CN114164224A - 一种低温脱苦酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低温脱苦酶的制备方法，该低温脱苦酶基因从赫氏圆石藻的基因组中克隆得到，能够专一性水解人工底物和包括柚皮苷在内的含有鼠李糖苷键的天然产物，通过设计引物将α‑L‑鼠李糖苷酶r‑Rha1的编码基因克隆出来并插入到大肠杆菌表达载体pET32中构建成表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性重组子，并利用IPTG诱导大肠杆菌表达制备而得到；在35℃，用酶量为10U/mL,pH7.0的条件下能催化水解2g/L柚皮苷为柚皮素，起到脱苦的作用；该方法具有步骤简单，成本低廉，反应温和能耗低，环境友好等特点，为柚汁或其他含有柚皮苷较多的果汁脱苦，柚皮素的工业化制备提供了重要的工具酶。

Description

一种低温脱苦酶的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种低温脱苦酶的制备方法。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC3.2.1.40))，是一种能够特异性水解聚糖或者糖苷类化合物末端的糖苷键，释放L-鼠李糖，产生新的聚糖或糖苷类化合物。α-L-鼠李糖苷酶在自然界广泛存在，主要是来自于霉菌、细菌或者其他微生物。α-L-鼠李糖苷酶在食品领域具有非常重要的应用，包括：

(1)脱苦作用：α-L-鼠李糖苷酶能够作用于柑橘类果汁，将其中的黄烷酮糖包括柚皮苷、柠檬苦素等苦味物质水解脱去一个鼠李糖分子，转化为单糖苷，降低1/3的苦味水平。

(2)生物转化作用：α-L-鼠李糖苷酶能作用于橙皮苷等黄酮类物质的生物转化。如α-L-鼠李糖苷酶能水解橙皮苷，生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷再通过加氢生成橙皮素二氢查尔酮-7-O-葡萄糖苷，可作为甜味素应用于食品添加剂的领域。

(3)增香作用：α-L-鼠李糖苷酶能与键合态芳香物质为底物，裂解其中的糖苷键释放糖苷配基，产生游离态芳香物质，提升香气物质的释放，起到增香的作用。

目前，工业化α-L-鼠李糖苷酶主要通过溶剂抽提黑曲霉柠檬发酵物得到，存在酶产物纯度低、活性不稳定和溶剂污染等问题。另一方面，现今市面常见的α-L-鼠李糖苷酶多来源于霉菌，该来源的酶多在50℃及以上有最佳催化效率，不适用于低温加工如NFC果汁的生产，且反应时需要加热，会增加生产的能耗。

发明内容

针对目前产业的需求，挖掘能在低温或常温环境下具有高催化活性，可用于果汁脱苦、制备调味剂和果酒增香的α-L-鼠李糖苷酶，本发明提供了一种来源于海洋微藻的α-L-鼠李糖苷酶在高效水解柚子汁中柚皮苷的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种低温脱苦酶的制备方法，具体包括如下步骤：

以赫氏圆石藻cDNA为模板，设计引物品F-Rha和R-Rha，PCR扩增获得α-L-鼠李糖苷酶EhRha的编码基因序列，将PCR产物和表达载体通过EcoRI酶切，纯化、连接、PCR判定基因方向，获得重组表达载体；将重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，在LB培养基培养至对数期，经IPTG诱导表达，收集菌体，破碎、分离、纯化后得到低温脱苦酶。

