CZ286682B6

CZ286682B6 - Pharmaceutical preparation containing plasminogen activators and process for preparing thereof

Info

Publication number: CZ286682B6
Application number: CZ19962431A
Authority: CZ
Inventors: Ulrich Kohnert; Stephan Fischer; Hans-Joerg Markl; Heinrich Woog
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1994-02-21
Filing date: 1995-02-18
Publication date: 2000-06-14
Also published as: PT746334E; CZ243196A3; NZ281607A; KR970701059A; TW337997B; CN1141592A; PL315978A1; CN1170591C; HU219769B; DE4405426A1; NO963460D0; JPH09511495A; PL181257B1; HU9602284D0; MX9603515A; NO317726B1; AU1758195A; SK107996A3; DE59509580D1; FI117925B

Description

Vynález se týká farmaceutických přípravků, které jako účinné látky obsahují aktivátory plazminogenu nebo jejich deriváty, jakož i příslušné farmaceutické aplikační formy ve formě lyofilizátů nebo injekčních, případně infúzních roztoků.

Dosavadní stav techniky

Lidský tkáňový aktivátor plazminogenu /t-PA/ má velký terapeutický' význam při rozpouštění krevních sraženin, například při srdečních infarktech. t-PA způsobuje rozpouštění krevních sraženin aktivací plazminogenu na plazmin. Plazmin zase rozpouští fibrin, hlavní složku proteinové matrice sražené krve.

Přírodní t-PA se skládá zvíce funkčních domén F, E, ΚΙ, K.2 a P. Doména P zahrnuje proteolyticky aktivní centrum, které způsobuje štěpení plazminogenu na plazmin. Výroba aktivátorů plazminogenu /PA/ pomocí genové technologie, zejména t-PA nebo různých t-PAmuteinů v eukaryotních a prokaryotních buňkách, je už známá. Přitom se syntetizují deriváty tPA z prokaryotů v protikladu k přírodnímu t-PA v neglykosylované formě.

Jako aktivátory plazminogenu přicházejí v úvahu ve smyslu vynálezu principiálně takové, zejména rekombinantně produkované deriváty t-PA, které v podstatě zahrnují ty proteinové oblasti přírodního proteinu, které jsou kompetentní pro fibrinolýzu trombů. Přitom se mohou využívat i takové deriváty t-PA, které vykazují delece nebo substituce jednotlivé nebo více aminokyselin v sekvenci t-PA.

Podle vynálezu se může použít například následujících aktivátorů plazminogenu: t-PA /například altepláza/, LY 210825 /K2P k získání z buněčných linií „syrian hamster“, Circ. 1990,82, 930-940/; AFE3x a AFElx /K1K2P, Blood 1988, 71, 216-219/; AFEK.1 /K2P zC127 buněk myší, J. Cardiovasc. Pharmacol. 1990, 16, 197209/; E-6010 /Jap. Circ. J. 1989, 53, s. 918/; t-PA-varianty /Thromb. Haemost., 1989, 62, s. 542/; K2P a D-K.2P /Thromb. Haemost. 1989, 62, s. 393/; MB-1018 /FK2K2P, Thromb. Haemst, 1989, 62, s. 543/; FK2P /FASEB J., 1989, 3, A1031, abstract 4791/; Alx /Circulation, 1988, 4,11-15/; K1K2P /Thromb. Res., 1988, 50, 33—41/; FK.1K.2P /J. Biol. Chem., 1988, 263, 1599-1602/; TNK-varianta t-PA [WO 93] 24635]; bat-PA /Witt et al., Blood 1992; 79: 1213-1217 a Mullot et al., Arterioscler. Thrombos. 1992; 12: 212-221/. V úvahu přicházejí zejména takové aktivátory plazminogenu, které obsahují prstencovou 2-doménu /“K2“/ t-PA a/nebo serínproteázovou doménu /“P“/. Například by se mohl příslušně uvést t-PA-muteín „r-PA“ typu K2P, který je popsán v EPO 382 174 [WO 90/09437/.

