CN114163684B - 一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法 - Google Patents

一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法。本发明方法的技术要点为不预先脱胶直接用低共熔溶剂从废弃蚕茧中剥离丝素纳米纤维，并通过调节反应温度和加工时间控制丝素纳米纤维的形貌，经由冻干收集丝素纳米纤维；还可以一定程度上回收提取液中的水解丝蛋白，所用溶剂处理后可循环使用。本发明方法流程简单、绿色、快速、高效，特别适用于丝素纳米纤维的提取；在提取丝素纳米纤维的方法中引入利用低共熔溶剂不预先脱胶提取丝素纳米纤维的方法，扩充了提取丝素纳米纤维的方法的范围，有利于加快突破提取丝素纳米纤维的方法的局限，同时还能回收提取过程中的副产物，对于丝素蛋白纳米纤维的提取具有重要意义。

Description

一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及 提取液的方法
技术领域
本发明涉及生物高分子材料技术领域，具体涉及一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法。
背景技术
蚕丝是一种生物蛋白纤维，因其优异的机械性能与生物相容性而受到推崇。天然蚕丝纤维由丝胶蛋白及丝素蛋白组成，丝素蛋白分子由特定的氨基酸序列构成。丝素蛋白分子通过分子间酰胺键形成多肽链，多肽链因氨基酸残基结构的不同，借助氢键、疏水力及π-π相互作用等分子间作用力进一步形成α-螺旋、β-折叠、无规卷曲、β-转角等二级结构。二级结构进一步通过分子间作用力形成稳定的三级结构和四级结构，从而实现丝素蛋白分子的构象稳定。丝胶是一种天然糖蛋白，可以使纤维蛋白丝彼此结合。取决于起源和培养条件，茧中丝胶的含量在15-35％重量之间变化。有研究表明，丝素蛋白和丝胶蛋白的同时存在在一定程度上会引起机体的免疫反应，在脱去丝胶蛋白后，剩余的丝素蛋白不会引发免疫反应。因此，对蚕茧进行脱胶，对于丝素蛋白的生物性应用具有实际意义。作为未来的古老材料，蚕丝不仅应用于传统的纺织工业，更是被处理成薄膜、海绵、凝胶和支架等形式，用于生物医学设备和光电学等领域。特别是，作为一种FDA批准的生物相容性和生物可降解材料，有希望将基于丝素蛋白的具有生物界面的先进材料用于生物医学装置。
丝素蛋白中，无定形链连接的β微晶之间通过氢键、疏水相互作用等组成纳米纤维结构，其中桑蚕丝β-结晶区氨基酸结构序列为GAGAGSGAAS(GAGAGS)n，n＝1-11(G：甘氨酸、A：丙氨酸、S：丝氨酸)。蚕丝单根纳米纤维直径约为30nm，典型的纳米纤维结构赋予蚕丝优异的性能。例如，与其它一维生物高分子材料不同，丝素纳米纤维在结构上与传统的带电聚合物类似，其在不同溶剂中的长度恒定。这得益于丝素纳米纤维内密集的氢键作用，使其可有效抗拒溶剂影响及静电排斥作用。另外，丝素纳米纤维结构中多样的氨基酸残基使其具有极性和手性，在电场中可操作或用于稳定界面。这些结构特征使丝素纳米纤维具有很好的材料应用前景，可利用非共价键作用力及共价键作用力自身或复合其它功能材料构筑多维度的、多功能的、生物相容性好的智能材料，或者进一步利用不同的驱动力，构筑具有取向结构的丝素纳米纤维材料。
低共熔溶剂(DES)是一种新型的绿色溶剂，通常是由两种或三种能够自缔合(通常是通过氢键相互作用自缔合)的组分形成的熔点低于各组分熔点的低共熔混合物，具有低蒸气压、热稳定性好、可重复使用、毒性低、电化学窗口较宽等优良性能。此外，DES的生产涉及到两种成分的简单混合，通常使用温和的加热即可合成DES。考虑到DES制备简单，易于从相对廉价的组分获得(各组分本身具有良好的毒理学特性)，可以方便地运输，保持了相对较低的生产成本，允许用于大规模加工生产。更有趣的是，DES的结构和性质具有可设计性，可针对特定的应用选择合适的DES组分。近年来DES作为天然纳米材料剥离和生物应用的绿色溶剂受到越来越多的关注。