进一步，所述的低温脱苦酶为α-L-鼠李糖苷酶EhRha，α-L-鼠李糖苷酶来源于赫氏圆石藻。

进一步，所述的α-L-鼠李糖苷酶EhRha专一性水解α-1，2鼠李糖苷键。

进一步，所述的α-L-鼠李糖苷酶EhRha的核苷酸序列为：

ATGACGCCTCTGAACTCCTTGCTGCCGCTGTTCCCACCTATCCGTCTCCGTGCGTCGAGCTCCGACTGGTTCGCCAGCCCAAAGTTTGCTCTGCCTCACGGAAGCACTCCGGTGTTCTCGTGGGCGCCGCAGCACACCGACCGTGGTTCGGTGCAGGCCTCCTTCAACCTGACAATCTGGAGCGCAGTGGGACGCGTCGTGTGGAGTGGCGACGCGGCCTCGAGCCAGCCGCGCATGCGCTACCCTCCCGATGCACCACGCCTCGAGCCGGGAACTTACGTGTGGCAAGTCGCCACCCGCGAAGCCGACGGGAGGATCTCGCCGCCCAGCGCTCCTTCCGCCCTCCACGTCGCCCTAGGGCACGGGGAGTGGGACGGCGTCCCGTGGCTCGGCTCCGCGTCGAAGAATGTGTACAGCACGACCTTCGACTGCCCGGCCGGCGCAGTCACCTCGGTGCTCTACATTTGTGGCCTCGGCTACTCGCGGGTCGAGCTCAACGGCCACGTCCTCAACACGCTCACGACCGCGCCGTGGACCCAATACGCGTACGTGAACGGCTTCTCTACCCTGGACGTCAAGGACCTCCTTCTGGTCGGCGAGCCAAACCGCCTCGTCGTCTCTCTTGGTCGGGGCTGGCGCGACCGGACGGCGTTCCGCATCCTCAAGGGCGACGACGTGGCTTCGGACGGGAAGGTCGAGCGCGTCGTGCGAGCCAAGCTAGTGGCCACGCTGAGCACCGGAGATTCGGTCGCCCTCAGTCACACGGGTGACGGCAAGTGGCACGCCGCAGCCGGCCCGACGACGGCAGATTCCGTCTACAATGGCGAGGAGTACGACGCCCGCGTGGCGGAGCGGCTCGGGGACGGGCCGCACAACGCCATCTCCCCGGAGCTGTGGTCGAAAGCGGCGCCGCTCGACGAGGGAGACGCGCCAGCGGGCGTGATGACGGCTTGGGCGGCGCCCGCCGTCACCGTGACCGACAGCATCGCGCCAGTCGCCCTGACCAACCCTCGCAAGGGGCTGTACGTGGCTGACTTTGGACGGAGACTGACGGGCGTGGTGCGGCTCAATCGCATGATTTGCAAGGAGGGCACGCGAGTCATCCTCCGCCACGCTGAGATCATGCAGCACGCCGGCCTGCCCGACGTCAAGACGGCGGATCCGGCGATGATCTACGTCGGCGAGCTGCGCGGTGCGAGAGCCACCGACGTCTACACGTGCAGCGGCCGCGCGGGAGGCGAGACGTGGCAGCCGTCGCTGACGTACCACGGCTTCCGATTCGTCGAGATCAACGTCACGAACTCAGGGGTGCGCCCAGCCGCTGCGATGCTGACCGCGTTGCACTTCCACTCGGGCGTCGCCCTGCGCACGCACGCGCACTTCAACTCGACGACGCTCAACCGCATGCAGCACCTGGCCGTCTCCGCCCAACAGTCGAACCTGCAGACGATCCCCACGGACTGCGACCAGCGCGACGAGCGGCTGGGGTGGATGGGCGACGCCAGCCTAAGCAGCGAGTCGATGGCGCTCAACTTCGAGATGGCGCCCTTCTTCTCTTGGTGGGTGCGGCACGTCGTCCTCCCCGAGCAGCGGGCGGGCGCGCTGCCCGACGTGGTGCCGTTCGTTCGGTACGGCGGCAGGCCGGCCGACGTCTCCTGGTCCGCGGCGCTGCCTTCGGTGGCGCACGCCGTGTGCGACGTATACGGCGACACAGAGACGTACCGCGAGGCGGCCAGCGCGATCGCAGCTCTGGTCGATGAGGTGGGAGTCGAGGCAAGGGCCGGGCTGGGCAAGATGCGGACGCCGTATGGGGACTGGTGCCCTCCGCCGGCGCGGATGGGCAAGGGGCAGGGCCGCAAGCCGAGCCCTCCACTCACGTCGGCCTTCTCGTATGCGCTCATGGTGCAGCAGGCGGCGGAGCTCGCGCGGGCCGCTGGCAATGCCTCCGAGGGGGCCCGCTACGCGAGTCTCGGTCGCGAGATTGTCTCCAACTTCCACACCGCCTTCTACGTTGGCAACGGCACCTTCGACACGAGCGGCACGCAGACTGCGAACGTCCTTGGCCTCGCGTTGGGGGGTGCTCCCGACGTCGGCTTGGCCCGGCGGCGGCTCCTCTCCCTCCTCCGCGCCAGGCGGACGCACTACGACACGGGAATTGTCGGCTTCAAGTTCCTCTTCGACGTGCTCGACCAGGCGCAGGCGCACGACGCCGCGCTCGCAGTGCTCTCGCAGACCGACTACCCATCGATCGGCTACTACTTTGCAAACTCCCTCGAGCCGGCGACTGCGAACCTGTGGGAGCTGCCCGACGCTCCTGCCGAGGGGACAGGGATGAACTCACGCAACCACCATATGTGGAGCAGCTACTCGGCCTACCTCGTCAAGTCCGTGGCCGGCCTGCACCAGCAGGCAGGCACACACGGCTTCCAACGGCTCGAGCTGCGCCCGAGCGGCGCGTATGCCCTCAGCGGGGCATCCGTGACCGTCGACCTGCCCCACGGCACGGCGCGACTCAGCTGGGTCCGCTCGGGCGGGCGGCAGCACGACAAGGTGAGCGAGGGCGAGACGGCTCGCCTGTCTTGCGGCCCATCGGGAGGTCGGATCTCCGCCGTCTCGTTCGCTTCCTTTGGCACGCCATCGATCGGCTCGCCGAGCGATTTGCCCTCCGACGGCCGTCGTTCAGACGGGTTTGAGACCGACCCAGCCTGCCACGCCCTTCGCTCCAGCCAGGCAGTCGCCGAGGCGTGCGTCGGTCGCAACTCGTGCGAGGTACCAGCAACTCGCGTCTTCTTCGGCGAGCGGGGCTCTCTCTTCTGCACGACGCGTCGCGACCCGCTCGCGAGCCCTCTGCGCCTGTGGCTGACGGTCGCGTGCGAGGTGGCCGCCGACTCGCTCCGTGTCGAGGCTGGCGTGCCTGTCGGGTCGACGGCGCGGCTCCTCCTGCCCCTCCGAGGGATGGCAACTCCCCACCTGCGCGAATCGGGGCGCTCAGTCTACCTCGCCACCGACCCGAGCGCATCTAGTGCTGCTCGCAAAGCCAACAGGCTGGGCTCGGTTCAGCTCACCGAGGACGAACGCACTGGTCGCATTCTCGCCGTCGAGTTGCCCTCGGGCCTGTTTGACTTTGACTTGTCCGACGCAGCGACCCCCCGGGCTGCGAGCAGTGCGACGGAGGCAGCGATCAGCGTGTAG

