进样70mL，用8倍柱体积的缓冲液A液除去粗酶液中未与镍柱结合的物质，而后用60％(v/v)的缓冲液B液(500mM咪唑，10mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.4)以1mL/min的流速洗脱柱子，收集洗脱液(含目的蛋白)，分别将上述纯酶液进行SDS-PAGE分析，结果如图1A～图1B所示。

制备得到含有野生型gbe的纯酶液、含有Q73D的纯酶液、含有K137E的纯酶液、含有D123E的纯酶液、含有D123R的纯酶液；其中纯酶液的环境为高盐环境(缓冲液A液和B液中均含有500mM NaCl)。

(5)分别检测上述含有野生型gbe的纯酶液、含有K137E的纯酶液、含有Q73D的纯酶液、含有D123E的纯酶液、含有D123R的纯酶液的比酶活，结果如表2所示。

表2野生型和突变体GBE的酶活力

野生型/突变体	比酶活(U/mg)<sup>1</sup>
		野生型	1790.16±44.17<sup>b</sup>
K137E	1764.70±179.44<sup>b</sup>
		Q73D	1261.68±127.08<sup>a</sup>
D123E	1791.56±13.97<sup>b</sup>
		D123R	1745.30±33.61<sup>b</sup>

¹每个值为3次平行实验的平均值。

实施例3：淀粉分支酶突变体的热稳定性检测

在正常实验环境中检测突变体K137E、Q73D的热稳定性；在高盐条件下检测突变体D123E、D123R的热稳定性。

具体步骤如下：

(1)突变体K137E、Q73D的热稳定性检测

分别取0.3mL实施例2制备得到的淀粉分支酶野生型gbe的纯酶、K137E纯酶、Q73D纯酶，采用超纯水，将其稀释50倍(降低环境中的盐的浓度，其中NaCl的浓度为：10mM)后，分别取0.3mL装入离心管中，在60℃下保温一段时间，间隔一定时间取样，迅速置于冰上冷却10min，在50℃下按照淀粉分支酶活力测定方法测定酶活力，结果如表3及图2所示。

表3：突变体K137E、Q73D的热稳定性

野生型/突变体	半衰期t<sub>1/2</sub><sup>1</sup>(min，60℃)
		野生型	42.1±0.1<sup>a</sup>
K137E	72.1±0.2<sup>b</sup>
		Q73D	40.9±0.1<sup>a</sup>

¹每个值为3次平行实验的平均值。

结果显示，野生型在60℃下的半衰期为42.1min。而突变体K137E在60℃时的半衰期为72.1min，并且与野生型相比，在60℃下的半衰期t_1/2(min，60℃)延长了1.7倍。

(2)分别将0.3mL实施例2制备得到的淀粉分支酶野生型gbe的纯酶、D123E纯酶、D123R纯酶，装入离心管中(此环境为高盐条件，其中NaCl的浓度为：500mM)，分别在55℃、60℃下反应一段时间，间隔一定时间取样，在50℃下按照淀粉分支酶活力测定方法测定该种酶溶液的活力，结果如表4及图3所示。

表4：野生型和突变体D123R、D123E的的热稳定性

野生型/突变体	半衰期t<sub>1/2</sub><sup>1</sup>(min,60℃)
		野生型	7.0±0.1<sup>a</sup>
D123R	15.0±0.2<sup>b</sup>
		D123E	23.1±0.2<sup>c</sup>

¹每个值为3次平行实验的平均值。

结果显示，在高盐条件下，野生型在60℃下的半衰期为7.0min。而突变体D123E在60℃时的半衰期为23.1min，突变体D123R在60℃时的半衰期为15.0min，并且与野生型相比，在60℃下的半衰期t1/2(min,60℃)分别延长了3.32和2.1倍。

如图3所示，在高盐条件下，野生型在55℃下的半衰期为85min，，而D123E的残余活力为80％左右；D123R的残余活力为65％左右，明显高于野生型。

实施例4：淀粉分支酶突变体K137E、Q73D的三级结构变化

(1)使用100mM的氯化钠(20mM Tris-HCl，pH 7.5)稀释样品(使用超纯水稀释50倍后的实施例2得到的纯酶液)到蛋白浓度为0.1～0.2mg/mL之间，并置于1mm的比色皿。在室温下，采用F-7000型荧光分光光度计以1200nm/min的扫描速率和295nm的激发波长，在300～400nm的扫描波长范围内，并以2.5nm的激发和发射狭缝宽度条件下扫描蛋白样品，记录荧光吸收强度。以不含蛋白样品的100mM的氯化钠(20mM Tris-HCl，pH 7.5)为空白，结果如图4所示。