Předložený vynález se týká zejména aktivátorů plazminogenu typu K2P, K1K2P, FK1K2P a FK2K.2P, jak jsou popsány v následujících spisech: Protein Engineering 5/1/, 93-100 /1992/; DE-OS-39 23 339.1; Circ. 1990, 82, 930-940; J. Cardiovasc. Pharmacol. 1990, 16, 197-203; Blood 1988, 71, 216-219; J. Biol. Chem. 1988, 263, 1599-1602; Thromb. Haemost. 1989, 62, s. 543. Zejména se používá rekombinantních aktivátorů plazminogenu typu K2P, jak je popsáno v EP-A-0 382 174 a v Protein Engineering sv. 5/1/, s. 93-100 /1992/. Další t—PA-muteiny tohoto druhu jsou popsány v následujících patentových přihláškách:

US 4,970,159, EP-A-0,196.920. EP-A-0,207,589; AU 61804/86; EP-A-0,231,624; EP-A-0,289,508; JP 63133988; EP-A-0,234,051; EP-A-0,263,172; EP-A-0,241,208;

-1 CZ 286682 B6

EP-A-0,292,009; EP-A-0,297,066; EP-A-0,302,456; EP-A-0,379,890.

Ze stavu techniky je známo, že podíl sacharidu má značný vliv na rozpustnost a agregaci proteinů [J. Biol. Chem. 263 /1988/, 8832-8837], VEP-B—458 950 se zjistilo, že například neglykosylovaný rekombinantní aktivátor plazminogenu s doménovou strukturou K2P má podstatně nižší rozpustnost než například glykosylované deriváty t-PA. Neglykosylované aktivátory plazminogenu, jako například r-PA, se zpravidla rozpouštějí jen v malé míře v obvykle k solubilizaci proteinů používaných pufrech, jako například v 50 mmol/1 Na-citrátu pH 6, 50 mmol/1 fosfátovém pufru nebo fyziologickém roztoku NaCl. Pro použití jako terapeutické účinné látky je však žádoucí, aby byly aktivátory plazminogenu v dostatečně vysokých koncentracích, zejména v koncentraci až 10 mg/ml.

Z EP-A-0 217 379 je známo zvyšování rozpustnosti t-PA z prokaryotů pomocí neutrálních nebo slabě alkalických formulací argininu. Nevýhodou tohoto způsobu je ale to, že dobrých rozpustností t-PA z prokaryotů je možno dosáhnout jen s velmi vysokými koncentracemi argininu.

Další galenické formulace aktivátorů plazminogenu nebo jejich derivátů jsou známy z WO 90/01333, WO 89/050347, WO 90/08557, EP 0 297 294, EP 0 156 169 a EP 0 228 862.

Ve WO 90/01333 /Invitron/je popsána kombinace lysinu, histidinu, argininu s citrátem pro t-PA a deriváty z baktérií. Požívá se citrátu s 5 mmol/1, lysinu, histidinu, argininu se 150 mmol/1 při pH 6. Kromě toho se přidává albumin.

Ve WO 89/050347 /Invitron/je popsána kombinace argininu [20 až 200 mmol/1] a citrátu [20 až 80 mmol/1] při pH 5 až 8.

WO 90/08557 /Genetics Institute/ zveřejňuje kombinaci kreatininu s různými přísadami, jako histidin, arginin, prolin, betain, kolin, imidazol, tryptofan, citrát, popřípadě za přídavku kyseliny glutamové, kyseliny asparagové a kyseliny jantarové.

V EP 0 297 294 /Behring/ se zveřejňuje kombinace alespoň dvou aminokyselin, jako lysin, omithin, arginin, kyselina trans-4-(aminometyl)-cyklohexankarboxylová, a dalších přísad při pH 5 až 10.

EP 0 156 169 /Asahi/ popisuje omithin a/nebo lysin, popřípadě za přídavku citrátu, glycinu nebo fosfátu a EP 0 228 862 /Genentech/ zveřejňuje formulaci obsahující arginin s nebo bez chloridu, jakož i s nebo bez detergentu.

