CN1141592A - 含有血纤维蛋白溶酶原活化剂的药剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含有血纤维蛋白溶酶原活化剂，糖和凝血酸的药物制剂，其剂型为冻干物或注射输注溶液，特别涉及含有一种糖，磷酸盐缓冲剂，凝血酶和一种表面活性剂的制剂以及pH值最好为5.5-6.5的液体溶液。
Description
本发明涉及含有血纤维蛋白溶酶原活化剂或与活性物质相同的衍生物的药物制剂，并分别涉及冻干物或注射和输注溶液形式相关给药剂型。
人组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(t-PA)对溶解血凝块，如心肌梗塞中的血凝块，具有很好的治疗作用。t-PA通过激活血纤维蛋白溶酶原为血纤维蛋白溶酶，导致血凝块溶解。血纤维蛋白溶酶接着溶解血纤维蛋白，它是血凝块蛋白物质的主要成分。
天然的t-PA由多个官能区域结构F，E，K1，K2和P组成。区域结构P包括能使血纤蛋白溶酶原裂解为血纤维蛋白溶酶的解蛋白活性中心。通过遗传工程，特别是真核细胞和原核细胞的t-PA或多种t-PA突变蛋白的遗传工程方法，制备血纤维蛋白溶酶原活化剂(PA)是已知的。这里，与天然t-PA不同，t-PA衍生物是从非糖基化形式的原核生物中合成的。
大体上来说，本发明意义上的t-PA衍生物，特别是那些通过重组制备的，有可能成为血纤维蛋白溶酶原活化剂，血纤维蛋白溶酶原活化剂基上由能使凝血酶产生血纤维蛋白溶解作用的天然蛋白的蛋白区域组成。这里，在t-PA序列中有单个或多个氨基酸缺失或取代的t-PA衍生物也可使用。
按照本发明，下列的血纤维蛋白溶酶原活化剂可以使用，如：t-PA(例如，Alteplase)，LY 210825(从“Syrian hamster”细胞系中得到的K2P，Circ.1990，82，930-940)；ΔFE3x和ΔFE1x(K1K2P，Blood1988，71，216-219)；ΔFEK1(来源于C127小鼠细胞的K2P，J.Cardiovasc，Pharmacol.1990，16，197-209)；E-6010(Jap.Circ.J.1989，53，p.918)；t-PA变异体(Thromb.Haemost.1989，62，p.542)；K2P和D-K2P(Thromb.Haemost.1989，62，p.393)；MB-1018，背面4，II-15)；K1K2P(Thromb.Res.1988，50，33-41)；FK1K2P(J.Biol.Chem.1988，263，1599-1602)；t-PA的TNK变异体(WO93/24635)；bat-PA(Witt et al.，Blook 1992，79，1213-1217，以及Mullot et al.，Arterioscler.Thrombos.1992，12，212-221)。特别是那些含有t-PA圈状2区域结构(“K2”)和/或丝氨酸蛋白酶区域结构(“P”)的血纤维蛋白溶酶原活化剂可以使用。在这方面，EP0382174(WO90/09437)中有K2P型t-PA突变蛋白“r-PA”的实例。