(2)将实施例2得到的野生型和突变型GBE纯酶液在60℃保温30min，置于冰上冰敷，测定保温前后GBE的三级结构变化，结果如图4所示。

由图4可以看出，在360nm处，出现了荧光发射峰。在60℃保温30min后，荧光增强，说明酶的三级结构逐渐发生变化。在高温处理后，蛋白质结构展开，包裹内部的荧光发射基团逐渐暴露，荧光强度增加，表明热激破坏了酶的结构。

由图4可以发现，Q73D的荧光强度最强，说明其三级结构破坏最严重，其次为野生型和K137E。该结果表明，K137E相比于野生型更能够抵抗热失活。

实施例5：淀粉分支酶突变体的底物特异性及碘结合能力

1、淀粉分支酶突变体K137E、Q73D的底物特异性

不同来源的GBE对于不同的底物具有不同的亲和力，由此导致GBE的催化效果千差万别。为了探究突变体对Gt-GBE催化能力的影响，分别以马铃薯直链淀粉和马铃薯支链淀粉作为底物，测定Gt-GBE野生型及其突变体的比酶活。具体方法如下：

(1)用990μL10 mM磷酸缓冲液(pH 7.5)配制0.25％(w/v)的马铃薯支链淀粉溶液和0.1％(w/v)的马铃薯直链淀粉溶液，分别加入10μL淀粉分支酶纯酶液后混合均匀并置于50℃水浴条件下准确反应15min，反应结束后沸水浴灭酶；

(2)灭酶后，取300μL反应混合液加入5.0mL显色液(0.05％(w/v)KI，0.005％(w/v)I₂，pH7.5)混匀后与室温下避光显色15min。显色15min后在530nm处测定吸光值。一个酶活力单位定义为：在530nm处，吸光值每分钟降低1％所需加入酶的量为一个酶活力单位，结果如表5所示。

表5野生型和突变体GBEs作用于不同底物的比酶活

结果显示，野生型Gt-GBE和突变体都更加倾向于作用支链淀粉。K137E并未改变Gt-GBE的底物特异性，但是Q73位突变改变了GBE的底物特异性，较野生型而言，Q73D更倾向于作用支链淀粉，对支链淀粉和直链淀粉的活性比值分别由1.30升至3.73。

2、淀粉分支酶突变体D123E、D123R的碘结合能力

具体步骤如下：

(1)950μL预先用50mM磷酸钠盐缓冲液(pH 7.5)配制的0.1％(w/v)马铃薯直链淀粉溶液，加入50μL酶液，在50℃下反应不同时间(0、1、2h)后，沸水浴灭酶终止反应。

(2)灭酶后，取0.3mL反应液与5.0mL碘液进行显色反应，使用扫描光谱(500～800nm)测定淀粉反应物的吸收光谱和最大吸收波长(λmax)；碘结合能力检测结果如图5A～图5C所示。

直链淀粉可以结合碘形成蓝色复合物。该络合物的吸光度及其波长的最大吸光度(λmax)可用于估计多糖的结构。酶修饰降低了淀粉链的长度，降低了它的碘结合能力。最初的淀粉-碘络合物呈λmax为620nm左右，吸光度为0.629。GBE处理降低了吸光度并改变了它的λmax，λmax向左移动(波长变短)。直链淀粉经野生型淀粉分支酶处理2h后，吸光度下降为0.469，λmax从620nm移动到600nm左右；直链淀粉经D123R处理2h后，吸光度下降为0.439，λmax从620nm移动到600nm；直链淀粉经D123E处理2h后，吸光度下降为0.472，λmax从620nm移动到600nm。在整个保温处理过程中，突变体的λmax的偏移值与野生型相比没有较大的变化，但吸光度有轻微的变化。从碘结合能力来看，突变体并没有降低淀粉分支酶的催化能力。

实施例6：淀粉分支酶突变体Q73D、K137E的最适反应pH

具体步骤如下：

(1)分别配制：浓度为50mM的(pH3～6)柠檬酸/柠檬酸钠、(pH6～8)Na₂HPO₄/NaH₂PO₄、(pH8～11)甘氨酸/氢氧化钠的缓冲溶液配置0.25％的马铃薯支链淀粉溶液；

