HU219769B

HU219769B - Plazminogén aktivátorokat tartalmazó gyógyszerkészítmény

Info

Publication number: HU219769B
Application number: HU9602284A
Authority: HU
Inventors: Stephan Fischer; Ulrich Kohnert; Hans-Jörg Markl; Heinrich Woog
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1994-02-21
Filing date: 1995-02-18
Publication date: 2001-07-30
Also published as: PT746334E; CZ243196A3; NZ281607A; KR970701059A; TW337997B; CN1141592A; PL315978A1; CN1170591C; DE4405426A1; NO963460D0; JPH09511495A; PL181257B1; HU9602284D0; MX9603515A; NO317726B1; AU1758195A; SK107996A3; DE59509580D1; FI117925B; EP0746334A1

Abstract

A találmány tárgya gyógyszerkészítmény, amely liofilizátumként vagyinjekciós, illetve infúziós oldatként plaz- minogénaktivátorokat,cukrot és tranexamsavat tartalmaz. A készítmények különösen cukrot,foszfátpuffert, tranexamsavat, valamint tenzidet tartalmaznak. Afolyékony oldatok pH-értéke előnyös módon 5,5–6,5. ŕ

Description

A találmány tárgyát hatóanyagokként plazminogénaktivátorokat vagy azok származékait tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint megfelelő gyógyszerészeti beadási formák képezik, liofilizátumok vagy injekciós, illetve infúziós oldatok formájában.

Az emberi szövet plazminogénaktivátorának (t-PA) nagy terápiái jelentősége van a véralvadék feloldásakor például szívinfarktus esetén. A t-PA a véralvadék feloldódását a plazminogén plazminná való aktiválásával idézi elő. A plazmin oldja a fibrint, az alvadt vér fehérjemátrixának fő komponensét.

A természetes t-PA több funkcionális - F, E, KI, K2 és P - tartományból tevődik össze. A P tartomány tartalmazza a proteolitikus aktív centrumot, amely a plazminogén plazminná való hasadását idézi elő. A plazminogénaktivátorok (PA), különösen a t-PA vagy a különböző t-PA-muteinek géntechnológiai előállítása eukariotikus és prokariotikus sejtekben már ismert. Eszerint a t-PA-származékokat prokariótákból - a természetes t-PA-val ellentétben - nem glikozilált alakban szintetizálják.

Plazminogénaktivátorokként a találmány értelmében elvileg a t-PA-nak olyan, különösen rekombinálva előállított származékai jönnek szóba, amelyek lényegében a természetes fehérjének ugyanazokat a fehérjerészeit tartalmazzák, amelyek a trombinok fibrinolízisét okozzák. Ily módon a t-PA-nak olyan származékai is alkalmazhatók, amelyek a t-PA szekvenciájában egy vagy több aminosav delécióival vagy szubsztitúcióival rendelkeznek.

A találmány szerint például a következő plazminogénaktivátorok alkalmazhatók: t-PA (például altepláz), LY 210825 (K2P a szíriai hörcsög sejtvonalaiból kapható, Circ. 1990. 82, 930-940); AFE3x és AFElx (K1K2P, Blood 1988, 71, 216-219); AFEK1 (K2P C127 egérsejtekből, J. Cardiovasc. Pharmacol. 1990, 16, 197 209); E-6010 (Jap. Circ. J. 1989, 53, p. 918); tPA-változatok (Thromb. Haemost., 1989, 62, p. 542); K2P és D-K2P (Thromb. Haemost., 1989, 62, p. 393); MB-1018 (FK2K2P, Thromb. Haemost., 1989, 62, p. 543); FK2P (FASEB J., 1989, 3, A1031, abstract 4791); Alx (Circulation, 1988, 4, 11-15); K1K2P (Thromb. Rés., 1988, 50, 33-41); FK1K2P (J. Bioi. Chem., 1988, 263, 1599-1602); a t-PA TNK-változatai (WO 93/24635 számú nemzetközi szabadalmi irat); bat-PA (Witt et al., Blood 1992; 79: 1213-1217 és Mullot et al., Arterioscler. Thrombos. 1992; 12: 212-221). Különösen olyan plazminogénaktivátorok jöhetnek szóba, amelyek a t-PA Kringel-2 tartományát („K2”) és/vagy a szerin-proteáz-tartományt („P”) tartalmazzák. Példaképpen erre vonatkozóan a K2P típusú „r-PA” nevű tPA-muteint nevezik meg, amelyet az EP 0 382 174 számú európai szabadalmi iratban (WO 90/09437 számú nemzetközi szabadalmi irat) ismertetnek.

A jelen találmány különösen a K2P, K1K2P, FK1K2P és FK2K2P típusú plazminogénaktivátorokra vonatkozik, ahogy ezek a következő iratokban vannak ismertetve: Protein Engineering 5(1), 93-100 (1992); DE-OS-39 23 339.1 számú német közzétételi irat; Circ. 1990, 82, 930-940; J. Cardiovasc. Pharmacol. 1990, 16, 197-203; Blood 1988, 71, 216-219; J. Bioi.