氨基酸序列为：

MTPLNSLLPLFPPIRLRASSSDWFASPKFALPHGSTPVFSWAPQHTDRGSVQASFNLTIWSAVGRVVWSGDAASSQPRMRYPPDAPRLEPGTYVWQVATREADGRISPPSAPSALHVALGHGEWDGVPWLGSASKNVYSTTFDCPAGAVTSVLYICGLGYSRVELNGHVLNTLTTAPWTQYAYVNGFSTLDVKDLLLVGEPNRLVVSLGRGWRDRTAFRILKGDDVASDGKVERVVRAKLVATLSTGDSVALSHTGDGKWHAAAGPTTADSVYNGEEYDARVAERLGDGPHNAISPELWSKAAPLDEGDAPAGVMTAWAAPAVTVTDSIAPVALTNPRKGLYVADFGRRLTGVVRLNRMICKEGTRVILRHAEIMQHAGLPDVKTADPAMIYVGELRGARATDVYTCSGRAGGETWQPSLTYHGFRFVEINVTNSGVRPAAAMLTALHFHSGVALRTHAHFNSTTLNRMQHLAVSAQQSNLQTIPTDCDQRDERLGWMGDASLSSESMALNFEMAPFFSWWVRHVVLPEQRAGALPDVVPFVRYGGRPADVSWSAALPSVAHAVCDVYGDTETYREAASAIAALVDEVGVEARAGLGKMRTPYGDWCPPPARMGKGQGRKPSPPLTSAFSYALMVQQAAELARAAGNASEGARYASLGREIVSNFHTAFYVGNGTFDTSGTQTANVLGLALGGAPDVGLARRRLLSLLRARRTHYDTGIVGFKFLFDVLDQAQAHDAALAVLSQTDYPSIGYYFANSLEPATANLWELPDAPAEGTGMNSRNHHMWSSYSAYLVKSVAGLHQQAGTHGFQRLELRPSGAYALSGASVTVDLPHGTARLSWVRSGGRQHDKVSEGETARLSCGPSGGRISAVSFASFGTPSIGSPSDLPSDGRRSDGFETDPACHALRSSQAVAEACVGRNSCEVPATRVFFGERGSLFCTTRRDPLASPLRLWLTVACEVAADSLRVEAGVPVGSTARLLLPLRGMATPHLRESGRSVYLATDPSASSAARKANRLGSVQLTEDERTGRILAVELPSGLFDFDLSDAATPRAASSATEAAISV*。