Alternativní formulace r-PA v přítomnosti lysinu, případně lysinových analogů v roztocích pufrovaných kyselinou citrónovou jsou popsány také v EPO 458 950 /Boehringer Mannheim/. Novější výzkumy však ukazují, že rozpustnost r-PA není ani v těchto formulacích ještě plně postačující. Zjistilo se, že sice lze rozpustnost pomocí zvýšení koncentrace citrátu zlepšit, avšak takové formulace nejsou žilně kompatibilní nebo jenom podmíněně. Mimo to vedou vysoké koncentrace soli a s tím spojená nízká teplota skelného přechodu /T'_g) k tomu, že lyofilizace těchto formulací musí být prováděna při teplotách pod -45 °C a -50 °C. Tyto teploty jsou technicky často realizovatelné jen s velmi vysokými náklady a vyžadují nákladné řídicí a kontrolní prvky, aby bylo možno měřit a regulovat optimální podmínky pro lyofilizaci. Kromě toho je s tím spojena relativně vysoká spotřeba energie. K tomu se připojuje to, že se často pro velkovýrobu používá starších lyofilizačních zařízení, která nemají žádoucí komplikovanou měřicí a regulační techniku, a u kterých proto může být garantována zpravidla pracovní teplota jen přibližně -45 °C.

-2CZ 286682 B6

Úlohou vynálezu je poskytnout formulace aktivátorů plazminogenu a jejich derivátů, které jsou dobře žilně kompatibilní, obsahují účinnou látku v dostatečně vysokých koncentracích a zajišťují dobrou rozpustnost účinné látky, přičemž stabilita PA v lyofilizátu má zůstat po delší dobu zachována. Kromě toho je cílem vynálezu vyvinout formulace, které jsou také v technickém výrobním měřítku spolehlivě lyofilizovatelné, čímž se má zajistit dobře reprodukovatelná produktová kvalita lyofilizátů.

Podstata vynálezu

Úloha podle vynálezu se řeší pomocí farmaceutického přípravku obsahujícího aktivátor plazminogenu, přičemž přípravek obsahuje jako farmaceutické přísady aspoň jeden sacharid a kyselinu trans-4-(aminomethyl)-cyklohexankarboxylovou /“tranexaminokyselinu“/. Přípravek je v lyofilizované formě po delší dobu stabilní při skladování. Také vodní injekční roztok vyrobený pomocí rekonstituce splňuje toto kritérium zvýšené stability při skladování. Tak je tomu obzvláště potom, když hodnota pH roztoku se nastaví na hodnotu mezi 5,5 až 6,5. Jako další přísady může farmaceutický přípravek obsahovat obvyklé pufrové látky nebo povrchově aktivní látky /aniontové, kationtové nebo neutrální tenzidy/.

Například pro aktivátory plazminogenu /PA/ přicházející v úvahu ve smyslu předloženého vynálezu byl použitý aktivátor plazminogenu K2P /BM 06.022/, blíže popsaný v evropské patentové přihlášce EP-A-0,382,174. Skládá se z prstence 2 /K2/ a proteázové domény /P/ humánního t-PA a je k dispozici kvůli své expresi v buňkách Echerichia coli v neglykosylované formě.

Jako sacharidy obsahují formulace podle vynálezu přednostně mono- nebo disacharidy. Jako disacharidy přicházejí v úvahu zejména sacharóza, trehalóza, maltóza nebo laktóza. Monosacharidy jsou zejména galaktóza nebo příslušné aminosacharidy, jako například galaktozamin. Přednostně se používá neredukující sacharid sacharóza nebo trehalóza. Koncentrace sacharidu ve vodním injekčním roztoku činí zejména 40 až 100 mg/ml, přednostně je mezi 50 až 70 mg/ml.