蚕丝具有复杂的层级结构及高结晶度，提取丝素纳米纤维的过程往往伴随着二级结构的变化，其典型特征是二级结构中β-折叠结构的增多。在丝素纳米纤维中，大量的β-折叠链通过分子间氢键形成β-折叠片结构并沿轴向层层堆叠形成纳米纤维结构。目前，从天然蚕丝纤维中直接提取纳米纤维仍然是一个挑战。2007年Zhao等人采用物理剥离法，通过高强度的超声处理从脱胶后的蚕丝中剥离得到SNF，然而这种方法存在着耗能大、得率低、设备要求高、所得SNF缺乏可加工性等不足。2016年Ling等人使用六氟异丙醇和超声处理相结合的方法从脱胶后的蚕丝中提取到具有可加工性的SNF，然而这种方法使用了有毒的试剂，周期较长(20h)且得率较低(10％)。目前还有通过尿素/盐酸胍DES，乳酸/氯化胆碱DES和柠檬酸/氯化胆碱DES等从脱胶后的蚕丝纤维中剥离出天然丝素纳米纤维的方法，但这些方法仍需要前置脱胶流程、较长的加工时间和较高的处理温度。
发明内容
为了解决背景技术中的问题，本发明人提供了一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法，不预先脱胶直接用低共熔溶剂从废弃蚕茧中剥离丝素纳米纤维，并通过调节反应温度和加工时间控制丝素纳米纤维的形貌，经由冻干收集丝素纳米纤维。同时还可以一定程度上回收提取液中的水解丝蛋白，所用溶剂处理后可循环使用。该方法流程简单、绿色、快速、高效，特别适用于丝素纳米纤维的提取。本发明在提取丝素纳米纤维的方法中引入利用低共熔溶剂不预先脱胶提取丝素纳米纤维的方法，扩充了提取丝素纳米纤维的方法的范围，有利于加快突破提取丝素纳米纤维的方法的局限，同时还能回收提取过程中的副产物，对于丝素蛋白纳米纤维的提取具有重要意义。
本发明的技术方案如下包括以下步骤：
1)将二水合草酸和氯化胆碱以1:1的摩尔比在80℃下混合、溶解，制备得到二水合草酸/氯化胆碱低共熔溶剂(DES)；
2)将废弃蚕茧剪碎浸入步骤1)得到的二水合草酸/氯化胆碱低共熔溶剂中，在设定温度下磁力搅拌一定时间后加入与低共熔溶剂体积相同的去离子水终结反应，得到浆液状物质；
3)将步骤2)得到的浆液状物质过滤，并水洗去除二水合草酸/氯化胆碱低共熔溶剂，得到过滤后的蚕丝纤维A和滤液B；
4)将步骤3)得到的蚕丝纤维A加入到100g去离子水中搅拌、分散，随后超声处理1h，离心去除未剥离的蚕丝纤维后，即得分散性良好的丝素纳米纤维分散液，经冻干，得到丝素纳米纤维；
5)将步骤3)得到的滤液B在60℃烘箱中除水浓缩，然后转移到预冷的乙醇溶剂中，待滤液B中的丝蛋白沉淀析出后，离心得到沉淀物C和上清液D；沉淀物C经冻干，即得水解丝蛋白粉；
6)将步骤5)中的上清液D在60℃烘箱中除水浓缩以回收草酸/氯化胆碱低共熔溶剂循环使用。
提取液为步骤6)回收的草酸/氯化胆碱低共熔溶剂，作为下次提取丝素纳米纤维的溶剂。
所述步骤1的溶剂为二水合草酸/氯化胆碱DES，经简易的脱水浓缩即可实现再循环使用。
所述步骤2)中，废弃蚕茧与二水合草酸/氯化胆碱低共熔溶剂的质量比为1:100。
所述步骤2)中，磁力搅拌的温度为80℃～90℃，时间为5h～24h。
所述步骤5)中，通过有机溶剂沉淀法，在滤液B中加入乙醇回收部分水解丝蛋白，滤液B与乙醇的质量比为1:4。
所述步骤4)中，丝素纳米纤维的直径为10-40nm。
通过调节步骤2)中磁力搅拌的温度和时间控制丝素纳米纤维的粒径分布范围。
丝素纳米纤维的二级结构与天然蚕丝纤维保持一致，且可以通过调节反应温度和加工时间控制β-折叠含量。