进一步，所述的IPTG的浓度为0.5-1.0mM，诱导温度为16℃，时间为10-20h。

进一步，所述的所述引物品序列为：

F-Rha：5’-GCGAATTCATGACGCCTCTGAACTCCTT-3’，EcoRI酶切位点为GAATTC；

R-Rha：5’-GCGAATTCCTACACGCTGATCGCTG-3’，EcoRI酶切位点为GAATTCC。

进一步，所述的α-L-鼠李糖苷酶EhRha应用于柚皮苷的水解，具体包括如下步骤：

以柚皮苷为反应底物，在α-L-鼠李糖苷酶EhRha的催化作用下，在于温度15-50℃，pH值6.0-10.0的条件下，进行反应5-20h。

进一步，所述的柚皮苷浓度为1-5g/L，α-L-鼠李糖苷酶EhRha用量为1-10U/mL。

进一步，所述的α-L-鼠李糖苷酶EhRha的催化条件为温度35℃，pH值为7.0。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明首先克隆并重组表达了来源于赫氏圆石藻的α-L-鼠李糖苷酶EhRha，该酶能水解α-1,2鼠李糖苷键，α-L-鼠李糖苷酶EhRha水解位点专一，能够高效的对柚皮苷的α-1，2鼠李糖苷键进行水解，起到降低柚子提取物或者柚汁的后苦味，适宜大规模的应用于柚子等果汁脱苦；

本发明中在α-L-鼠李糖苷酶EhRha用量为10U/mL，pH为7.0，35℃条件下催化2g/L柚皮苷水解，水解率为80％以上，该方法具有步骤简单，成本低廉，条件温和，能耗低，环境友好等优点，具有广阔的应用前景，为柚子汁的脱苦以及柚子产物后续的加工和产业化应用提供了新的工具酶。

附图说明

为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为重组α-L-鼠李糖苷酶EhRha蛋白质SDS-PAGE电泳图；图中泳道M为蛋白质分子量Ladder；泳道1为pET32a/EhRha表达菌株粗酶液，泳道2泳道为pET32a表达菌株阴性对照，3为纯化后的EhRha；

图2为重组α-L-鼠李糖苷酶EhRha的酶学性质研究；其中图a为反应体系中不同pH对酶活和稳定性的影响；图b为不同反应温度对酶活和稳定性的影响，纵坐标为相对酶活力；

图3为重组α-L-鼠李糖苷酶EhRha水解柚皮苷的HPLC图谱；图中a为α-L-鼠李糖苷酶EhRha水解柚皮苷反应液的HPLC图谱，b为底物柚皮苷标准品的HPLC图谱；

图4为重组α-L-鼠李糖苷酶EhRha水解柚子原浆的HPLC图谱；图中a为α-L-鼠李糖苷酶EhRha水解柚子原浆的HPLC图谱，b为柚子原浆的HPLC图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种低温脱苦酶的制备方法，具体包括如下步骤：

以购买于上海光语生物有限公司的赫氏圆石藻的cDNA为模板,根据NCBI数据库中赫氏圆石藻基因组中预测的鼠李糖苷酶(EhRha)的基因序列设计上、下游引物F-Rha和R-Rha，进行PCR扩增，PCR扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测、纯化，并通过PCR回收试剂盒进行回收得到赫氏圆石藻来源α-L-鼠李糖苷酶EhRha的基因片段：

其中，上、下游引物F-Rha和R-Rha序列为：

F-Rha：5’-GCGAATTCATGACGCCTCTGAACTCCTT-3’，EcoRI酶切位点为GAATTC，

R-Rha：5’-GCGAATTCCTACACGCTGATCGCTG-3’，EcoRI酶切位点为GAATTCC。

PCR扩增的条件为：预变性98℃，4min；高温变性98℃，10s,退火55℃，15s,延伸72℃，2min,循环30次；最后72℃，10min。

EcoRI限制性内切酶对纯化后的PCR产物和表达载体pET32a分别进行酶切，回收PCR产物和载体的DNA片段按3:1混合，T4连接酶16℃下连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化产物涂布于含有100mg/L氨苄的LB平板，37℃恒温培养过夜，挑取平板上的单菌落，接种到5mL含有100mg/L氨苄的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定后的质粒进行序列测定，α-L-鼠李糖苷酶EhRha的编码基因大小为3192bp，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，得重组质粒pET32a/EhRha。