更具体地说，本发明涉及下列出版物中所述的K2P，K1K2P，FK1K2P和FK2K2P型血纤维蛋白溶酶原活化剂：protein Engineering 5(1)，93-100(1992)；DE-OS-3923339.1；Circ.1990，82，930-940；J.Cardiovasc.Pharmacol.1990，16，197-203；blood 1988，71，216-219；j.Biol.Chem.1988，263，1599-1602；Thromb.Haemost.1989，62，p.543。特别是可使用如EP-A-0382174和Protein EngineeringVol 5(1)，P.93-100(1992)中所述的重组K2P型血纤维蛋白溶酶原活化剂。另外，下列专利申请中描述了此型t-PA突变蛋白：US4,970,159，EP-A-0196920，EP-A-0207589，AU61804186，EP-A-0231624，EP-A-0289508，JP63133988，EP-A-0234051，EP-A-0263172，EP-A-0241208，EP-A-0292009，EP-A-0297066，EP-A-0302456，EP-A-0379890。
糖比例对蛋白质的溶解性和聚集性的显著影响，是已知的现有技术(J.Biol.Chem.263(1988)，8832-8837)。因而，这在EP-B-458950中已确认，例如区域结构组合K2P的非糖化重组血纤维蛋白溶酶原活化剂的溶解性比例如糖化t-PA衍生物明显的低。非糖化血纤维蛋白溶酶原活化剂如r-PA，在常规用于溶解蛋白的缓冲液(如50毫摩尔/L pH值为6的柠檬酸钠，50毫摩尔/L的磷酸盐缓冲液或NaCl生理盐溶液)中仅有轻微程序的溶解，就已是一个规律。但是，用作治疗剂时则要求所含血纤维蛋白溶酶原活化剂的浓度要足够高，最好能够达到10mg/ml。
从EP-A-0217379中已知：可以通过中性或弱碱性的精氨酸制剂增加源于原核生物的t-PA的溶解性。但是，此步骤受以下不利因素的影响，即源于原核生物的t-PA只能在很高的精氨酸浓度下很好地溶解。
另外，从WO90/01333，WO89/050347，WO90/08557，EP0297294，EP0156169和EP0228862中已知血纤维蛋白溶酶原活化剂或其衍生物的盖仑制剂。
WO90/01333(Invitron)描述了将赖氨酸，组氨酸，精氨酸与柠檬酸混合用于t-PA，以及源于细菌的衍生物。柠檬酸的使用量为5毫摩尔/升，赖氨酸，组氨酸，赖氨酸的量为150毫摩尔/升，pH值为6。还可以加入白蛋白。
WO89/050347(Invitron)描述了pH值为5-8的精氨酸(20-200毫摩尔/升)和柠檬酸(20-80毫摩尔/升)的混合液。
WO90/08557(Genetics Institute)公开了一种肌酸酐与多种添加剂如组氨酸、精氨酸、脯氨酸、甜菜碱、胆碱、咪唑、色氨酸、柠檬酸的混合物，混合物中还可以加入谷氨酸、天冬氨酸和琥珀酸。
EP0297294(Behring)公开了由至少两种氨基酸如赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、凝血酸的和其它添加剂组成的pH值为5-10的组合物。
EP0156169(Asahi)描述了鸟氨酸和/或赖氨酸，还可以加入柠檬酸、甘氨酸或磷酸盐。EP0228862(Genentech)公开了一种含有精氨酸的制剂，其中氯化物可有可无，洗涤剂可有可无。
EP0458950(Boehringer Mannheim)中同样描述了r-PA的其它制剂，它是在用柠檬酸缓冲的溶液中分别分别含有赖氨酸和赖氨酸类似物的制剂。但是，最近的实验说明：这些制剂r-PA的溶解性还不够完全充分。事实上已经确定：通过增加柠檬酸的浓度可以提高其溶解性；但是这样的制剂不能或只能部分地被静脉耐受。而且，与此相关的高盐浓度和低玻璃态化温度(Tg′)导致这些制剂的冷冻干燥必须在-45℃和-50℃以下的温度下完成。从技术上讲，这些温度常常只能在高消耗的情况下才能达到，而且需要复杂的监控要素来监测冷冻干燥的最佳条件。另外，这还包括较高的能量消耗。此外，对于工业生产来说，现有的是一些使用相当陈旧的冻干设备，缺乏必要的复杂测量和控制技术，因而，通常只能保证工作温度为-45℃左右。