Jako pufrové látky mohou farmaceutické přípravky obsahovat látky přicházející v úvahu obvykle pro tyto účely, které představují soli silných kyselin se slabými zásadami nebo soli slabých kyselin se silnými zásadami. Například by bylo možno jmenovat soli alkalických kovů s kyselinou fosforečnou, vinnou, jablečnou apod. Právě tak mohou přicházet v úvahu aminokyseliny. Přednostně obsahují přípravky podle vynálezu fosfátový pufr. Koncentrace fosfátového pufru v hotovém injikovatelném vodním roztoku činí obzvláště 50 až 300 mmol/1, přednostně 80 až 220 mmol/1 a obzvláště přednostně 130 až 170 mmol/1. Jako fosfátový pufr se používá především hydrogenfosforečnan didraselný nebo disodný, který se nastavuje kyselinou fosforečnou na danou hodnotu pH.

Pro zlepšení rozpustnosti obsahují přípravky podle vynálezu kyselinu trans-4-(aminomethyl) cyklohexankarboxylovou /TES/. Koncentrace kyseliny trans-4-(aminomethyl)-cyklohexankarboxylové v hotovém injikovatelném vodním roztoku činí přednostně 1 až 50 mmol/1, především 8 až 12 mmol/1. Obzvláště výhodně se používá koncentrace 10 mmol/1. S překvapením se zjistilo, že kyselina trans-4-(aminomethyl) cyklohexankarboxylová zvyšuje rozpustnost aktivátorů plazminogenu, zvláště neglykosylovaných aktivátorů plazminogenu, ve vodním médiu. Například v případě derivátu aktivátoru plazminogenu r-PA se zvýšila rozpustnost nejméně o faktor 1,5 vůči roztoku, který neobsahuje kyselinu trans-4-(aminomethyl) cyklohexankarboxylovou. Faktor pro zvýšení rozpustnosti je obzvláště v rozsahu 2 až 3. Tento efekt je výhodný především v rámci výroby lyofilizovaných farmaceutických příprav aktivátorů plazminogenu, protože pomocí možnosti zvýšení koncentrace aktivátoru plazminogenu v použitých roztocích se může výrazně snížit množství vody, které má být použito v procesu

-3 CZ 286682 B6 výroby, a celkově se docílí energeticky úsporné a levnější výroby. Zejména se tím zkracují doby lyofilizace při procesu výroby.

Jako tenzidy se mohou použít neionové, anionové nebo kationové tenzidy, především však neionové tenzidy, jako například Tween 80 nebo Tween 20. Koncentrace tenzidu činí 0,005 až 0,1 % /hm./obj./, zejména 0,01 %.

Pro farmaceutický přípravek podle vynálezu ve vodní formě je vhodná hodnota pH mezi 5,5 až 6,5, přednostně je hodnota pH 5,8 až 6,2.

Přípravky podle vynálezu obsahují účinnou látku v koncentraci až lOmg/ml, především 3 až 5 mg/ml.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu se používají jako injekční nebo infúzní roztoky. Toto se může uskutečnit tak, že je k dispozici už hotový roztok ke vstřikování, kteiý má složení podle vynálezu. Je však také možné dát k dispozici farmaceutické přípravky ve formě lyofilizátů. Tyto jsou potom rekonstituovány pomocí o sobě známých, pro injekční účely vhodných prostředků nebo roztoků /například s vodou/. Jako injekční médium se používá pro přípravky podle vynálezu především voda, která může případně obsahovat obvyklé isotonické přísady, jako například fyziologickou koncentraci NaCl.

Předmětem vynálezu je také způsob výroby farmaceutického přípravku obsahujícího aktivátory plazminogenu nebo jejich deriváty s hodnotou pH 5,5 až 6,5, jakož i jejich využití k výrobě farmaceutických přípravků podle vynálezu.