取重组质粒pET32a/EhRha1uL转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。转化产物涂布于含有氨苄的LB平板上，37℃恒温培养过夜，挑取平板上的单菌落，PCR筛选阳性克隆，接种到5mL含有100mg/L氨苄的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。将过夜培养的菌液按1:100转接到200毫升的含有100mg/L氨苄的的LB液体培养基中，37℃培养3h,当OD600达到0.6时，加入中浓度为0.25毫摩尔的IPTG诱导,100rpm摇床震荡培养，16℃诱导20h。

将诱导后的培养液4000rpm离心10min后收集菌体，用40mLBindingBuffer重悬。用超声破壁仪破壁后，8000rpm离心取上清。混匀50％NI-NTA，吸5mL50％NI-NTA，上柱，待完全沉淀(约1h)，先用10mLBindingBuffer洗柱子。将准备好的样品上样，结合1h-1.5h，流速控制在0.1mL/min左右，40mlBindingBuffer洗柱子(收集洗脱液10管，流速在0.3-0.4mL/min左右)；60mlWashingBuffer洗柱子(收集洗脱液10管，流速在0.3-0.4mL/min左右)；最后用20mLElutionBuffer洗脱并分部收集洗脱液，用Nanodrop2000(Thermo)测定蛋白浓度并用SDS-PAGE检测，如图1所示，纯化后蛋白在110kDa左右，与预测的蛋白分子量一致。收集的蛋白用pH8.0的50mM的Tris-HCL超滤除盐，得重组α-L-鼠李糖苷酶EhRha。

纯化过程使用缓冲液组成如下：

BindingBuffer：pH7.550mM磷酸钠缓冲液，500mMNaCl；

WashingBuffer：pH7.550mM磷酸钠缓冲液，500mMNaCl,20mM咪唑；

ElutionBuffer：pH7.550mM磷酸钠缓冲液，500mMNaCl,300mM咪唑。

实施例2

α-L-鼠李糖苷酶EhRha的酶学特征

2.1酶活性测定

取10μL酶液，加入2mM的pNP-Rha溶液60μL(pH6.5，50mM磷酸钠缓冲液配制)，30℃下反应10min，加入120μL的5mM的碳酸钠溶液终止反应，OD405nm检测吸光度，酶活的定义为：每分钟水解pNP-Rha释放1μmol的对硝基苯酚为1个酶活单位(U)。

2.2最适反应温度的测定

在20-60℃范围内，每隔5℃分别测定酶活，缓冲液为100mM磷酸钠缓冲液，发现重组α-L-鼠李糖苷酶EhRha的最适反应温度为35℃，结果如图2a。

2.3最适反应pH的测定

在不同的pH(5.0-10.0，100mM磷酸钠缓冲液)条件下，35℃分别测定酶活发现重组最适反应pH为7.0，结果如图2b。

2.4重组α-L-鼠李糖苷酶对柚皮苷的水解

重取纯化后的重组α-L-鼠李糖苷酶EhRha，加入100mM磷酸钠缓冲液，10μL50mM柚皮苷(Naringin，甲醇溶解)，添加去离子水至200μL,在35℃条件下，孵育4h，取出8000rpm离心2min，加入200μL甲醇(分析纯)混匀，经0.22μm的有机滤膜过滤到色谱瓶中，使用HPLC分析，分析条件为：柱温，40℃；流速，0.6mL/min；进样量，10μL；检测波长，283nm；流动相，乙腈：超纯水70:30(V:V)，结果如图3。

2.5重组α-L-鼠李糖苷酶对柚子原浆中柚皮苷的水解

重取纯化后的重组α-L-鼠李糖苷酶EhRha，加入100mM磷酸钠缓冲液，100μL柚子原浆，添加去离子水至200μL,在35℃条件下，孵育4h，取出8000rpm离心2min，加入200μL甲醇(分析纯)混匀，经0.22μm的有机滤膜过滤到色谱瓶中，使用HPLC分析，分析条件为：柱温，40℃；流速，0.6mL/min；进样量，10μL；检测波长，283nm；流动相，乙腈：超纯水70:30(V:V)，结果如图4。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