Chem. 1988, 263, 1599-1602; Thromb. Haemost. 1989, 62, p. 543. Különösen K2P típusú rekombináns plazminogénaktivátorokat alkalmaznak, ahogy ezek az EP-A-0 382 174 számú európai szabadalmi bejelentésben és a Protein Engineering Vol. 5(1), p. 93-100 (1992) publikációban vannak ismertetve. További ilyenfajta t-PA-muteineket a következő szabadalmi bejelentésekben ismertetnek: US 4 970 159, EP-A 0 196 920, EP-A 0 207 589; AU 61804/86; EP-A 0 231 624; EP-A 0 289 508; JP 63133988; EP-A 0 234 051; EP-A 0 263 172; EP-A 0241 208; EP-A 0 292 009; EP-A 0 297 066; EP-A 0 302 456; EP-A 0 379 890.

A technika állásából ismert, hogy a cukorrésznek jelentős befolyása van a fehérjék oldhatóságára és aggregációjára [J. Bioi. Chem. 263 (1988), 8832-8837], így az EP-B-458 950 számú európai szabadalmi iratban megállapították, hogy például a nem glikozilált rekombináns plazminogénaktivátomak a K2P tartományösszetétellel lényegesen rosszabb az oldhatósága, mint például a glikozilált t-PA-származékoknak. A nem glikozilált plazminogénaktivátorok, mint például az r-PA, rendszerint csak kismértékben oldódnak a fehérjék szolubilizálására általában alkalmazott pufferokban, mint például 50 mmol/1 Na-citrát pH 6,50 mmol/1 foszfátpuffer vagy fiziológiás NaCl-oldat. A terápiás hatóanyagként való alkalmazáshoz azonban szükséges, hogy a plazminogénaktivátorok koncentrációja elegendően nagy legyen, előnyös módon legfeljebb 10 mg/ml.

Az EP-A-0 217 379 számú európai szabadalmi bejelentésből ismert, hogy a prokariótákból származó tPA oldhatósága semleges vagy lúgos arginin-összetételekkel növelhető. Ennek az eljárásnak azonban az a hátránya, hogy a prokariótákból származó t-PA jó oldhatósága csak nagyon nagy argininkoncentrációkkal érhető el.

A plazminogénaktivátoroknak vagy azok származékainak további galenusi összetételei a WO 90/01333, a WO 89/050347, a WO 90/08557 számú nemzetközi szabadalmi iratokból, valamint az EP 0 297 294, az EP 0 156 169 és az EP 0 228 862 számú európai szabadalmi iratokból ismertek.

így a WO 90/01333 számú nemzetközi szabadalmi iratban (Invitron) lizin, hisztidin, arginin kombinációját ismertetik citráttal baktériumokból származó t-PA-hoz és származékaihoz. 5 mmol/1 citrátot, 150-150 mmol/1 lizint, hisztidint és arginint használnak 6 pH-η. Ezenkívül albumint adnak hozzá.

A WO 89/050347 számú nemzetközi szabadalmi iratban (Invitron) arginin (20-200 mmol/1) és cifrát (20-80 mmol/1) 5-8 pH-η előállított kombinációját ismertetik.

A WO 90/08557 számú nemzetközi szabadalmi irat (Genetics Institute) kreatinin kombinációját teszi közzé különböző adalékanyagokkal, például hisztidinnel, argininnal, prolinnal, betainnal, kollinnal, imidazollal, triptofánnal, citráttal, adott esetben glutaminsav, aszparaginsav és borostyánkősav hozzáadása közben.

Az EP 0 297 294 számú európai szabadalmi iratban (Behring) legalább két aminosav, például lizin, omitin,

HU 219 769 Β arginin, tranexamsav és más adalékanyagok 5-10 pH-n előállított kombinációját teszik közzé.

Az EP 0 156 169 számú európai szabadalmi irat (Asahi) omitint és/vagy lizint ismertet, adott esetben citrát, glicin vagy foszfát hozzáadásával, és az EP 0 228 862 számú európai szabadalmi irat (Genentech) olyan összetételt tesz közzé, amely arginint tartalmaz kloriddal vagy a nélkül, valamint detergenssel vagy a nélkül.