本发明的目的是提供血纤维蛋白溶酶原活化剂及其衍生物的制剂，这些制剂可被静脉较好地耐受，含有足够高浓度的活性物质，并且能保证活性物质的良好溶解性，同时还能在延长的时间内保持冻干物中PA的稳定性。另外，为确保此冻干物具有良好的再生产性产品质量，本发明致力于开发确实能够以工业生产规模进行冻干的制剂。
本发明的目的通过一种含有血纤维蛋白溶酶原活化剂的药物制剂实现，此制剂含有至少一种糖和凝血酸作为药物添加剂。以冻干形式，此制剂贮存较长时间后仍保持稳定。同样，通过水分恢复而制备的水注射液也符合提高贮存稳定性的标准。特别是，在溶液的pH值调至5.5-6.5的情况下。此药物制剂可以含有常规的缓冲物或表面活性物质(阴离子，阳离子或中性表面活性剂)作为其它的添加剂。
欧洲专利申请EP-A-0382174中详细描述了血纤维蛋白溶酶原活化剂K2P(BM 06.022)可用作本发明血纤维蛋白溶酶原活化剂(PA)的一个实施例。它由人t-PA的圈状2(K2)和蛋白酶区域(P)组成，而且由于它是在大肠杆菌细胞中表达的以非糖基化形式存在。
对于糖，本发明制剂含有单糖或双糖较好。双糖，特别是蔗糖、海藻糖、麦芽糖或乳糖可以使用。尤其单糖是半乳糖、或相应的氨基糖比如半乳糖胺。优选使用非还原性糖蔗糖和海藻糖。水注射液中糖的浓度优选40-100mg/ml，其中50-70mg/ml更佳。
对于缓冲物，药物制剂可含有能达到此目的的常用物质以及强酸与弱碱或弱酸与强碱的代表性盐。例如，这里可指出的：磷酸，酒石酸，苹果酸等的碱金属盐。氨基酸也可使用。本发明制剂中含有磷酸盐缓冲液较好，特别是在供注射用的水溶液中浓度为50-300毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液，浓度为80-220毫摩尔/升的较好，130-170毫摩尔/升的更佳。优先使用磷酸氢二钠或二钾作为磷酸盐缓冲液，并用磷酸调节至其各自的pH值。
对于增溶剂，本发明制剂含有凝血酸(TES)。液射用水溶液中凝血酸的浓度优选1-50毫摩尔/升，8-12毫摩尔/升的更佳。应用10毫摩尔/升的浓度尤其有利。惊奇地发现：凝血酸可提高血纤维蛋白溶酶原活化剂的溶解性，特别是水介质中非糖基化血纤维蛋白溶酶原活化剂的溶解性。例如，对于血纤维蛋白溶酶原活化剂衍生物r-PA来说，至少将其溶解性提高1.5倍(相对于无凝血酸的溶液)。溶解性增加的倍数优选在2-3范围。这种作用首先在血纤维蛋白溶酶原活化剂的冻干药剂的制剂范围内是有利的，这是因为所用溶液中血纤维蛋白溶酶原活化剂的浓度有升高的可能性，生产过程中所用水量可明显减少，并且从整体上来说：所完成的生产既节约能量又使成本利用更有效。尤其是在生产过程中缩短了冻干期。
对于表面活性剂，可应用非离子、阴离子或阳离子表面活性剂，但是使用非离子表面活性剂如吐温80或吐温20较好。此表面活性剂的浓度为0.005-0.1％(W/V)，且0.01％为最佳。
本发明中水剂药物制剂的适宜PH值为5.5-6.5。PH值为5.8-6.2最佳。
本发明制剂所含活性物质的浓度在10mg/ml以下，3-5mg/ml最佳。
本发明药物制剂可用作注射或输注溶液，这可以通过提供一种含有本发明组合物的注射用溶液完成。但是，此药物制剂也可以通过冻干物形式提供。然后用本领域普通技术人员已知的适于注射的试剂或溶液(如用水)来重新配制。对于注射介质来说，水是用于本发明制剂的优选介质，它还可以含有常规的等渗添加剂如生理浓度的NaCl。