(2)按照酶活的检测方法，在最适反应温度下，测定在不同pH的马铃薯支链淀粉溶液条件下的纯化后淀粉分支酶的活力，以酶活力最高者为100％，结果如图6所示。

从图6中可以看出，野生型Gt-GBE和突变体Q73D、K137E具有相似的最适pH(为：6.0，pH低于5.5或是高于7.0均会导致酶活力的迅速下降。

实施例7：淀粉分支酶突变体K137E的应用

分别将实施例2制备得到的野生型Gt-GBE和突变体K137E纯酶液按照0.06mg/g(按干基淀粉计算)的添加量，添加至30％(w/w)的麦芽糊精，在4℃条件下储存20天；排除底物特异性、酶浓度等其他因素的影响，探究突变体在改善麦芽糊精稳定性上的应用潜力。各麦芽糊精溶液的储存的实时状态如图7所示，其透光率随时间变化曲线如图8所示。

结果显示，原麦芽糊精在4℃下储存2天完全浑浊(透光率0.15％)，经过野生型Gt-GBE和突变体K137E改性后的麦芽糊精储存20天后仍澄清透明。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高淀粉分支酶热稳定性的方法

<130> BAA210420A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 643

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Val Val Pro Pro Thr Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Phe His Glu

1 5 10 15

Gly Ser Leu Tyr Lys Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Lys

20 25 30

Gln Asn Asp Val Val Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala

35 40 45

Arg Gln Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Asp Trp Asn Gly Thr Asn

50 55 60

Phe Asn Leu Val Lys Val Ser Asn Gln Gly Val Trp Thr Ile Phe Ile

65 70 75 80

Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile Thr Thr Ser

85 90 95

Asp Gly Asn Val Val Leu Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe His Ser Glu

100 105 110

Leu Arg Pro Arg Thr Ala Ser Ile Val Tyr Asp Ile Lys Gly Tyr Gln

115 120 125

Trp Asn Asp Gln Thr Trp Arg Arg Lys Lys Gln Arg Lys Arg Ile Tyr

130 135 140

Asp Gln Pro Leu Phe Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Met Ala Asp Glu Leu

165 170 175

Leu Pro Tyr Val Met Glu His Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro

180 185 190

Leu Val Glu His Pro Leu Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Thr Gly

195 200 205

Tyr Tyr Ser Ala Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro His Asp Leu Met His

210 215 220

Phe Ile Asp Arg Phe His Gln Ala Gly Ile Gly Val Ile Phe Asp Trp

225 230 235 240

Val Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Glu His Gly Leu Tyr Met Phe Asp

245 250 255

Gly Ala Pro Thr Tyr Glu Tyr Asp Asn Ile Gln Asp Arg Glu Asn Gly

260 265 270

Glu Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro Glu Val Arg Ser

275 280 285

Phe Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Met Glu Tyr Phe His Val Asp

290 295 300

Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Arg

305 310 315 320

Glu Ala Ala Gln Gln Asn Pro His Ala Val Gln Phe Leu Gln Lys Leu

325 330 335

Asn Glu Thr Val Phe Ala His Asp Pro Gly Ile Leu Met Ile Ala Glu

340 345 350

Asp Ser Thr Glu Trp Pro Leu Val Thr Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly

355 360 365

Leu Gly Phe Asn Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Ile Leu

370 375 380

Thr Tyr Met Glu Thr Ala Pro Glu Lys Arg Lys His Val His Asn Lys

385 390 395 400

Val Thr Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro

405 410 415

Phe Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Asn Lys

420 425 430

Met Pro Gly Thr Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr

435 440 445

Gly Tyr Leu Leu Thr His Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Gly

450 455 460

Glu Phe Ala Gln Phe Asp Glu Trp Lys Asp Ala Glu Gln Leu Asp Trp

465 470 475 480

Met Leu Phe Asp Phe Glu Met His Gln Lys Met Asn Met Tyr Val Lys

485 490 495

Ala Leu Leu Lys Cys Tyr Lys Arg Cys Lys Ser Leu Tyr Glu Leu Asp

500 505 510

His Ser Pro Asp Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln

515 520 525

Ser Ile Phe Ser Phe Val Arg Arg Gly Lys Lys Glu Asn Asp Leu Leu

530 535 540

Val Val Val Cys Asn Phe Thr Ser Lys Val Tyr His Asp Tyr Lys Val

545 550 555 560

Gly Val Pro Leu Phe Ala Lys Tyr Arg Glu Ile Ile Ser Ser Asp Ala

565 570 575

Ala Lys Phe Gly Gly Trp Gly Asn Val Asn Ala Lys Pro Val Ala Ala

580 585 590

Ser Lys Glu Pro Phe His Gly Lys Pro Tyr His Ile Arg Met Thr Val

595 600 605

Pro Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Lys Lys Arg Gly Glu

610 615 620

Arg Ser Val Asp Gly Lys Glu Lys Val His Arg His Val Ile Gly Gly

625 630 635 640

Arg Ala Arg

<210> 2

<211> 1929

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgagcgttg tccctccgac cgatctggaa atttatttat ttcacgaagg cagcttatat 60