Az r-PA alternatív összetételeit ismertetik lizin, illetve lizinanalógok jelenlétében citromsavval pufferolt oldatokban az EP 0 458 950 számú európai szabadalmi iratban is (Boehringer Mannheim). Az újabb kutatások azonban azt mutatják, hogy az r-PA oldhatósága ezekben az összetételekben sem teljesen elegendő. Megállapították, hogy az oldhatóság a citrátkoncentráció növelésével ugyan javítható, az ilyen összetételek azonban nem vagy csak bizonyos feltételek között vénaösszeférők. Azonkívül a nagy sókoncentrációk és az ezzel összefüggő alacsony üvegesedési hőmérséklet (Tg’) miatt ezeknek az összetételeknek a liofilizálását -45—50 °C hőmérséklet alatt kell végezni. Ezek a hőmérsékletek üzemi körülmények között gyakran csak nagyon nagy ráfordítással valósíthatók meg, és költséges vezérlő- és ellenőrző elemeket igényelnek a liofilizálás optimális feltételeinek mérésére és szabályozására. Ezenkívül ezzel viszonylag nagy energiaráfordítás is jár. Hozzájön ehhez, hogy a nagyüzemi termékhez gyakran régebbi liofilizálóberendezéseket használnak, amelyek nem rendelkeznek a szükséges bonyolult mérés- és szabályozástechnikával, és amelyekkel ennek következtében rendszerint nem biztosítható a körülbelül -45 °C-os üzemi hőmérséklet.

Találmányunk célja olyan plazminogénaktivátorösszetételek és plazminogénaktivátorszármazékösszetételek előállítása, amelyek jó vénaösszeférők, a hatóanyagot megfelelően nagy koncentrációban tartalmazzák, és garantálják a hatóanyag jó oldhatóságát, és ahol a PA stabilitása a liofilizátumban hosszú ideig megmarad. Ezenkívül a találmány célja olyan összetételek kifejlesztése, amelyek nagyüzemi mennyiségben biztosan liofílizálhatók, amivel garantálható a liofilizátumok jól reprodukálható termékminősége.

A találmány szerinti feladatot plazminogénaktivátort tartalmazó gyógyszerkészítménnyel oldjuk meg, amely készítmény gyógyszerészeti adalékanyagokként legalább egy cukrot és tranexamsavat tartalmaz. A készítmény liofilizált formában hosszú ideig megtartja tárolási stabilitását. A rekonstitúcióval előállított vizes injekciós oldat is megfelel a megnövelt tárolási stabilitás kritériumának. Ez különösen akkor áll fenn, ha az oldat pH-értékét 5,5-6,5 közötti értékre állítjuk be. További adalékanyagként a gyógyszerkészítmény tartalmazhatja a szokásos pufferanyagokat vagy felületaktív anyagokat (anionos, kationos vagy semleges tenzidek).

A jelen találmány értelmében szóba jövő plazminogénaktivátorok (PA) közül példaképpen az EP-A-0 382 174 számú európai szabadalmi bejelentésben részletesebben ismertetett K2P plazminogénaktivátort (BM 06.022) használtuk. Ez Kringel-2-ből (K2) és az emberi t-PA proteáztartományából (P) áll, és expressziója miatt az Escherichia coli sejtekben glikozilálatlan formában van jelen.

A találmány szerinti összetételek cukorként előnyös módon mono- vagy diszacharidokat tartalmaznak. Diszacharidként különösen szacharóz, trehalóz, maltóz vagy laktóz jön szóba. Monoszacharidok különösen a galaktóz vagy a megfelelő aminocukrok, mint például a galaktóz-amin. Előnyös módon a nem redukáló cukrokat, a szacharózt vagy a trehalózt alkalmazzuk. A cukor koncentrációja a vizes injekciós oldatban előnyös módon 40-100 mg/ml, előnyös módon 50-70 mg/ml.

A gyógyszerkészítmények pufferanyagokként az erre a célra általában szóba jövő anyagokat tartalmazhatják, amelyek erős savak gyenge lúgokkal vagy gyenge savak erős lúgokkal alkotott sóit jelentik. Példaképpen említjük a foszforsav, borkősav, almasav és hasonlók alkálisóit. Ugyanígy szóba jöhetnek aminosavak. A találmány szerinti készítmények előnyös módon foszfátpuffert tartalmaznak. A foszfátpuffer koncentrációja a készen injektálható vizes oldatban különösen 50-300 mmol/1, előnyös módon 80-220 mmol/1, és különösen előnyös módon 130-170 mmol/1. Foszfátpufferként előnyös módon dinátrium- vagy dikálium-hidrogén-foszfátot alkalmazunk, amelyet foszforsavval állítunk be a mindenkori pH-értékre.

A találmány szerinti készítmények oldásközvetítőként tranexamsavat (TES) tartalmaznak. A tranexamsav koncentrációja a készen injektálható vizes oldatban különösen 1-50 mmol/1, előnyös módon 8-12 mmol/1. Különösen előnyös a 10 mmol/1 koncentráció alkalmazása. Meglepő módon úgy találtuk, hogy a tranexamsav vizes közegben növeli a plazminogénaktivátorok, különösen a nem glikozilált plazminogénaktivátorok oldhatóságát. Például az r-PA plazminogénaktivátor-származék esetében egy tranexamsav nélküli oldathoz képest legalább 1,5-szeres az oldhatóság. Az oldhatóság növekedési tényezője előnyös módon 2-3. Ez a hatás mindenekelőtt a plazminogénaktivátorok liofilizált gyógyszerkészítményekként való előállításakor előnyös, mivel azáltal, hogy lehetőség van a plazminogénaktivátor koncentrációjának növelésére az alkalmazott oldatokban, az előállítási folyamatban alkalmazandó vízmennyiség jelentősen csökkenthető, és összességében energiatakarékos és költségkímélő gyártás valósítható meg. Különösen a liofilizálási idő rövidül le az előállítási folyamat során.