同样，本发明涉及含有血纤维蛋白溶酶原活化剂或其衍生物且pH值为5.5-6.5的pH值为药物制剂的生产方法，以及它们在生产本发明药物制剂上的应用。
另外，本发明还涉及一种具体的药物佐剂混合物的应用，此混合物由一组糖和凝血酸组成，它有利于血纤维蛋白溶酶原活化剂的长期稳定。特别是为获得较好的贮存稳定性，佐剂糖、磷酸盐缓冲剂、凝血酸和表面活性剂的混合物尤其有利。
稳定性实验表明：本发明制剂作为溶液在4℃下至少保持稳定30天。本发明冻干活性物质的稳定性在4℃保持2至5年。特别有利的影响是：即使在增加热应力情况下，此药物制剂仍具有很好的稳定性，这使它们对温度波动很不敏感，这种变化特别是在地球气候较温暖的地区可能发生，而且当低温环节中断时，更是如此。在给药剂型方面由于经常涉及到从药物生产厂家到各个国家消费者长距离的运输过程，制剂无意中经受温度波动，甚至可能是在长时间内的温度波动，都不能避免，这造成蛋白的活性丧失，因而在这种非常情况下，影响了治疗的成功。然而，本发明的给药剂型对这样的温度波动很不敏感。在稳定性的预备试验中可能已经证明：甚至在30天时间内经受35℃，仍未发现蛋白稳定性有明显减弱。因而可设想：此制剂在适当的冷藏温度下，具有2至5年的稳定性。
另外，本发明制剂的优点是用于制备冻干物的冷冻溶液的玻璃态化温度(Tg′)比较高，在-33℃到-40℃之间，以便确保在生产规模下此冻干物产品质量的重现性也具有足够的可靠性。比较高的玻璃态化温度是很有利的，因为如果在通常很长的冻干期内出现由技术引起的或未预见到的温度升高，此冷冻溶液的非故意熔化的危险性可能较小。在玻璃态化温度低于-40℃以及在冻干过程中出现超过此温度的情况下，特别是冻干技术设备的工作温度稍稍接近于-45℃时，这种玻璃态化温度的不必要超出，可能导致冷冻溶液的不利变化，结果不再能保证足够好的产品质量。这样，蛋白的活性丧失和聚集物的形成就可能出现，特别是在含蛋白的冻干物的情况下会出现。具有玻璃态化温度为-33℃--40℃的本发明制剂的另一个优势是：由于此冻干过程不必在-50℃以下进行，从而降低了冻干过程中所需的能源消耗。
按照本发明，特别是当一种钾盐例如磷酸氢二钾或磷酸二氢钾充当冻干所需溶液的磷酸盐缓冲剂时，可以获得用于冷冻溶液的比较高的玻璃态化温度。在这点上，特别是可以使用浓度为20-40mg/ml磷酸氢二钾，20-30mg/ml的最佳。可以通过加入蔗糖来增强玻璃态化温度的升高。在这点上，所加入的蔗糖的浓度优选60-90mg/ml，特别优选的浓度为60-80mg/ml。尤其是应用一种含有约26mg/ml的磷酸氢二钾(K2HPO4x12H2O)和约70mg/ml的蔗糖的溶液更好。用优选的85％的磷酸(约12mg/ml)将溶液的pH值调至6。该溶液还含有大约0.5-5mg/ml，优选1-2mg/ml的凝血酸，特别是大约1.6mg/ml。除此之外，此溶液还含有表面活性剂如吐温80，它的优选浓度为0.01-0.3mg/ml，特别是0.1mg/ml左右。
本发明冻干物的另一个优点是：冻干过程完成后，它们显示出较低的残留湿度。尤其是，残留湿度的值在5％以下，在0.5-4％范围内较好，尤其是1-3％。冻干物的残留湿度值通常在6％水平以上，低的残留湿度有助于提高制剂的贮存稳定性。具有较高残留湿度的制剂通常导致蛋白的不稳定，这一点可以从生物活性丧失和聚集物的形成中明显看到。