所述步骤4)中，丝素纳米纤维的得率在15-40％之间；所述步骤5)中，水解丝蛋白粉的得率在20-50％之间。
本发明的有益效果是：
本发明提供的从废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维的方法，脱胶和提取同步进行，工艺过程简单、有效、易控，克服了现有技术提取需要前置脱胶、加工时间较长和处理温度较高的问题。
本发明在提取丝素纳米纤维的方法中引入利用二水合草酸/氯化胆碱DES直接从废弃蚕茧中丝素纳米纤维的方法，省去了碳酸钠等脱胶药品的消耗，避免了脱胶废水的排放，缩短了工艺流程，提高了丝素纳米纤维得率，同时还能在一定程度上回收处理过程中被溶解的丝蛋白，所用溶剂在回收后也可以循环使用，对于丝素蛋白纳米纤维的提取具有重要意义。
附图说明
图1是实施例1提取的丝素纳米纤维的场发射扫描电镜照片。
图2是实施例2提取的丝素纳米纤维的场发射扫描电镜照片。
图3是实施例3提取的丝素纳米纤维的场发射扫描电镜照片。
图4是实施例1提取的丝素纳米纤维和正常脱胶蚕丝的红外谱图。
图5是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
下述实施例中的试验方法，若无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
1)将二水合草酸和氯化胆碱以1:1的摩尔比在80℃下混合、溶解，制备得到二水合草酸/氯化胆碱DES。
2)将1g废弃蚕茧剪碎浸入到步骤1)得到的100g二水合草酸/氯化胆碱DES中，在80℃下磁力搅拌5h后加入相同体积的去离子水来终结反应，得到浆液状物质。
3)将步骤2)得到的浆液状物质过滤，并水洗去除二水合草酸/氯化胆碱DES，得到处理后的蚕丝纤维A和滤液B。
4)将步骤3)得到的蚕丝纤维A加入到100g去离子水中搅拌、分散，随后超声处理1h，去除未剥离的蚕丝纤维后，即得到分散性良好的丝素纳米纤维分散液，经冻干，得到丝素纳米纤维，得率为40.4％。
由图1可知，丝素纳米纤维的粒径分布为20-80nm。
由图4可知，丝素纳米纤维的二级结构与脱胶蚕丝保持一致。
5)将步骤3)得到的滤液B在60℃烘箱中除水浓缩，然后转移到预冷(0～4℃)的乙醇溶剂中(质量比1:4)，待滤液中的丝蛋白沉淀析出后，离心得到沉淀物C和上清液D。沉淀物C经冻干，即得水解丝蛋白粉，得率为20.4％。滤液D在60℃烘箱中除水浓缩以回收DES循环使用。
实施例2
1)将二水合草酸和氯化胆碱以1:1的摩尔比在80℃下混合、溶解，制备得到二水合草酸/氯化胆碱DES。
2)将1g废弃蚕茧剪碎浸入到步骤1)得到的100g二水合草酸/氯化胆碱DES中，在90℃下磁力搅拌5h后加入相同体积的去离子水来终结反应，得到浆液状物质。
3)将步骤2)得到的浆液状物质过滤，并水洗去除二水合草酸/氯化胆碱DES，得到处理后的蚕丝纤维A和滤液B。
4)将步骤3)得到的蚕丝纤维A加入到100g去离子水中搅拌、分散，随后超声处理1h，去除未剥离的蚕丝纤维后，即得到分散性良好的丝素纳米纤维分散液，经冻干，得到丝素纳米纤维，得率为24.1％。
由图2可知，丝素纳米纤维的粒径分布为40-60nm。
5)将步骤3)得到的滤液B在60℃烘箱中除水浓缩，然后转移到预冷的乙醇溶剂中(质量比1:4)，待滤液中的丝蛋白沉淀析出后，离心得到沉淀物C和上清液D。沉淀物C经冻干，即得水解丝蛋白粉，得率为40.6％。滤液D在60℃烘箱中除水浓缩以回收DES循环使用。
实施例3
1)将二水合草酸和氯化胆碱以1:1的摩尔比在80℃下混合、溶解，制备得到二水合草酸/氯化胆碱DES。