序列表

<110> 仲恺农业工程学院

<120> 一种低温脱苦酶的制备方法

<141> 2021-10-27

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3192

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ATGACGCCTC TGAACTCCTT GCTGCCGCTG TTCCCACCTA TCCGTCTCCG TGCGTCGAGC 60

TCCGACTGGT TCGCCAGCCC AAAGTTTGCT CTGCCTCACG GAAGCACTCC GGTGTTCTCG 120

TGGGCGCCGC AGCACACCGA CCGTGGTTCG GTGCAGGCCT CCTTCAACCT GACAATCTGG 180

AGCGCAGTGG GACGCGTCGT GTGGAGTGGC GACGCGGCCT CGAGCCAGCC GCGCATGCGC 240

TACCCTCCCG ATGCACCACG CCTCGAGCCG GGAACTTACG TGTGGCAAGT CGCCACCCGC 300

GAAGCCGACG GGAGGATCTC GCCGCCCAGC GCTCCTTCCG CCCTCCACGT CGCCCTAGGG 360

CACGGGGAGT GGGACGGCGT CCCGTGGCTC GGCTCCGCGT CGAAGAATGT GTACAGCACG 420

ACCTTCGACT GCCCGGCCGG CGCAGTCACC TCGGTGCTCT ACATTTGTGG CCTCGGCTAC 480

TCGCGGGTCG AGCTCAACGG CCACGTCCTC AACACGCTCA CGACCGCGCC GTGGACCCAA 540

TACGCGTACG TGAACGGCTT CTCTACCCTG GACGTCAAGG ACCTCCTTCT GGTCGGCGAG 600

CCAAACCGCC TCGTCGTCTC TCTTGGTCGG GGCTGGCGCG ACCGGACGGC GTTCCGCATC 660

CTCAAGGGCG ACGACGTGGC TTCGGACGGG AAGGTCGAGC GCGTCGTGCG AGCCAAGCTA 720

GTGGCCACGC TGAGCACCGG AGATTCGGTC GCCCTCAGTC ACACGGGTGA CGGCAAGTGG 780

CACGCCGCAG CCGGCCCGAC GACGGCAGAT TCCGTCTACA ATGGCGAGGA GTACGACGCC 840

CGCGTGGCGG AGCGGCTCGG GGACGGGCCG CACAACGCCA TCTCCCCGGA GCTGTGGTCG 900

AAAGCGGCGC CGCTCGACGA GGGAGACGCG CCAGCGGGCG TGATGACGGC TTGGGCGGCG 960

CCCGCCGTCA CCGTGACCGA CAGCATCGCG CCAGTCGCCC TGACCAACCC TCGCAAGGGG 1020

CTGTACGTGG CTGACTTTGG ACGGAGACTG ACGGGCGTGG TGCGGCTCAA TCGCATGATT 1080

TGCAAGGAGG GCACGCGAGT CATCCTCCGC CACGCTGAGA TCATGCAGCA CGCCGGCCTG 1140

CCCGACGTCA AGACGGCGGA TCCGGCGATG ATCTACGTCG GCGAGCTGCG CGGTGCGAGA 1200

GCCACCGACG TCTACACGTG CAGCGGCCGC GCGGGAGGCG AGACGTGGCA GCCGTCGCTG 1260

ACGTACCACG GCTTCCGATT CGTCGAGATC AACGTCACGA ACTCAGGGGT GCGCCCAGCC 1320

GCTGCGATGC TGACCGCGTT GCACTTCCAC TCGGGCGTCG CCCTGCGCAC GCACGCGCAC 1380

TTCAACTCGA CGACGCTCAA CCGCATGCAG CACCTGGCCG TCTCCGCCCA ACAGTCGAAC 1440

CTGCAGACGA TCCCCACGGA CTGCGACCAG CGCGACGAGC GGCTGGGGTG GATGGGCGAC 1500

GCCAGCCTAA GCAGCGAGTC GATGGCGCTC AACTTCGAGA TGGCGCCCTT CTTCTCTTGG 1560

TGGGTGCGGC ACGTCGTCCT CCCCGAGCAG CGGGCGGGCG CGCTGCCCGA CGTGGTGCCG 1620