本发明制剂的另一个优点是：在生产冻干物时，由于非糖基化血纤维蛋白溶酶原活化剂溶解性的增加，特别是在加入凝血酸而获得的K2P，K1K2P，或P型突变蛋白的情况下，可以从较小量的溶液开始冷冻(例如每个给药剂型约为5ml)，以便使目前所用于制备(如每个给药剂型约10ml)冻干物的溶液的冻干期明显地缩短，优选地是，以含有比用于注射的水溶液剂型高两倍浓度活性物质的溶液开始冷冻，这样可以使用5毫升的水溶液替代常用的10毫升溶液。
静脉耐受性的试验说明：本发明制剂具有很好的耐受性。
下面的实施例用于更详细地说明本发明，但本发明并不局限于此。实施例1
本发明制剂在机械应力下的混浊/光散射的测量
将r-PA(BM 06.022)的蛋白浓度(Cprot.)调至6mg/ml(通过一个Amicon YM10滤膜的超滤作用)，并用如示的缓冲液渗析。然后，将这些样品调至Cprot.＝4mg/ml，并且a)保持它们不变，b)添加0.01％吐温，C)添加0.01％吐温20。
每个样品在一个Whirl Mix(Janke&Kunkel，IKA，Labortechnik VF2，最大转动速度)上经受应力10秒。然后，将这些样品在室温下保温2分钟。
通过荧光测定法在25℃下测量未受应力和已受应力的样品的光散射(Ex.360nm，Em.：360nm；Ex.频路：3nm；Em频路：10nm；测量间隔：3分钟内10秒钟的间隔)。样品的光散射值见于附图1中，并通过缓冲液的荧光校正每一个值。结果：本数据显示出，不加表面活性剂，经受机械应力的样品的光散射大幅度地增长(附图1)。加入表面活性剂，最大程度地抑制了此增长。在测量精度范围内，吐温80和吐温20之间没有明显区别。
(样品A、B、C、D的机械应力的)所得结果总结于附图1中，附图1中所用的缩写含义如下：
A)150mM的Na2HPO4/H3PO4，pH6.0
10mM的TES
50mg/ml的蔗糖
a)无表面活性剂
b)有0.01％的吐温80
c)有0.01％的吐温20
B)150mM的Na2HPO4/H3PO4，pH6.0
10mM的TES
50mg/ml的海藻糖
a)无表面活性剂
b)有0.01％的吐温80
c)有0.01％的吐温20
C)150mM的K2HPO4/H3PO4，pH6.0
10mM的TES
50mg/ml的蔗糖
a)无表面活性剂
b)有0.01％的吐温80
c)有0.01％的吐温20
D)150mM的K2HPO4/H3PO4，pH6.0
10mM的TES
50mg/ml的海藻糖
a)无表面活性剂
b)有0.01％的吐温80
c)有0.01％的吐温20实施例2
含有TES/蔗糖的本发明制剂中r-PA(BM 06.022)
的贮存以及多次冻结和融化
用表1中所示的缓冲液(无吐温80)渗析r-PA，调至Cprot.＝4mg/ml，添加吐温80至浓度为0.01％，分成等份，无菌过滤。每次分别在-20℃和-70℃下冻结9个样品。按照表中所示的天数融化全部样品(在25℃水浴中15分钟)，对照组除外。每次分析一个样品(Cprot.和酰胺分解活性)。分别在-20℃和-70℃下冻结其余样品。这一系列完成后，测定未受应力的样品的活性。结果：从表1数据中可以明显看到：r-PA可被冻结和融化至少8次而没有丧失活性。
表1 150mM的Na2HPO4/H3PO4，pH6.0
10mM的TES
50mg/ml的蔗糖
0.01％的吐温80
| -20℃ | -70℃ | |||
| 天数 | Cprot.[mg/ml] | AA[MU/ml] | Cprot.[mg/ml] | AA[MU/ml] |
| 0 | 4.1 | 3.1 | 4.1 | 3.1 |