2)将1g废弃蚕茧剪碎浸入到步骤1)得到的100g二水合草酸/氯化胆碱DES中，在80℃下磁力搅拌24h后加入相同体积的去离子水来终结反应，得到浆液状物质。
3)将步骤2)得到的浆液状物质过滤，并水洗去除二水合草酸/氯化胆碱DES，得到处理后的蚕丝纤维A和滤液B。
4)将步骤3)得到的蚕丝纤维A加入到100g去离子水中搅拌、分散，随后超声处理1h，去除未剥离的蚕丝纤维后，即得到分散性良好的丝素纳米纤维分散液，经冻干，得到丝素纳米纤维，得率为15.1％。
由图3可知，丝素纳米纤维的粒径分布为20-40nm。
5)将步骤3)得到的滤液B在60℃烘箱中除水浓缩，然后转移到预冷的乙醇溶剂中(质量比1:4)，待滤液中的丝蛋白沉淀析出后，离心得到沉淀物C和上清液D。沉淀物C经冻干，即得水解丝蛋白粉，得率为45.6％。滤液D在60℃烘箱中除水浓缩以回收DES循环使用。
从实施例1、2、3提取的丝素纳米纤维的场发射扫描电镜照片可看出，其形貌接近于棒状，通过调控反应温度和加工时间，SNF的粒径分布可从20-80nm收窄至20-40nm。实施例1、2、3中DES溶剂的回收率为95％以上，且在4个循环后性能也基本保持不变。

Claims (6)

1.一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将二水合草酸和氯化胆碱以1:1的摩尔比在80℃下混合、溶解，制备得到二水合草酸/氯化胆碱低共熔溶剂；
2）将废弃蚕茧剪碎浸入步骤1）得到的二水合草酸/氯化胆碱低共熔溶剂中，在80℃~90℃温度下磁力搅拌5h~ 24h后加入与低共熔溶剂体积相同的去离子水终结反应，得到浆液状物质；
通过调节步骤2）中磁力搅拌的温度和时间控制丝素纳米纤维的粒径分布范围；
3）将步骤2）得到的浆液状物质过滤，并水洗去除二水合草酸/氯化胆碱低共熔溶剂，得到过滤后的蚕丝纤维A和滤液B；
4）将步骤3）得到的蚕丝纤维A加入到100g去离子水中搅拌、分散，随后超声处理1h，离心去除未剥离的蚕丝纤维后，即得丝素纳米纤维分散液，经冻干，得到丝素纳米纤维；
5）将步骤3）得到的滤液B在60℃烘箱中除水浓缩，然后转移到预冷的乙醇溶剂中，待滤液B中的丝蛋白沉淀析出后，离心得到沉淀物C和上清液D；沉淀物C经冻干，即得水解丝蛋白粉；
6）将步骤5）中的上清液D在60℃烘箱中除水浓缩以回收草酸/氯化胆碱低共熔溶剂循环使用。
2.根据权利要求1所述的一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法，其特征在于：提取液为步骤6）回收的草酸/氯化胆碱低共熔溶剂。
3.根据权利要求1所述的一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法，其特征在于，所述步骤2）中，废弃蚕茧与二水合草酸/氯化胆碱低共熔溶剂的质量比为1:100。
4.根据权利要求1所述的一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法，其特征在于，所述步骤5）中，通过有机溶剂沉淀法，在滤液B中加入乙醇回收水解丝蛋白，滤液B与乙醇的质量比为1:4。
5.根据权利要求1所述的一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法，其特征在于，所述步骤4）中，丝素纳米纤维的直径为10-40nm。
6.根据权利要求1所述的一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法，其特征在于，所述步骤4）中，丝素纳米纤维的得率在15-40%之间；所述步骤5）中，水解丝蛋白粉的得率在20-50%之间。
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