TTCGTTCGGT ACGGCGGCAG GCCGGCCGAC GTCTCCTGGT CCGCGGCGCT GCCTTCGGTG 1680

GCGCACGCCG TGTGCGACGT ATACGGCGAC ACAGAGACGT ACCGCGAGGC GGCCAGCGCG 1740

ATCGCAGCTC TGGTCGATGA GGTGGGAGTC GAGGCAAGGG CCGGGCTGGG CAAGATGCGG 1800

ACGCCGTATG GGGACTGGTG CCCTCCGCCG GCGCGGATGG GCAAGGGGCA GGGCCGCAAG 1860

CCGAGCCCTC CACTCACGTC GGCCTTCTCG TATGCGCTCA TGGTGCAGCA GGCGGCGGAG 1920

CTCGCGCGGG CCGCTGGCAA TGCCTCCGAG GGGGCCCGCT ACGCGAGTCT CGGTCGCGAG 1980

ATTGTCTCCA ACTTCCACAC CGCCTTCTAC GTTGGCAACG GCACCTTCGA CACGAGCGGC 2040

ACGCAGACTG CGAACGTCCT TGGCCTCGCG TTGGGGGGTG CTCCCGACGT CGGCTTGGCC 2100

CGGCGGCGGC TCCTCTCCCT CCTCCGCGCC AGGCGGACGC ACTACGACAC GGGAATTGTC 2160

GGCTTCAAGT TCCTCTTCGA CGTGCTCGAC CAGGCGCAGG CGCACGACGC CGCGCTCGCA 2220

GTGCTCTCGC AGACCGACTA CCCATCGATC GGCTACTACT TTGCAAACTC CCTCGAGCCG 2280

GCGACTGCGA ACCTGTGGGA GCTGCCCGAC GCTCCTGCCG AGGGGACAGG GATGAACTCA 2340

CGCAACCACC ATATGTGGAG CAGCTACTCG GCCTACCTCG TCAAGTCCGT GGCCGGCCTG 2400

CACCAGCAGG CAGGCACACA CGGCTTCCAA CGGCTCGAGC TGCGCCCGAG CGGCGCGTAT 2460

GCCCTCAGCG GGGCATCCGT GACCGTCGAC CTGCCCCACG GCACGGCGCG ACTCAGCTGG 2520

GTCCGCTCGG GCGGGCGGCA GCACGACAAG GTGAGCGAGG GCGAGACGGC TCGCCTGTCT 2580

TGCGGCCCAT CGGGAGGTCG GATCTCCGCC GTCTCGTTCG CTTCCTTTGG CACGCCATCG 2640

ATCGGCTCGC CGAGCGATTT GCCCTCCGAC GGCCGTCGTT CAGACGGGTT TGAGACCGAC 2700

CCAGCCTGCC ACGCCCTTCG CTCCAGCCAG GCAGTCGCCG AGGCGTGCGT CGGTCGCAAC 2760

TCGTGCGAGG TACCAGCAAC TCGCGTCTTC TTCGGCGAGC GGGGCTCTCT CTTCTGCACG 2820

ACGCGTCGCG ACCCGCTCGC GAGCCCTCTG CGCCTGTGGC TGACGGTCGC GTGCGAGGTG 2880

GCCGCCGACT CGCTCCGTGT CGAGGCTGGC GTGCCTGTCG GGTCGACGGC GCGGCTCCTC 2940

CTGCCCCTCC GAGGGATGGC AACTCCCCAC CTGCGCGAAT CGGGGCGCTC AGTCTACCTC 3000

GCCACCGACC CGAGCGCATC TAGTGCTGCT CGCAAAGCCA ACAGGCTGGG CTCGGTTCAG 3060

CTCACCGAGG ACGAACGCAC TGGTCGCATT CTCGCCGTCG AGTTGCCCTC GGGCCTGTTT 3120

GACTTTGACT TGTCCGACGC AGCGACCCCC CGGGCTGCGA GCAGTGCGAC GGAGGCAGCG 3180

ATCAGCGTGT AG 3192

<210> 2

<211> 1063

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

MTPLNSLLPL FPPIRLRASS SDWFASPKFA LPHGSTPVFS WAPQHTDRGS VQASFNLTIW 60

SAVGRVVWSG DAASSQPRMR YPPDAPRLEP GTYVWQVATR EADGRISPPS APSALHVALG 120