| 1 | 4.5 | 3.1 | 4.6 | 3.0 |
| 2 | 4.6 | 3.2 | 4.8 | 3.1 |
| 3 | 4.3 | 3.1 | 4.0 | 3.0 |
| 4 | 4.8 | 3.1 | 4.7 | 3.1 |
| 5 | 4.1 | 3.3 | 4.1 | 3.2 |
| 6 | 4.2 | 3.0 | 4.2 | 3.1 |
| 7 | 4.1 | 3.1 | 4.3 | 3.2 |
| 8 | 4.0 | 2.9 | 4.3 | 3.1 |
| 对照组 | 4.3 | 3.0 | 4.3 | 3.1 |
对照组：检测未处理样品
AA：酰胺分解活度
Coprot.：蛋白浓度实施例3
溶液中r-PA的稳定性/Cprot.＝4mg/ml的多种制剂的比较
通过一个Amicon YM 10的滤膜浓缩r-PA(BM 06.022)至5mg/ml，并且表2中所示的缓冲液(无吐温80)渗析。调渗析液至Cprot.＝4mg/ml，添加吐温80至C＝0.01％，分份，并在-20℃和4℃下贮存。在7，14，20和30天后，测定此受应力样品的酰胺分解活度和蛋白浓度。结果：贮存于-20℃和4℃下的样品30天内保持不变。
表2 150mM的Na2HPO4/H3PO4，pH6.0
10mM的TES
50mg/ml的海藻糖
0.01％的吐温80
| -20℃ | +4℃ | |||
| 天数 | Cprot.[mg/ml] | AA[MU/ml] | Cprot.[mg/ml] | AA[MU/ml] |
| 0 | 3.9 | 2.1 | ||
| 7 | 3.9 | 2.3 | 3.97 | 2.4 |
| 14 | 3.9 | 2.3 | 3.98 | 2.4 |
| 20 | 3.9 | 2.3 | 3.9 | 2.4 |
| 30 | 3.9 | 2.3 | 3.9 | 2.4 |
AA：酰胺分解活度 Cprot.：蛋白浓度实施例4
溶液中的r-PA的稳定性/Cprot.＝6mg/ml的多种制剂的比较
用如下所示的缓冲液渗析r-PA(BM 06.022)一夜，并通过一个Amicon YM 10滤膜浓缩调至Cprot.＝6mg/ml，每份装样品1ml，在-20℃和40℃下贮存30天。1，2，5，9，15和29天后，每次都测定其酰分解活度和蛋白水平。
表3 200mM的Na2HPO4/H3PO4，pH6.0
10mM的TES
50mg/ml的蔗糖
0.01％的吐温80
AA：酰胺分解活度 Cprot.：蛋白浓度
| -20℃ | +4℃ | |||
| 天数 | Cprot.[mg/ml] | AA[MU/ml] | Cprot.[mg/ml] | AA[MU/ml] |
| 0 | 6.0 | 3.3 | 6.0 | 3.3 |
| 1 | 5.7 | 3.3 | 5.7 | 3.6 |
| 2 | 5.8 | 3.3 | 5.9 | 3.4 |
| 5 | 5.9 | 3.2 | 6.0 | 3.6 |
| 9 | 6.0 | 3.3 | 5.9 | 3.7 |
| 15 | 5.8 | 3.5 | 5.9 | 3.5 |
| 29 | 5.9 | 3.6 | 5.9 | 3.8 |
表4 150mM的Na2HPO4/H3PO4，pH6.0
10mM的TES
50mg/ml的蔗糖
0.01％的吐温80
| -20℃ | -70℃ | |||
| 天数 | Cprot.[mg/ml] | AA[MU/ml] | Cprot.[mg/ml] | AA[MU/ml] |
| 0 | 5.9 | 3.5 | 5.9 | 3.5 |
