CN114181276A - 硫酯肽合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硫酯肽合成方法,具体工序包括:多肽酰肼溶解在含盐酸的由二甲基亚砜和水组成的混合溶剂中,在冰盐浴下与亚硝酸异戊酯反应产生酰基叠氮肽;外加过量的巯基乙酸甲酯,随后加入预先配好的碳酸氢铵调节溶液酸度至中性,使酰基叠氮肽转化为肽硫酯;向反应体系依次加入预冷的三氟乙酸和乙醚,使得硫酯肽析晶而进行分离。本发明通过低成本、操作简易快速的工序制备硫酯肽,解决了传统硫酯肽合成需要使用高成本的高效液相色谱和费时的冷冻干燥操作。
Description
技术领域
本发明涉及一种硫酯肽合成方法,通过低成本、操作简易快速的工序制备硫酯肽。
背景技术
硫酯肽是一类重要的多肽中间体,广泛运用于肽片段的连接技术中。例如,在自然化学连接技术中,硫酯肽通过与N端Cys肽的化学选择性连接,实现长片段肽的合成。在银离子催化的硫酯肽胺解中,硫酯肽与多肽的N端氨基发生连接,成功用于多肽的拼接。由于对哌啶不稳定性,硫酯肽不能通过Fmoc法直接合成,这在相当长时间限制了硫酯肽的推广运用。近期,人们发现多肽酰肼可以高效定量转化为硫酯肽。目前,多肽酰肼可以十分便捷地通过Fmoc法固相合成,成为制备硫酯重要的前体肽。
传统从多肽酰肼制备硫酯肽的方法需要使用大大过量的硫醇,并且是在水相中进行。为了去除过量的硫醇,通常需要高效液相色谱分离出硫酯肽。需要指出,反应体系中的硫醇的保留时间可能与硫酯肽重叠,可能加大硫酯肽的纯化难度。同时,由于制备色谱柱有限的肽负载量,过量的硫醇无疑会增多液相色谱分离的次数。此外,为了获得粉末状态的硫酯肽终产物,通常需要费时的冷冻干燥操作,以去除液相色谱制备中带来的流动相溶剂。液相色谱的使用造成了硫酯肽高的合成成本,也限制了硫酯肽的工业化生产。发展一种低成本、快速高效的硫酯肽制备方法将能进一步推广肽硫酯在肽连接的应用,并有望用于未来中长肽的规模化工业生产。
发明内容
本发明针对上述现有技术所存在的问题,提供了一种成本低、操作简单快速的硫酯肽合成方法。本发明提供的合成方法可以轻松获得高纯度的硫酯肽粉末,为硫酯肽的大规模化工业生产提供了一个潜在可行的方案。
本发明通过对酰肼肽转化硫酯肽过程的深入研究,结果发现通过使用特定的活化剂、硫醇分子和混合溶剂,运用四个简单的步骤可以轻松制备纯度高、粉末状态的硫酯肽。
本发明硫酯肽合成方法,包括如下步骤:
步骤1:多肽酰肼溶解在含有盐酸的二甲基亚砜和水构成的混合溶剂中,在-15℃~-5℃条件下,与过量的亚硝酸异戊酯反应,生成酰基叠氮肽;
步骤2:向步骤2的体系中加入过量巯基乙酸甲酯,随后加1.0mol/L的碳酸氢铵溶液调节溶液pH至中性(6.5~7.5),常温反应一段时间;
步骤3:向步骤2的体系中加入预冷至0℃的三氟乙酸,随后加入预冷至0℃的乙醚,使得多肽硫酯析出晶体;
步骤4:通过离心或过滤的方法获得多肽硫酯的粉末,并用乙醚洗涤得到纯度高的硫酯肽粉末。
步骤1中,所述多肽酰肼是通过固相多肽制备获得。
步骤1中,混合溶剂中二甲基亚砜和水的体积比为10:1~2:8;混合溶剂中盐酸的浓度为0.1mol/L~0.0001mol/L。
步骤1中,所述亚硝酸异戊酯的添加量为多肽酰肼当量的1~30倍。
步骤1中,与亚硝酸异戊酯的反应时间为10~30分钟。
步骤2中,所述巯基乙酸甲酯的添加量为亚硝酸异戊酯当量的5~30倍。
步骤2中,常温反应时间为10~120分钟。
步骤3中,预冷的三氟乙酸的体积为步骤2混合溶液体积的1.5~4倍。
步骤3中,预冷的乙醚的体积为三氟乙酸体积的8~30倍。
本发明方法可以用于C-末端为不同氨基酸硫酯肽的快速制备,避免使用液相色谱纯化操作和冷冻干燥步骤。对一个特定序列的多肽酰肼,利用本发明的工序制备出纯度高的硫酯肽粉末,具体步骤如下:
(1)使用含盐酸的二甲基亚砜和水混合溶剂溶解多肽酰肼,在-15℃~-5℃条件下,过量亚硝酸异戊酯将多肽酰肼转化为酰基叠氮肽;
(2)使用过量巯基乙酸甲酯将酰基叠氮肽转化为硫酯肽,并同时用1.0mol/L的碳酸氢铵溶液调节溶液pH至中性加速硫酯肽形成;
(3)使用三氟乙酸和乙醚将步骤(2)中形成的溶解在混合溶剂的硫酯肽转变为固体粉末;
(4)使用离心或过滤的方法获得多肽硫酯的粉末,并用乙醚洗涤去除体系中其它小分子杂质,获得纯度高的硫酯肽粉末。
值得注意地:
(1)不使用亚硝酸异戊酯而使用亚硝酸钠时,硫酯肽不能通过本发明的方法获得粉末状态;(2)不使用本发明中的巯基乙酸甲酯,而使用巯基乙酸钠或对巯基苯乙酸,过量的硫醇不能通过本发明的方法去除;(3)不使用本发明中的二甲基亚砜和水混合溶剂而使用N,N-二甲基甲酰胺或者四氢呋喃与水的混合溶剂,很多长肽难以溶解。
本发明硫酯肽合成方法能够通过成本低、简单快速的方法高效去除多肽酰肼转化硫酯肽操作中引入的过量硫醇和亚硝基异戊酯等有机小分子,制备出硫酯肽粉末。本发明硫酯肽合成不需要繁复的纯化操作和耗时的冷冻干燥,简化了合成工艺,节约了生产时间,极大降低了合成成本,为大规模硫酯肽生产提供了一种切实可行的方案。
附图说明
图1是Phe硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
图2是Ile硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
图3是Pro硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
图4是Gly硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
图5是Lys硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
图6是Val硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
图7是Trp硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
图8是Thr硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
图9是Cys硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
图10是Arg硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
图11是Tyr硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
图12是Glu硫酯短肽的结构式、色谱图和质谱图。
具体实施方式
以下通过具体的实例详细说明本发明技术方案的实施。注意,在没有特别注释的地方,该发明中所采用的技术术语与其所在领域内科技人员的理解是相同的。同时,与本发明中所述等同的其它任意材料同样能用于该发明的实施用。此外,本发明所论述的硫酯肽并不局限于本发明展示的硫酯肽。
本发明所使用缩写的具体含义如下表所示:
为了详细展示本发明的实施方案,我们通过合成一系列C端为不同的氨基酸的硫酯肽为例子,展示本发明的具体内容。
实施例1:合成C端为Phe的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Phe的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇的DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量697mg Fmoc-Phe-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。
Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼276mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取100mg多肽酰肼肽(1当量)溶于2.0mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入20μL的1.0mol/L的HCl,加入53μL亚硝酸异戊酯(5倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,805μL巯基乙酸甲酯(100倍当量)加入反应体系,加入56μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:6mL预冷的TFA加入反应液后,再加入80mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末45mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图1所示。
实施例2:合成C端为Ile的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Ile的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量636mg Fmoc-Ile-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。
Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼280mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取2.5mg多肽酰肼肽(1当量)溶于0.5mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入5μL的1.0mol/L的HCl,加入4.2μL亚硝酸异戊酯(15倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,62.5μL巯基乙酸甲酯(300倍当量)加入反应体系,加入14μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:1mL预冷的TFA加入反应液后,再加入15mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末1.2mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图2所示。
实施例3:合成C端为Pro的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Pro的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量606mg Fmoc-Pro-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。
Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼260mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取2.5mg多肽酰肼肽(1当量)溶于0.5mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入5μL的1.0mol/L的HCl,加入4.3μL亚硝酸异戊酯(15倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,63.5μL巯基乙酸甲酯(300倍当量)加入反应体系,加入14μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:1mL预冷的TFA加入反应液后,再加入15mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末1.2mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图3所示。
实施例4:合成C端为Gly的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Gly的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量535mg Fmoc-Gly-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。
Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼276mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取2.5mg多肽酰肼肽(1当量)溶于0.5mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入5μL的1.0mol/L的HCl,加入4.4μL亚硝酸异戊酯(15倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,66μL巯基乙酸甲酯(300倍当量)加入反应体系,加入14μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:1mL预冷的TFA加入反应液后,再加入15mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末1.2mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图4所示。
实施例5:合成C端为Lys的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Lys的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量842mg Fmoc-Lys(Boc)-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。
Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼287mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取2.5mg多肽酰肼肽(1当量)溶于0.5mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入5μL的1.0mol/L的HCl,加入4.2μL亚硝酸异戊酯(15倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,61.5μL巯基乙酸甲酯(300倍当量)加入反应体系,加入14μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:1mL预冷的TFA加入反应液后,再加入15mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末1.2mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图5所示。