Předmětem vynálezu je mimoto použití určité směsi farmaceutických pomocných látek, sestávající ze skupiny sacharidu a kyseliny trans-4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylové, pro dlouhodobou stabilizaci aktivátorů plazminogenu. Obzvláště výhodná je zejména kombinace pomocných látek sacharidu, fosfátového pufru, kyseliny trans—4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylové a tenzidu k dosažení dobré stability při skladování.

Výzkumy stability ukazují, že přípravky podle vynálezu jsou jako roztoky stabilní při 4 °C nejméně 30 dní. Stabilita účinné látky v lyofilizátech podle vynálezu činí při 4 °C dva až pět roků. Výhodně se projevuje zejména skutečnost, že léčivé přípravky vykazují výbornou stabilitu také při vyšším tepelném zatížení, která je činí dalekosáhlé necitlivými vůči kolísáním teploty, která se mohou vyskytovat zejména v teplejších klimatických oblastech země, zejména při přerušení chladicího řetězu. Na základě často dlouhých cest odbytu v případě farmaceutických aplikačních forem od výrobce léčiv až ke konzumentovi nemůže být v různých zemích vyloučeno, že přípravky nebudou neúmyslně popřípadě vystaveny také po delší dobu kolísáním teploty, která vedou ke ztrátě aktivity proteinu, a tím uvádějí v pochybnost terapeutický úspěch při léčení v extrémním případě. Aplikační formy podle vynálezu jsou však vůči takovým kolísáním teploty dalekosáhle necitlivé. V předběžných výzkumech stability se však mohlo ukázat, že při přípravcích ani při teplotě 35 °C, které byly vystaveny po dobu 30 dní, nemohlo být zjištěno žádné zvláštní poškození, co se týká stability proteinu. Proto je možno z toho vyvozovat, že přípravky při náležitém skladování při teplotě chladničky budou vykazovat stabilitu dva až pět roků.

Přípravky podle vynálezu mají kromě toho tu výhodu, že teplota skelného přechodu (T'_g) zmrazeného roztoku pro výrobu lyofilizátů je relativně vysoká a leží mezi -33 a -40 °C, takže reprodukovatelnost kvality produktu lyofilizátů je zajištěna také v technickém výrobním měřítku s dostatečnou jistotou. Poměrně vysoká teplota skelného přechodu je zejména proto výhodná, protože při technicky podmíněných a nepředvídaných zvýšeních teploty v průběhu často velmi dlouhých dob lyofilizace je méně pravděpodobné riziko nezamýšleného roztáni zmrazených

-4CZ 286682 B6 roztoků. V případech, kdy teplota skelného přechodu leží pod -40 °C a tato teplota se během procesu lyofilizace překračuje směrem nahoru, což nastává zejména u technologických lyofilizačních zařízení, která pracují při teplotách blízkých -45 °C, může nežádoucí překročení teploty skelného přechodu vést k nevýhodným změnám zmrazeného roztoku. Dostatečně dobrá kvalita produktu už potom není zajištěna. Přitom může dojít zejména u lyofilizátů obsahujících proteiny ke ztrátě aktivity proteinu, popřípadě ke tvorbě agregátů. Další výhoda přípravků podle vynálezu s teplotou skelného přechodu -33 až -40 °C spočívá v tom, že žádoucí spotřeba energie pro proces lyofilizace se minimalizuje, protože proces lyofilizace se nemusí provádět nutně při teplotách pod -50 °C.