Tenzidekként nemionos, anionos vagy kationos tenzidek, előnyös módon azonban nem ionizált tenzidek, mint például Tween-80 vagy Tween-20 használhatók. A tenzidkoncentráció 0,005-0,1 tömeg%, előnyös módon 0,01 tömeg%.

Egy vizes formában lévő, találmány szerinti gyógyszerkészítménynek az 5,5-6,5 közötti pH-érték, előnyös módon 5,8-6,2 pH-érték a megfelelő.

A találmány szerinti készítmények a hatóanyagot legfeljebb 10 mg/ml, előnyös módon 3-5 mg/ml koncentrációban tartalmazzák. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények injekciós vagy infúziós oldatokban kerülnek felhasználásra. Ez úgy történhet, hogy egy

HU 219 769 Β már fecskendőkész oldat áll rendelkezésre, amelynek a találmány szerinti összetétele van. A gyógyszerkészítmények azonban liofilizált formában is rendelkezésre bocsáthatók. Ezeket aztán már magukban ismert, injektálási célokra alkalmas szerekkel vagy oldatokkal (például vízzel) rekonstituáljuk. Injekciós közegként a találmány szerinti készítményekhez előnyös módon vizet használunk, amely adott esetben szokásos izotonikus adalékokat, mint például fiziológiás NaCl-koncentrációt tartalmazhat.

A találmány tárgya a plazminogénaktivátorokat vagy azok származékait tartalmazó, 5,5-6,5 pH-jú gyógyszerkészítmény előállítására szolgáló eljárás is, valamint ennek alkalmazása a találmány szerinti gyógyszerkészítmények előállítására.

A találmány tárgya ezenkívül - a plazminogénaktivátorok hosszú ideig tartó stabilitásához - cukor- és tranexamsavcsoportból álló gyógyszerészeti segédanyagok meghatározott keverékének alkalmazása. Különösen előnyös a cukor, foszfátpuffer, tranexamsav és tenzid segédanyagok kombinációja a jó tárolási stabilitás eléréséhez.

A stabilitási vizsgálatok szerint a találmány szerinti készítmények oldatokként 4 °C-on legalább 30 napig stabilak. A hatóanyag stabilitása a találmány szerinti liofilizátumokban 4 °C-on két-öt év. Különösen annak a ténynek előnyös a hatása, hogy a gyógyszerkészítményeknek nagyobb termikus terhelés esetén is kitűnő a stabilitásuk, amely a gyógyszerkészítményeket messzemenően érzéketlenné teszi a hőmérséklet-ingadozásokkal szemben. A hőmérséklet-ingadozások különösen a Föld melegebb klímájú területein, különösen a hűtőlánc megszakadásakor léphetnek fel. A gyógyszergyártótól a különböző országokban lévő végfelhasználóig tartó, gyakran hosszú eladási utak miatt a gyógyszerészeti beadási formák esetében nem kizárható, hogy a készítmények akaratlanul, adott esetben hosszú ideig is hőmérséklet-ingadozásoknak vannak kitéve, ami a feltétje aktivitásának csökkenését okozza, és ezzel szélsőséges esetben kérdésessé válik a gyógyszeres kezelés sikere. A találmány szerinti beadási formák azonban az ilyen hőmérséklet-ingadozásokkal szemben messzemenően érzéketlenek. Az előzetes stabilitási vizsgálatok szerint maguknál a készítményeknél 35 °C-os hőmérsékleten, amelynek 30 napig voltak kitéve, nem volt megállapítható említésre méltó károsodás a fehérje stabilitását illetően. Ennek következtében abból kell kiindulni, hogy a készítményeknek szabályszerű tárolás esetén, hűtőszekrény-hőmérsékleten két-öt év a stabilitása.

A találmány szerinti készítményeknek azonkívül az az előnye, hogy a liofilizátumok előállításához szükséges befagyasztott oldat üvegesedési hőmérséklete (Tg’) viszonylag magas, és -33 °C és -40 °C között van, úgyhogy a liofilizátumok termékminőségének reprodukálhatósága tömegtermelés esetén is elegendő biztonsággal garantált. A viszonylag magas üvegesedési hőmérséklet különösen azért előnyös, mivel a hőmérséklet műszakilag adott vagy előre nem látható emelkedésekor a gyakran nagyon hosszú liofilizálási idő alatt a befagyasztott oldatok nem szándékolt felolvadásának kockázata kevésbé valószínű. Azokban az esetekben, amikor az üvegesedési hőmérséklet -40 °C alatt van, és ezt a hőmérsékletet a liofilizálási folyamat alatt felfelé túllépjük, ami különösen az üzemi liofilizálóberendezéseknél következik be, amelyek -45 °C körüli hőmérsékleteken működnek, akkor az üvegesedési hőmérséklet nem kívánt túllépése a fagyott oldat hátrányos megváltozását okozhatja. Ekkor már nem garantált az elegendően jó termékminőség. Ez különösen a fehérjetartalmú liofilizátumoknál a fehérje aktivitásának csökkenéséhez, illetve aggregátumok képződéséhez vezethet. A -33—40 °C üvegesedési hőmérsékletű, találmány szerinti készítményeknél további előny, hogy a liofilizálási folyamathoz szükséges energiaráfordítás minimális, mert a liofilizálást nem kell feltétlenül -50 °C alatt végezni.