aaaagttatg aattgtttgg cgcgcatgtg ataaaacaaa acgacgttgt cggaacccgg 120

ttttgcgtat gggctccgca tgcgcggcaa gtgcggttag tcggcagttt taatgactgg 180

aacggaacta attttaatct tgtaaaagta agtaatcaag gtgtatggac gatttttatt 240

ccggaaaact tggaagggca tttatataaa tacgaaatta ccactagcga tggaaatgtc 300

gtgttaaaag cagatccata cgcgtttcac tccgaattgc gcccccgtac tgcctccatc 360

gtctacgaca taaaaggtta tcaatggaat gaccaaacat ggcgacggaa gaaacagcga 420

aagcgaatat atgaccagcc tttgttcatt tatgagcttc acttcggttc gtggaaaaag 480

aaagaaaacg gcaattttta tacatatcgg gagatggcag atgagttact tccatacgtg 540

atggaacatg gttttaccca cattgaattg cttccgctcg ttgaacatcc gcttgaccgc 600

tcctggggat atcaaggaac aggttattat tcagcaacaa gccgctacgg gacgccgcat 660

gatttgatgc attttattga tcgcttccat caagcgggca ttggcgtcat tttcgattgg 720

gttcccggcc acttttgcaa agatgaacat ggattataca tgtttgatgg agcaccgaca 780

tacgaatatg acaacataca agatcgggaa aatggcgaat ggggcacggc gaattttgat 840

cttggcaagc cggaagtccg cagctttttg atttccaatg cgttgttttg gatggaatat 900

ttccacgtcg acggatttcg ggtggatgcg gtggccaata tgctgtattg gccaaataga 960

gaggcagcac agcaaaaccc gcatgctgtt cagtttttgc aaaaattaaa tgagaccgta 1020

tttgcgcatg acccgggcat attgatgatt gccgaagatt cgacggaatg gccgctcgtc 1080

actgctccaa cgtatgccgg agggctgggg tttaactata aatggaacat ggggtggatg 1140

aacgatattt taacatatat ggaaacggcg ccggagaagc gaaaacatgt gcacaataaa 1200

gtaacctttt cccttttgta cgcgtattcg gaaaatttta ttttaccttt ttcccacgat 1260

gaggtcgtgc atggaaaaaa atcgctgcta aataaaatgc cggggacgta tgaggaaaag 1320

tttgcacaat taaggctgct gtatgggtat ttgctaacac atcccggcaa gaaactattg 1380

tttatgggcg gcgaatttgc ccagtttgat gagtggaagg atgcagagca gctggattgg 1440

atgctttttg atttcgagat gcaccagaaa atgaatatgt acgtgaaagc attattgaaa 1500

tgttataagc gctgcaaatc tttgtatgag ctagaccatt ctccagacgg gtttgagtgg 1560

attgatgttc ataacgctga acaaagtatt ttctcatttg tccgcagagg aaaaaaagaa 1620

aacgatttgc ttgttgtcgt gtgcaatttt accagtaaag tgtatcacga ttataaagtt 1680

ggcgttccgc tatttgccaa ataccgggaa atcatcagca gcgatgcggc caaattcggg 1740

gggtggggca atgtcaatgc aaagccggtt gcggcgagca aagaaccgtt tcatggaaag 1800

ccgtatcata ttcgcatgac ggttccgccg tttggcattt ccattttaag accagtgaaa 1860

aaacgggggg agagaagcgt tgatggcaaa gaaaaagtgc atcgccatgt tattggcggg 1920

agggcaagg 1929

Claims

1.一种淀粉分支酶突变体，其特征在于，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列为SEQID NO.1所示的淀粉分支酶的第137位或第123位的氨基酸进行突变得到的。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第137位的赖氨酸突变为谷氨酸；

或，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第123位的天冬氨酸突变为精氨酸或谷氨酸。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组载体。

5.表达权利要求1或2所述突变体，或携带权利要求2所述基因，或携带权利要求3所述重组载体的重组细胞。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，以细菌或真菌为宿主细胞。

7.一种提高高盐条件下淀粉分支酶热稳定性的方法，其特征在于，将氨基酸序列为SEQID NO.1所示的淀粉分支酶的第123位的天冬氨酸突变为精氨酸或谷氨酸。

8.一种提高淀粉分支酶热稳定性的方法，其特征在于，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第137位的赖氨酸突变为谷氨酸。

9.一种水解淀粉的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的突变体，或权利要求5或6所述的重组细胞进行水解。

10.权利要求1或2所述的突变体，或权利要求3所述的基因，或权利要求4所述的重组载体，或权利要求5或6所述的重组细胞在制备水解淀粉产品方面的应用。