Ve smyslu předloženého vynálezu lze dosáhnout relativně vysokých teplot skelného přechodu pro zmrazené roztoky zejména potom, když se jako fosfátového pufru pro lyofilizaci náležitých roztoků použije draselné soli, jako například hydrogenfosforečnanu didraselného nebo dihydrogenfosforečnanu draselného. V úvahu přichází v té věci zejména hydrogenfosforečnan didraselný v koncentraci 20 až 40 mg/ml, obzvláště 20 až 30 mg/ml. Zvýšení teploty skelného přechodu lze zvětšit pomocí přísady sacharózy. Sacharóza se přitom přidává zvláště v koncentraci 60 až 90 mg/ml, zejména 60 až 80 mg/ml. Obzvláště přednostně se používá roztoku, který obsahuje přibližně 26 mg/ml hydrogenfosfátu didraselného /K2HPO4.I2H2O/ a přibližně 70 mg/ml sacharózy. Hodnota pH roztoku se především pomocí 85% kyseliny fosforečné /asi 12 mg/ml/ nastavuje na hodnotu 6. Dále obsahuje roztok asi 0,5 až 5 mg/ml, přednostně 1 až 2 mg/ml kyseliny trans-4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylové, zejména asi 1,6 mg/ml. Mimoto mohou být dále obsaženy tenzidy, jako například Tween 80, který se používá přednostně v koncentraci 0,01 až 0,3 mg/ml, zejména asi 0,1 mg/ml.

Další výhoda lyofilizátů podle vynálezu spočívá vtom, že vykazují relativně nízkou zbytkovou vlhkost po ukončení lyofilizace. Zbytková vlhkost má hodnoty zejména nižší než 5 %, především mezi 0,5 až 4 %, zejména 1 až 3 %. Obvykle leží hodnoty pro lyofilizáty nad 6 %. Nízká zbytková vlhkost přispívá ktomu, že přípravky mají lepší stabilitu při skladování. Přípravky s vyšší zbytkovou vlhkostí vedou často k nestabilitě proteinu, která se projevuje ztrátou biologické aktivity nebo tvorbou agregátů.

Další výhoda přípravků podle vynálezu spočívá v tom, že při výrobě lyofilizátů na základě zvýšení rozpustnosti neglykosylovaných aktivátorů plazminogenu, dosaženého pomocí přísady kyseliny trans-4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylové, zejména v případě muteinů typu K2P, K.1K.2P nebo P, se může vycházet z menších objemů /například z asi 5 ml na jednotlivou aplikační formu/ roztoků, které se mají zmrazit, takže se doba lyofilizace vůči dosud používaným roztokům pro výrobu lyofilizátů /například asi 10 ml na aplikační formu/ výrazně zkrátí. Vychází se zejména od roztoků, které obsahují účinnou látku přibližně v dvakrát vyšší koncentraci ve srovnání s hotovými injekčními vodními aplikačními formami, takže místo dosud obvyklých roztoků s objemem 10 ml se mohou použít vodní roztoky s objemem 5 ml.

Výzkumy žilní kompatibility ukazují velmi dobrou kompatibilitu přípravků podle vynálezu.

Následující příklady provedení mají vynález blíže objasnit, aniž by ho omezovaly.

-5CZ 286682 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Zakalení po mechanickém zatížení/

Měření rozptylu světla přípravků podle vynálezu r-PA /BM 06.022/ se nastavil na koncentraci proteinu /C_prot/ 6 mg/ml [ultrafiltrace přes membránu Amicon YM 10] a dialyzoval proti uvedenému pufru. Následně se nastavily vzorky na Cprot. = 4 mg/ml a a/ nechaly nezměněné, b/ zředily 0,01 % Tween 80 a c/ zředily 0,01 % Tween 20.

Zatížení vzorků nastalo nyní po dobu 10 s na Whirl Mix /Janke & Kunkel, IKALaboratortechnik VF2, maximální počet otáček/. Následně se vzorky inkubovaly po dobu 2 minut při teplotě místnosti.

Rozptyl světla nezatíženého a zatíženého vzorku se měří fluorimetricky při 25 °C /Ex. 360 nm, Em.: 360 nm, Ex.-bandpath:3 nm; Em.-bandpath: 10 nm; interval měření: lOspo 3 min/. Ve vyobr. 1 je uvedená hodnota pro rozptyl vzorku, korigovaná o fluorescenci pufru.

Výsledek:

Tyto údaje ukazují, že bez přídavku detergentů při mechanickém zatížení dochází ke značnému vzestupu rozptylu světla vzorku /vyobr. 1/. Vzestup může být pomocí přísady detergentů nejrozsáhleji potlačen. V rámci přesnosti měření nelze rozeznat žádný rozdíl mezi Tween 80 a Tween 20.