A jelen találmány értelmében különösen akkor érhető el a befagyasztott oldatok viszonylag magas üvegesedési hőmérséklete, ha a liofilizáláshoz szükséges oldatokhoz foszfátpufferként káliumsót, például dikáliumhidrogén-foszfátot vagy kálium-dihidrogén-foszfátot alkalmazunk. Ehhez különösen egy 20-40 mg/ml, előnyös módon 20-30 mg/ml koncentrációjú dikálium-hidrogén-foszfát jön szóba. Az üvegesedési hőmérséklet növekedését szacharóz hozzáadása fokozza. A szacharózt előnyös módon 60-90 mg/ml, különösen 60-80 mg/ml koncentrációban adjuk hozzá. Különösen előnyös annak az oldatnak az alkalmazása, amely körülbelül 26 mg/ml dikálium-hidrogén-foszfátot (K₂HPO₄x21 H₂O) és körülbelül 70 mg/ml szacharózt tartalmaz. Az oldat pHértékét előnyös módon 85%-os foszforsavval (körülbelül 12 mg/ml) 6-ra állítjuk be. Az oldat tartalmaz továbbá körülbelül 0,5-5 mg/ml; előnyös módon 1-2 mg/ml, különösen körülbelül 1,6 mg/ml tranexamsavat. Ezenkívül tartalmazhat továbbá tenzideket, mint például Tween-80-at, amelyet 0,01-0,3 mg/ml, különösen körülbelül 0,1 mg/ml koncentrációban alkalmazunk.

A találmány szerinti liofilizátumok további előnye, hogy a liofilizálás befejezése után viszonylag kicsi a maradék nedvességük. A maradék nedvesség különösen 5%-nál kevesebb, előnyös módon 0,5-4%, különösen 1-3%. A liofilizátumok értékei általában 6% felett vannak. A kis maradék nedvesség hozzájárul, hogy a készítményeknek jobb a tárolási stabilitása. A nagy maradék nedvességű készítmények gyakran a fehérje instabilitását okozzák, ami a biológiai aktivitás csökkenéséből vagy aggregátumok képződéséből vehető észre.

A találmány szerinti készítmények további előnye, hogy a liofilizátumok előállításakor a nem glikozilált plazminogénaktivátorok oldhatóságának a tranexamsav hozzáadása révén elért növekedése miatt, különösen a K2P, K1K2P vagy P típusú muteinek esetében, kisebb térfogatú (például beadási formánként körülbelül 5 ml) befagyasztandó oldatból lehet kiindulni, úgyhogy a liofilizálási idő a liofilizátumok előállításához eddig alkalmazott oldatokhoz képest (például beadási formánként körülbelül 10 ml) jóval rövidebb. Előnyös módon olyan oldatokból indulunk ki, amelyek a hatóanyagot körülbelül kétszer nagyobb koncentrációban tartalmaz4

HU 219 769 Β zák, mint az injektálásra kész, vizes beadási formák, úgyhogy az eddig szokásos, 10 ml mennyiségű oldatok helyett, 5 ml mennyiségű, vizes oldatok alkalmazhatók.

A véna-összeférőségre vonatkozó vizsgálatok szerint a találmány szerinti készítményeknek nagyon jó az összeférősége.

A következő kiviteli alakok a találmányt részletesebben magyarázzák anélkül, hogy azt korlátoznák.

1. példa

Mechanikai terhelés utáni behomályosodás

A találmány szerinti készítmények fényszórásának mérése

Az r-PA (BM 06.022) fehéije koncentrációját (C_Prot) 6 mg/ml értékre állítottuk be (ultraszűrés Amicon YM 10 membránon), és a megadott pufferral szemben dializáltuk. Ezután a mintákat C_Prot=4 mg/ml értékre állítottuk be, és a) változatlanul hagytuk, b) hozzáadtunk 0,01% Tween-80-at, és c) 0,01% Tween-20-at.

A minták terhelése 10 s ideig egy Whirl Mix készüléken történt (Janke und Kunkel, IKA-Labortechnik VF2, maximális fordulatszám). Utána a mintákat 2 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk.

A terheletlen és terhelt minták fényszórását 25 °C-on fluorimetriásan mértük (ex.: 360 nm, em.: 360 nm; exbandpath: 3 nm; em-bandpath: 10 nm; mérési intervallum: 10 s 3 percig). Az 1. ábrán a minta szórásának a puffer fluoreszcenciájával korrigált értékét adjuk meg.