| 1 | 5.5 | 3.5 | 5.6 | 3.4 |
| 2 | 5.6 | 3.4 | 5.5 | 3.5 |
| 5 | 6.0 | 3.5 | 6.2 | 3.6 |
| 9 | 6.0 | 3.3 | 6.0 | 3.3 |
| 15 | 6.0 | 3.6 | 5.9 | 3.1 |
| 29 | 5.9 | 3.5 | 6.0 | 3.6 |
AA：酰胺分解活度 Cprot.：蛋白浓度结果：表中显示：上述制剂的活性物质BM 06.22在-20℃和4℃下至少稳定29天。实施例5
本发明制剂中r-PA的溶解性
用YM 10将r-PA(BM 06.022)浓缩至6mg/ml，并用如下所示的缓冲液渗析。接着用一个AMico YM 10滤膜浓缩直到发生混浊。样品离心后，将上清液在4℃下贮存五天。在贮存开始和结束时测定酰胺分解活度和Cprot。
表5 150mM的Na2HPO4/H3PO4，pH6.0
10mM的TES
50mg/ml的蔗糖
0.01％的吐温80
| 天数 | Cprot.[mg/ml] | AA[MU/ml] |
| 0 | 10.2 | 4.8 |
| 5 | 10.2 | 4.9 |
AA：酰胺分解活度 Cprot.：蛋白浓度结果：r-PA的溶解度约为10mg/ml。在最大的蛋白浓度下，样品可实施例6
液体给药剂型的制备
制备下列的给药剂型，作为冷冻干燥前的溶液：冷冻干燥前溶液的组成：溶液A：BM 06.022 4mg/ml
Na2HPO4.12H2O 53.72mg/ml
H3PO485％ 11.3mg/ml
凝血酸 1.6mg/ml
蔗糖 50mg/ml
吐温80，pH6 0.1mg/ml溶液B：BM 06.022 4mg/ml
K2HPO4 26.2mg/ml
H3PO485％ 11.6mg/ml
凝血酸 1.6mg/ml
蔗糖 70mg/ml
吐温80，pH6 0.1mg/ml冻干物的制备：
无菌过滤后，分成等份，每份5ml，装入20ml玻璃管中。冻干物作如下处理：将装好的玻璃管放入冷冻干燥器中，在隔板温度为-40℃--50℃温度，常压下，冷冻10小时。然后，使干燥室内真空值P＝0.01-1mbar。之后，调整隔板温度，以保证任何时间的产物温度都在各自的玻璃态化温度以下。一旦所有的冰已升华，使隔板温度升至20-40℃，然后，在真空下完成后干燥。按照常规的方法测定剩余湿度(按照Karl Fischer方法测定)，A溶液的剩余湿度为6％，B溶液的剩余湿度为3％。贮存此冻干物，用来检验其稳定性。检验在4℃(冷冻温度)，20℃(室温)和35℃的温度下进行。正如从酰胺分解活度和蛋白浓度的分析检测中所明显看到的那样，贮存4-12周后的此冻干物在所示的温度下仍保持稳定。
为使用时作的冻干物的再配制：
向冻干物中加注射用水达到10ml。这个2倍稀释量与冻干前溶液的原始体积相对应。实施例7
本发明制剂的静脉耐受性的试验
制备表6中所列的两种含有此组合物的实际溶液和两种空白对照溶液，并静脉内给药于家兔。每只动物所用量为0.5ml，用五只动物接受这四种试验溶液。
表6：实际和空白对照溶液的组成
1.实际溶液
| 试验第93/1292号 | 试验第93/1294号 | |
| BM06.022 | 10MU | 10MU |
| 磷酸氢二钾 | 131.0mg | 131.0mg |
| 85％磷酸 | 58mg | 58mg |
| 凝血酸 | 8.0mg | 8.0mg |
| 蔗糖 | 250.0mg | 350.0mg |
| 多乙氧基醚 | 0.5mg | 0.5mg |