Ve vyobr. 1 /mechanické zatížení vzorků A, B, C, D/ jsou shrnuty získané výsledky. Zkratky použité ve vyobr. 1 jednotlivě znamenají:

A/ 150 mM Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 lOmMTES mg/ml sacharózy a/ bez detergentů b/ s 0,01 % Tween 80 c/ s 0,01 % Tween 20

B/150 mM Na^HPOVHjPO,, pH 6,0 lOmMTES mg/ml trehalózy a/ bez detergentů b/ s 0,01 % Tween 80 c/ s 0,01 % Tween 20

C/ 150 mM ^HPO^POí, pH 6,0 mM TES mg/ml sacharózy a/ bez detergentů b/ s 0,01 % Tween 80 c/ s 0,01 % Tween 20

-6CZ 286682 B6

D/ 150 mM K.2HPO4/H3PO4, pH 6,0 mM TES mg/ml trehalózy a/ bez detergentů b/ s 0,01 % Tween 80 c/ s 0,01 % Tween 20

Příklad 2

Skladování r-PA /BM 06.022/ ve formulacích podle vynálezu obsahujících TES/sacharózu// V ícenásobné zmrazení a roztáni r-PA se dialyzoval proti pufru uvedenému v tabulce 1 /bez Tween 80/, nastavil na Cp^. = 4 mg/ml, zředil pomocí Tween 80 na C = 0,01 %, rozdělil do dávek a sterilně filtroval. Při -20, popřípadě -70 °C se zmrazilo 9 vzorků. Ve dnech uvedených v tabulce všechny vzorky až na kontrolu roztály /15 min při 25 °C ve vodní lázni/. Právě jeden vzorek se analyzoval /Cprot a amidolytická aktivita/. Zbývající vzorky se při -20, popřípadě -70 °C zmrazily. Po ukončení série se určila aktivita nezatížené kontroly.

Výsledek:

Jak vyplývá na základě údajů z tabulky 1, může být r-PA bez ztráty aktivity nejméně osmkrát zmrazen a rozmražen.

Tabulka 1

150 mM Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 lOmM TES mg/ml sacharózy

0,01 % Tween 80

	-20 °C	-70 °C
Den	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]	CProt. [mg/ml]	AA [MU/ml]
0	4,1	3,1	4,1	3,1
1	4,5	3,1	4,6	3,0
2	4,6	3,2	4,8	3,1
3	4,3	3,1	4,0	3,0
4	4,8	3,1	4,7	3,1
5	4,1	3,3	4,1	3,2
6	4,2	3,0	4,2	3,1
7	4,1	3,1	4,3	3,2
8	4,0	2,9	4,3	3,1
Kontrola	4,3	3,0	4,3	3,1

Kontrola: vzorek proměřen bez zpracování

AA: amidolytická aktivita

Cprot.: koncentrace proteinu

Příklad 3

Stabilita r-PA v roztoku

Porovnání různých formulací při Cprot. = 4 mg/ml r-PA /BM 06.022/ se zkoncentroval na 5 mg/ml přes membránu Amicon YM 10 a dialyzoval proti pufru uvedenému v tabulce 2 /bez Tween 80/. Dialyzáty se nastavily na Cp^. = 4 mg/ml, zředily Tween 80 a C = 0,01 %, rozdělily do dávek a uložily při -20 a 4 °C. Po 7, 14, 20 a 30 dnech se určila amidolytická aktivita a koncentrace proteinu zatížených vzorků.

Výsledek:

Vzorky uložené při -20 a 4 °C zůstávají po 30 dní nezměněny.