Eredmény: Az adatok azt mutatják, hogy detergensek hozzáadása nélkül mechanikai terhelés közben a minta fényszórásának jelentős növekedése következik be (1. ábra). A növekedés detergensek hozzáadásával messzemenően kiküszöbölhető. A mérési pontosság keretein belül nem ismerhető fel különbség a Tween-80 és a Tween-20 között.

A kapott eredményeket az 1. ábrán foglaltuk össze (az A, B, C, D minták mechanikai terhelése). Az 1. ábrán alkalmazott rövidítések részletesen a következőket jelentik:

A) 150 mmol Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 10 mmol TES mg/ml szacharóz

a) detergens nélkül

b) 0,01% Tween-80-nal

c) 0,01% Tween-20-szal

B) 150 mmol Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 10 mmol TES mg/ml trehalóz

a) detergens nélkül

b) 0,01% Tween-80-nal

c) 0,01% Tween-20-szal

C) 150 mmol K₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 10 mmol TES mg/ml szacharóz

a) detergens nélkül

b) 0,01% Tween-80-nal

c) 0,01% Tween-20-szal

D) 150 mmol K₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 10 mmol TES mg/ml trehalóz

a) detergens nélkül

b) 0,01% Tween-80-nal

c) 0,01% Tween-20-szal

2. példa

Az r-PA (BM 06.022) tárolása TES-ben / Szacharózt tartalmazó, találmány szerinti összetételek // Többszörös befagyasztás és felolvasztás Az r-PA-t az 1. táblázatban megadott pufferral szemben (Tween-80 nélkül) dializáltuk, C_Prot=4 mg/ml értékre állítottuk be, hozzáadtunk Tween-80-at C=0,01% értékig, protonáltuk, és sterilen szűrtük. 9-9 mintát fagyasztottunk be -20 °C-on, illetve -70 °C-on. A táblázatban megadott napokon a kontroll kivételével valamennyi próbát felolvasztottuk (15 perc 25 °C-on vízfürdőben). 1-1 mintát elemeztünk (C^, és amidolitikus aktivitás). A többi mintát szintén -20 °C-on, illetve -70 °Con mélyfagyasztottuk. A sorozat lezárása után meghatároztuk a nem terhelt kontroll aktivitását.

Eredmény: Amint az 1. táblázat adataiból kiderül, az r-PA-t aktivitáscsökkenés nélkül legalább nyolcszor lehet befagyasztani és felolvasztani.

1. táblázat

150 mmol Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 mmol TES mg/ml szacharóz

0,01% Tween-80

	-20 °C	-70 °C
Nap	Cprot (mg/ml)	AA (MU/ml)	Cprot (mg/ml)	AA (MU/ml)
0.	4,1	3,1	4,1	3,1
1.	4,5	3,1	4,6	3,0
2.	4,6	3,2	4,8	3,1
3.	4,3	3,1	4,0	3,0
4.	4,8	3,1	4,7	3,1
5.	4,1	3,3	4,1	3,2
6.	4,2	3,0	4,2	3,1
7.	4,1	3,1	4,3	3,2
8.	4,0	2,9	4,3	3,1
Kontroll	4,3	3,0	4,3	3,1

Kontroll: kezeletlen minta mérése AA: amidolitikus aktivitás C_Prot.· fehérjekoncentráció

3. példa

Az r-PA stabilitása oldatban

Különböző összetételek összehasonlítása

C_Prot=4 mg/ml esetén

Az r-PA-t (BM 06.022) Amicon YM 10 membránon 5 mg/ml-re koncentráltuk, és a 2. táblázatban megadott pufferral szemben (Tween-80 nélkül) dializáltuk. A dializátumokat C_Prot=4 mg/ml értékre állítottuk be, hozzáadtunk Tween-80-at C=0,01% értékig, pro5

HU 219 769 Β tonáltuk, és -20 °C-on és 4 °C-on tároltuk. 7, 14, 20 és 30 nap múlva meghatároztuk a terhelt minták amidolitikus aktivitását és fehérjekoncentrációját.

Eredmény: A -20 °C-on és 4 °C-on tárolt minták 30 napon át változatlanok maradnak.

2. táblázat

150 mmol Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 10 mmol TES 50 mg/ml trehalóz 0,01% Tween-80

	-20 °C	+4°C
Nap	f-Prot (mg/ml)	AA (MU/ml)	'“'Prot (mg/ml)	AA (MU/ml)
0.	3,9	2,1
7.	3,9	2,3	3,97	2,4
14.	3,9	2,3	3,98	2,4
20.	3,9	2,3	3,9	2,4
30.	3,9	2,3	3,9	2,4

AA: amidolitikus aktivitás Cp_rot: fehérjekoncentráció

4. példa

Az r-PA stabilitása oldatban

Különböző összetételek összehasonlítása

C_Pro,= 6 mg/ml esetén

Az r-PA-t (BM 06.022) egy éjszakán át az alább ismertetett pufferral szemben dializáltuk, és Amicon YM 10 membránon történő koncentrálással C_Prot=6 mg/ml értékre állítottuk be. A mintákat 1 ml-es adagokban 30 napon át -20 °C-on és 4 °C-on tároltuk. 1, 2, 5, 9, 15 és 29 nap múlva meghatároztuk az aktivitást és a fehérjetartalmat.