| 水p.i. | 加至10.0ml | 加至10.0ml |
| pH | 6.0 | 6.0 |
| 容积渗摩尔浓度 | 320毫渗摩尔 | 351毫渗摩尔 |
2.空白对照溶液
| 试验第93/1291号 | 试验第93/1293号 | |
| 磷酸氢二钾 | 131.0mg | 131.0mg |
| 85％磷酸 | 58mg | 58mg |
| 凝血酸Lc acid | 8.0mg | 8.0mg |
| 蔗糖se | 250.0mg | 350.0mg |
| 多乙氧基醚30 | 0.5mg | 0.5mg |
| 水p.i.. | 加至10.0ml | 加至10.0ml |
| pH | 6.0 | 6.0 |
| 容积渗摩尔浓度 | 322毫渗摩尔 | 343毫渗摩尔 |
结果：动物对注射的反应和组织学检查结果说明：所有接受试验溶液的动物都具有很好的耐受性。
Claims (19)
1、一种药物制剂，它含有一种血纤维蛋白溶酶原活化剂，一种糖和凝血酸。
2、按照权利要求1所述的制剂，其特征在于糖为一种双糖。
3、按照权利要求2所述的制剂，其特征在于糖为蔗糖或海藻糖。
4、按照权利要求1至3中任一所述的制剂，其特征在于它还含有一种缓冲物质，所述的缓冲物质为磷酸的一种钾盐，特别是磷酸氢二钾。
5、按照权利要求1至4中任一所述的制剂，其特征在于制剂的形式为一种冷冻溶液。
6、按照权利要求1至5中任一所述的制剂，其特征在于它含有40-100mg/ml的糖，最好为50-70mg/ml。
7、按照权利要求1至6中任一所述的制剂，其特征在于它含有50-300毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液，最好为80-220毫摩尔/升。
8、按照权利要求1至7中任一所述的制剂，其特征在于它含有1-50毫摩尔/升的凝血酸，最好为8-12毫摩尔/升。
9、按照权利要求1至8中任一所述的制剂，其特征在于它含有0.005-0.1％的表面活性剂，最好为0.01％。
10、按照权利要求1至9中任一所述的制剂，其特征在于它含有一种K2P型重组血纤维蛋白溶酶原活化剂，优选BM06.022。
11、按照权利要求1至9中任一所述的制剂，其特征在于它含有t-PA或其衍生物，浓度达10mg/ml。
12、按照权利要求1至4或9至11中任一所述的制剂，其特征在于给药剂型为一种冻干物。
13、按照权利要求1至4或6至11中任一所述的制剂，其特征在于给药剂型为一种水溶液，并且此溶液的pH值为5.5-6.5。
14、一种制备如权利要求1至13中任一所述的药物制剂的方法，其特征在于将此血纤维蛋白溶酶原活化剂和糖以及凝血酸一同转化为一种适宜的给药剂型。
15、一种制备如权利要求12中所述的冻干药物制剂的方法，其特征在于制备一种含有一种血纤维蛋白溶酶原活化剂、糖和凝血酸的水溶液，冷冻此溶液，将此冷冻溶液的温度调至玻璃态化温度以下，在-40℃至-50℃之间较好，并且在真空下冷冻干燥此冷冻溶液。
16、按照权利要求15中所述的方法，其特征在于，冻干过程从含有活性物质的溶液开始，其活性物质的浓度达现成水注射液或输注溶液浓度的3倍。
17、一种由这组糖、磷酸盐缓冲剂、凝血酸和表面活性剂组成的药物佐剂混合物用于制备含血纤维蛋白溶酶原活化剂且贮存稳定的药剂的用途。
18、按照权利要求17中所述的用途，用于生产可以稳定贮存至少2年的给药剂型。
19、凝血酸用于提高血纤维蛋白溶酶原活化剂溶解性的用途。
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