HGEWDGVPWL GSASKNVYST TFDCPAGAVT SVLYICGLGY SRVELNGHVL NTLTTAPWTQ 180

YAYVNGFSTL DVKDLLLVGE PNRLVVSLGR GWRDRTAFRI LKGDDVASDG KVERVVRAKL 240

VATLSTGDSV ALSHTGDGKW HAAAGPTTAD SVYNGEEYDA RVAERLGDGP HNAISPELWS 300

KAAPLDEGDA PAGVMTAWAA PAVTVTDSIA PVALTNPRKG LYVADFGRRL TGVVRLNRMI 360

CKEGTRVILR HAEIMQHAGL PDVKTADPAM IYVGELRGAR ATDVYTCSGR AGGETWQPSL 420

TYHGFRFVEI NVTNSGVRPA AAMLTALHFH SGVALRTHAH FNSTTLNRMQ HLAVSAQQSN 480

LQTIPTDCDQ RDERLGWMGD ASLSSESMAL NFEMAPFFSW WVRHVVLPEQ RAGALPDVVP 540

FVRYGGRPAD VSWSAALPSV AHAVCDVYGD TETYREAASA IAALVDEVGV EARAGLGKMR 600

TPYGDWCPPP ARMGKGQGRK PSPPLTSAFS YALMVQQAAE LARAAGNASE GARYASLGRE 660

IVSNFHTAFY VGNGTFDTSG TQTANVLGLA LGGAPDVGLA RRRLLSLLRA RRTHYDTGIV 720

GFKFLFDVLD QAQAHDAALA VLSQTDYPSI GYYFANSLEP ATANLWELPD APAEGTGMNS 780

RNHHMWSSYS AYLVKSVAGL HQQAGTHGFQ RLELRPSGAY ALSGASVTVD LPHGTARLSW 840

VRSGGRQHDK VSEGETARLS CGPSGGRISA VSFASFGTPS IGSPSDLPSD GRRSDGFETD 900

PACHALRSSQ AVAEACVGRN SCEVPATRVF FGERGSLFCT TRRDPLASPL RLWLTVACEV 960

AADSLRVEAG VPVGSTARLL LPLRGMATPH LRESGRSVYL ATDPSASSAA RKANRLGSVQ 1020

LTEDERTGRI LAVELPSGLF DFDLSDAATP RAASSATEAA ISV 1063

Claims (8)

1.一种低温脱苦酶的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

以赫氏圆石藻cDNA为模板，设计引物品F-Rha和R-Rha，PCR扩增获得α-L-鼠李糖苷酶EhRha的编码基因序列，将PCR产物和表达载体通过EcoRI酶切，纯化、连接、PCR判定基因方向，获得重组表达载体；将重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，在LB培养基培养至对数期，经IPTG诱导表达，收集菌体，破碎、分离、纯化后得到低温脱苦酶。

2.根据权利要求1所述的一种低温脱苦酶的制备方法，其特征在于：所述的低温脱苦酶为α-L-鼠李糖苷酶EhRha，α-L-鼠李糖苷酶来源于赫氏圆石藻。

3.根据权利要求1所述的一种低温脱苦酶的制备方法，其特征在于：所述的α-L-鼠李糖苷酶EhRha专一性水解α-1，2鼠李糖苷键。

4.根据权利要求1所述的一种低温脱苦酶的制备方法，其特征在于：所述的IPTG的浓度为0.5-1.0mM，诱导温度为16℃，时间为10-20h。

5.根据权利要求1所述的一种低温脱苦酶的制备方法，其特征在于：所述的所述引物品序列为：

F-Rha：5’-GCGAATTCATGACGCCTCTGAACTCCTT-3’，EcoRI酶切位点为GAATTC；

R-Rha：5’-GCGAATTCCTACACGCTGATCGCTG-3’，EcoRI酶切位点为GAATTCC。

6.根据权利要求1所述的一种低温脱苦酶的制备方法，其特征在于：所述的α-L-鼠李糖苷酶EhRha应用于柚皮苷的水解，具体包括如下步骤：

以柚皮苷为反应底物，在α-L-鼠李糖苷酶EhRha的催化作用下，在于温度15-50℃，pH值6.0-10.0的条件下，进行反应5-20h。

7.根据权利要求6所述的一种低温脱苦酶的制备方法，其特征在于：所述的柚皮苷浓度为1-5g/L，α-L-鼠李糖苷酶EhRha用量为1-10U/mL。

8.根据权利要求6所述的一种低温脱苦酶的制备方法，其特征在于：所述的α-L-鼠李糖苷酶EhRha的催化条件为温度35℃，pH值为7.0。

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