3. táblázat

200 mmol Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 mmol TES mg/ml szacharóz

0,01% Tween-80

	-20 °C	+4 °C
Nap	f-Prol (mg/ml)	AA (MU/ml)	Cprot (mg/ml)	AA (MU/ml)
0.	6,0	3,3	6,0	3,3
1.	5,7	3,3	5,7	3,6
2.	5,8	3,3	5,9	3,4
5.	5,9	3,2	6,0	3,6
9.	6,0	3,3	5,9	3,7
15.	5,8	3,5	5,9	3,5
29.	5,9	3,6	5,9	3,8

AA: amidolitikus aktivitás C_Prol: fehéijekoncentráció

4. táblázat

150 mmol Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 10 mmol TES 50 mg/ml szacharóz 0,01% Tween-80

	-20 °C	-70 °C
Nap	Cprot (mg/ml)	AA (MU/ml)	Cprot (mg/ml)	AA (MU/ml)
0.	5,9	3,5	5,9	3,5
1.	5,5	3,5	5,6	3,4
2.	5,6	3,4	5,5	3,5
5.	6,0	3,5	6,2	3,6
9.	6,0	3,3	6,0	3,3
15.	6,0	3,6	5,9	3,1
29.	5,9	3,5	6,0	3,6

AA: amidolitikus aktivitás C_Prot: fehérjekoncentráció

Eredmény: A táblázatok adataiból kiderül, hogy a BM 06.022 hatóanyag a megnevezett összetételekben -20 °C-on és 4 °C-on legalább 29 napig stabil.

5. példa

Az r-PA oldhatósága a találmány szerinti összetételekben

Az r-PA-t (BM 06.022) YM 10 membránon 6 mg/ml-re koncentráltunk, és az alább ismertetett pufferral szemben dializáltuk. A dializátumokat szintén Amicon YM 10 membránon addig koncentráltuk, míg homályosodás lépett fel. A minták centrifúgálása után a maradékokat öt napig 4 °C-on tároltuk. A tárolás elején és végén meghatároztuk az amidolitikus aktivitást és a fehérjekoncentrációt.

5. táblázat

150 mmol Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 mmol TES mg/ml szacharóz

0,01% Tween-80

Nap	f-Prot (mg/ml)	AA (MU/ml)
0.	10,2	4,8
5.	10,2	4,9

AA: amidolitikus aktivitás Cp_rol: fehérjekoncentráció

Eredmény: Az r-PA oldhatósága körülbelül 10 mg/ml. A maximális fehérjekoncentráció esetén a minta 4 °C-on az amidolitikus aktivitás megváltozása nélkül legalább öt napig tárolható.

6. példa

Folyékony beadási formák előállítása

A következő beadási formákat liofilizálás előtti oldatokként állítottuk elő:

HU 219 769 Β

A liofilizálás előtti oldatok összetétele:

A oldat:

BM 06.022 4 mg/ml

Na₂HPO₄x 12 H₂O 53,72 mg/ml H₃PO₄ 85% 11,3 mg/ml tranexamsav 1,6 mg/ml szacharóz 50 mg/ml

Tween-80, pH 6 0,1 mg/ml

B oldat:

BM 06.022 4 mg/ml

K₂HPO₄ 26,2 mg/ml

H₃PO₄ 85% 11,6 mg/ml tranexamsav 1,6 mg/ml szacharóz 70 mg/ml

Tween-80, pH 6 0,1 mg/ml

A liofilizátumok előállítása

A steril szűrés után 5-5 ml aliquot részt 20 ml-es üvegcsékbe töltünk. A liofilizálást a következőképpen hajtjuk végre. A megtöltött üvegcséket fagyasztva szárítóba helyezzük, és -40—50 °C-os laphőmérsékleten 10 óra hosszat légköri nyomáson fagyasztjuk. Ezt követően a kamrát p=0,01-0,l mbar vákuum alá helyezzük. A laphőmérsékletet ezután úgy állítjuk be, hogy a termékhőmérséklet mindvégig biztosan a mindenkori üvegesedési hőmérséklet alatt legyen. Miután a teljes jégmennyiség elszublimált, a laphőmérsékletet 20-40 °C-ra emeljük, majd utánszárítást hajtunk végre vákuumban. A maradék nedvességet a szokásos eljárásokkal (Kari Fischer-módszer szerinti meghatározás) határoztuk meg, és értéke az A oldatnál 6%, a B oldatnál 3%. A liofilizátumok stabilitásának vizsgálatát 4 °C-os (hűtőszekrény-hőmérséklet), 20 °C-os (szobahőmérséklet) és 35 °C-os hőmérsékleten végezzük. A liofilizátumok stabilitása négy-tizenkét hetes tárolási idő után a megadott hőmérsékleteken megfelelő, ahogy ez az amidolitikus aktivitásra és a fehérjekoncentrációra vonatkozó analitikai vizsgálatokból kiderül.