实施例6:合成C端为Val的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Val的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量611mg Fmoc-Val-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。
Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼297mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取2.5mg多肽酰肼肽(1当量)溶于0.5mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入5μL的1.0mol/L的HCl,加入4.2μL亚硝酸异戊酯(15倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,63.2μL巯基乙酸甲酯(300倍当量)加入反应体系,加入14μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:1mL预冷的TFA加入反应液后,再加入15mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末1.2mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图6所示。
实施例7:合成C端为Trp的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Trp的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量948mg Fmoc-Trp(Boc)-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。
Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼286mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取2.5mg多肽酰肼肽(1当量)溶于0.5mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入5μL的1.0mol/L的HCl,加入3.9μL亚硝酸异戊酯(15倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,58.5μL巯基乙酸甲酯(300倍当量)加入反应体系,加入14μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:1mL预冷的TFA加入反应液后,再加入15mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末1.2mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图7所示。
实施例8:合成C端为Thr的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Thr的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量715mg Fmoc-Thr(t-But)-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。
Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼286mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取2.5mg多肽酰肼肽(1当量)溶于0.5mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入5μL的1.0mol/L的HCl,加入4.2μL亚硝酸异戊酯(15倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,63.2μL巯基乙酸甲酯(300倍当量)加入反应体系,加入14μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:1mL预冷的TFA加入反应液后,再加入15mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末1.2mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图8所示。
实施例9:合成C端为Cys的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Cys的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量1054.3mg Fmoc-Cys(Trt)-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。
Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼286mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取2.5mg多肽酰肼肽(1当量)溶于0.5mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入5μL的1.0mol/L的HCl,加入4.2μL亚硝酸异戊酯(15倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,62.9μL巯基乙酸甲酯(300倍当量)加入反应体系,加入14μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:1mL预冷的TFA加入反应液后,再加入15mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末1.2mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图9所示。
实施例10:合成C端为Arg的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Arg的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量1167mg Fmoc-Arg(Pbf)-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。
Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼296mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取2.5mg多肽酰肼肽(1当量)溶于0.5mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入5μL的1.0mol/L的HCl,加入4μL亚硝酸异戊酯(15倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,60μL巯基乙酸甲酯(300倍当量)加入反应体系,加入14μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:1mL预冷的TFA加入反应液后,再加入15mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末1.2mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图10所示。
实施例11:合成C端为Tyr的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Tyr的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量827mg Fmoc-Tyr(t-But)-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。
Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼285mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取2.5mg多肽酰肼肽(1当量)溶于0.5mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入5μL的1.0mol/L的HCl,加入4μL亚硝酸异戊酯(15倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,59.6μL巯基乙酸甲酯(300倍当量)加入反应体系,加入14μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:1mL预冷的TFA加入反应液后,再加入15mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末1.2mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图11所示。
实施例12:合成C端为Glu的硫酯肽
本实施例中制备硫酯肽的制备方法具体过程包括如下步骤:
(1)制备C-端为Glu的多肽酰肼:
制备2-Cl(trt)-肼树脂:预先配好的5mL的含5%水合肼(v/v)的DM加入536mg2-Cl(trt)-Cl树脂(载量0.56mmol/g,300μmol)中,常温反应30分钟,弃去反应液,重复一次;加入5mL20%(v/v)的甲醇DMF溶液的封闭试剂5ml,反应20min后DMF洗涤树脂六次。
氨基酸缩合:称量765mg Fmoc-Glu(t-But)-OH(6eq)和255mg Oxyma(6eq)于10mL离心管,加入5.5mL的DMF和280μL DIC(6eq)溶解氨基酸后加入固相合成管中;在金属浴(55℃)中震荡40分钟后,DMF洗涤树脂3次。
未反应氨基封闭:4mL的预先配好的混合试剂(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF,5:6:89,v/v)加入树脂;常温反应2分钟后,DMF洗涤树脂五次。Fmoc脱除:加入4mL 20%哌啶的DMF于树脂中;常温反应8分钟后,弃去20%哌啶溶液;重复操作一次;DMF洗涤树脂5次。
氨基酸的延长:重复上述的氨基酸缩合、未反应氨基封闭和Fmoc脱除步骤,依次完成目的氨基酸序列的缩合,直至N端Arg拼接完成,去除N端Arg的Fmoc基团。
多肽酰肼的裂解与沉淀:常温干燥树脂10分钟后,加入7mL的TFA切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS=88:5:5:2,v/v),常温反应2h,收集TFA切割液,冰乙醚沉淀多肽酰肼,乙醚洗涤多肽酰肼3次,离心得到多肽酰肼276mg。
(2)亚硝酸异戊酯处理:取2.5mg多肽酰肼肽(1当量)溶于0.5mL的DMSO和H2O的混合溶剂(3:2,v/v),加入磁子,加入5μL的1.0mol/L的HCl,加入4.1μL亚硝酸异戊酯(15倍当量),在-10℃冰盐浴中搅拌20分钟。
(3)巯基乙酸甲酯处理:在-10℃冰盐浴下,61.5μL巯基乙酸甲酯(300倍当量)加入反应体系,加入14μL 1.0mol/L碳酸氢铵溶液(体系pH在7附近),常温下震荡15分钟。
(4)硫酯肽的析晶:1mL预冷的TFA加入反应液后,再加入15mL预冷的乙醚,硫酯肽以沉淀析出,离心得到硫酯肽粗品,乙醚洗涤硫酯肽粉末3次,晾干得到纯度高的硫酯肽粉末1.2mg。
(5)1.0mg硫酯肽粉末溶于1.0mL DMSO,取20μL经反相高效液相色谱分析(流动相为A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比;流速为1.0mL/min,方法(2→2→90→90→90B%),Time/min(0→2→30→35→40),目标峰经ESI-MASS确认,如图12所示。
Claims (9)
1.一种硫酯肽合成方法,其特征在于包括如下步骤:
步骤1:多肽酰肼溶解在含有盐酸的二甲基亚砜和水构成的混合溶剂中,在-15℃~-5℃条件下,与过量的亚硝酸异戊酯反应,生成酰基叠氮肽;
步骤2:向步骤2的体系中加入过量巯基乙酸甲酯,随后加1.0mol/L的碳酸氢铵溶液调节溶液pH至中性,常温反应一段时间;
步骤3:向步骤2的体系中加入预冷至0℃的三氟乙酸,随后加入预冷至0℃的乙醚,使得多肽硫酯析出晶体;
步骤4:通过离心或过滤的方法获得多肽硫酯的粉末,并用乙醚洗涤得到纯度高的硫酯肽粉末。
2.根据权利要求1所述的硫酯肽合成方法,其特征在于:
步骤1中,所述多肽酰肼是通过固相多肽制备获得。
3.根据权利要求1所述的硫酯肽合成方法,其特征在于:
步骤1中,混合溶剂中二甲基亚砜和水的体积比为10:1~2:8;混合溶剂中盐酸的浓度为0.1mol/L~0.0001mol/L。
4.根据权利要求1所述的硫酯肽合成方法,其特征在于:
步骤1中,所述亚硝酸异戊酯的添加量为多肽酰肼当量的1~30倍。
5.根据权利要求1所述的硫酯肽合成方法,其特征在于:
步骤1中,与亚硝酸异戊酯的反应时间为10~30分钟。
6.根据权利要求1所述的硫酯肽合成方法,其特征在于:
步骤2中,所述巯基乙酸甲酯的添加量为亚硝酸异戊酯当量的5~30倍。
7.根据权利要求1所述的硫酯肽合成方法,其特征在于:
步骤2中,常温反应时间为10~120分钟。
8.根据权利要求1所述的硫酯肽合成方法,其特征在于:
步骤3中,预冷的三氟乙酸的体积为步骤2混合溶液体积的1.5~4倍。
9.根据权利要求1所述的硫酯肽合成方法,其特征在于:
步骤3中,预冷的乙醚的体积为三氟乙酸体积的8~30倍。
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