A liofilizátumok rekonstitúciója az alkalmazáshoz: A liofilizátumokat injekciós oldathoz megfelelő vízzel 10 ml-re feltöltjük. Ez a liofilizálás előtti oldat eredeti térfogatához viszonyított kétszeres hígításnak felel meg.

7. példa

A találmány szerinti összetételek véna-összeférőségének vizsgálata

Készítettünk két, a 6. táblázat szerinti összetételű verum- és placebooldatot, és intravénásán adagoltuk házinyulaknak. Az alkalmazási mennyiség 0,5 ml volt állatonként, a négy tesztoldat mindegyikére öt állatot használtunk.

6. táblázat

A verum- és placebooldatok összetétele

1. Vcnimoldat
	93/1292. számú kísérlet	93/1294. számú kísérlet
BM 06.022	10MU	10 MU
Dikálium-hidrogén- foszfát	131,0 mg	131,0 mg

1. Verumoldat
	93/1292. számú kísérlet	93/1294. számú kísérlet
Foszforsav 85%-os	58 mg	58 mg
Tranexamsav	8,0 mg	8,0 mg
Szacharóz	250,0 mg	350,0 mg
Poliszorbát 80	0,5 mg	0,5 mg
Injekciós oldathoz megfelelő víz	10,0 ml	10,0 ml
PH	6,0	6,0
Ozmolaritás	320 mOsmol	351 mOsmol

2. Placebooldatok
	93/1291. számú kísérlet	93/1293. számú kísérlet
Dikálium-hidrogén- foszfát	131,0 mg	131,0 mg
Foszforsav 85%-os	58 mg	58 mg
Tranexamsav	8,0 mg	8,0 mg
Szacharóz	250,0 mg	350,0 mg
Poliszorbát 80	0,5 mg	0,5 mg
Injekciós oldathoz megfelelő víz	10,0 ml	10,0 ml
pH	6,0	6,0
Ozmolaritás	322 mOsmol	343 mOsmol

Eredmény: Az állatok reakciója az injekció beadásakor és a szövettani leletek azt mutatják, hogy az alkalmazott vizsgálati oldatok mindegyike jól összeférhető.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Plazminogénaktivátort tartalmazó gyógyszerkészítmény, amely cukrot és egyetlen aminokarbonsavként tranexamsavat tartalmaz, citrátot azonban nem tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a cukor egy diszacharid, előnyös módon szacharóz vagy trehalóz.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 40-100 mg/ml, előnyös módon 50-70 mg/ml cukrot tartalmaz.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 1-50 mmol/1, előnyös módon 8-12 mmol/1 tranexamsavat tartalmaz.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 0,005-0,1%, előnyös módon 0,01% tenzidet tartalmaz.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy K2P típusú, előnyös módon BM 06.022 rekombináns plazminogénaktivátort tartalmaz.

HU 219 769 Β
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a t-PA-t vagy annak származékait legfeljebb 10 mg/ml koncentrációban tartalmazza.
8. Eljárás az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti 5 gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a plazminogénaktivátort a cukorral és tranexamsavval megfelelő gyógyszerészeti beadási formává alakítjuk.
9. Eljárás a 8. igénypont szerinti liofilizált gyógyszer- 10 készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy plazminogénaktivátort, cukrot és tranexamsavat tartalmazó vizes oldatot állítunk elő, az oldatot befagyasztjuk, a fagyasztott oldat hőmérsékletét az üvegedési hőmérséklet alá, előnyösen -40 °C és -50 °C közé állítjuk be, és a 15 fagyasztott oldatot vákuumban liofílizáljuk.
10. Cukor, foszfátpuffer, tranexamsav és tenzid gyógyszerészeti segédanyagok kombinációjának alkalmazása egy plazminogénaktivátort és ezeket a segédanyagokat tartalmazó, vénaösszeférő gyógyszerészeti beadási formák előállítására.
11. Cukor, foszfátpuffer, tranexamsav és tenzid gyógyszerészeti segédanyagok kombinációjának alkalmazása biológiai aktivitás csökkenésének vagy hatóanyag-aggregátumok képződésének megakadályozására szolgáló, hatóanyagként egy plazminogénaktivátort tartalmazó gyógyszerészeti beadási formák előállítására.
12. Gyógyszerészeti beadási forma liofilizátum alakjában, amelynek maradék nedvessége 5%-nál kevesebb, előnyösen 1-3%, és amely plazminogénaktivátort, cukrot, foszfátpuffert, tranexamsavat és tenzidet tartalmaz, citrátot azonban nem tartalmaz.