Tabulka 2

150 mM Na₂HPO4/H₃PO₄, pH 6.0 mM TES mg/ml trehalózy

0.01 % Tween 80

	-20	°C	+ 4	°C
Den	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]
0	3,9	2,1
7	3,9	2,3	3,97	2,4
14	3,9	2,3	3,98	2,4
20	3,9	2,3	3,9	2,4
30	3,9	2,3	3,9	2,4

AA: amidolytická aktivita : koncentrace proteinu

Příklad 4

Stabilita r-PA v roztoku

Porovnání různých formulací při Cpr_Ot. = 6 mg/ml r-PA /BM 06.022/ se dialyzoval přes noc proti níže uvedenému pufru a nastavil na Cp^ = 6 mg/ml zkoncentrováním přes membránu Amicon YM 10. Vzorky se plnily do 1 ml-dávek a uložily po dobu 30 dní při -20 a 4 °C. Po 1, 2, 5, 9, 15 a 29 dnech se stanovila aktivita a obsah proteinu.

Tabulka 3

200 mM Na₂HPO4/H₃PO₄, pH 6.0 lOmMTES mg/ml sacharózy

0.01 % Tween 80

-8CZ 286682 B6

	-20 °C	+ 4°C
Den	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]
0	6,0	3,3	6,0	3,3
1	5,7	3,3	5,7	3,6
2	5,8	3,3	5,9	3,4
5	5,9	3,2	6,0	3,6
9	6,0	3,3	5,9	3,7
15	5,8	3,5	5,9	3,5
29	5,9	3,6	5,9	3,8

AA: amidolytická aktivita

Cprot.: koncentrace proteinů

Tabulka 4

150 mM Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 lOmMTES mg/ml sacharózy

0,01 % Tween 80

	-20 °C	-70 °C
Den	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]
0	5,9	3,5	5,9	3,5
1	5,5	3,5	5,6	3,4
2	5,6	3,4	5,5	3,5
5	6,0	3,5	6,2	3,6
9	6,0	3,3	6,0	3,3
15	6,0	3,6	5,	3,1
29	5,9	3,5	6,0	3,6

AA: amidolytická aktivita

Cprot.: koncentrace proteinu

Výsledek:

Z údajů v tabulkách vyplývá, že účinná látka BM 06.022 je stabilní v uvedených formulacích při -20 °C a 4 °C nejméně 29 dní.

Příklad 5

Rozpustnost r-PA ve formulacích podle vynálezu r-PA /BM 06.022/ se zkoncentroval přes YM 10 na 6 mg/ml a dialyzoval proti níže uvedenému pufru. Dialyzáty se znovu přes membránu Amicon YM 10 koncentrovaly tak dlouho, dokud se neprojevil zákal. Po centrifugaci vzorků se supematanty uložily po 5 dní při 4 °C. Na začátku a na konci skladování se stanovila amidolytická aktivita a Cprot..

-9CZ 286682 B6

Tabulka 5

150 mM Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 mM TES mg/ml sacharózy

0,01 % Tween 80

Den	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]
0	10,2	4,8
5	10,2	4,9

AA: amidolytická aktivita

Cprot: koncentrace proteinu

Výsledek:

Rozpustnost r-PA činí přibližně 10 mg/ml. Při maximální koncentraci proteinu může být vzorek při 4 °C uskladněný beze změny amidolytické aktivity nejméně až 5 dní.

Příklad 6

Výroba kapalných aplikačních forem

Před lyofilizaci byly vyrobeny jako roztoky následující aplikační formy:

Složení roztoků před lyofilizaci

Roztok A:

BM 06.022 Na₂HPO₄. 12 H₂O H₃PO₄ 85 % Kyselina trans^4-(aminomethyl)- Cyklohexankarboxylová Sacharóza Tween 80, pH 6

4 mg/ml 53,72 mg/ml 11,3 mg/ml 1,6 mg/ml 50 mg/ml 0,1 mg/ml

Roztok B:

BM 06.022 K₂HPO₄ H₃PO₄ 85 % Kyselina trans—4-(aminomethyl)- Cyklohexankarboxylová Sacharóza Tween 80, pH 6

4 mg/ml 26,2 mg/ml 11,6 mg/ml 1,6 mg/ml 70 mg/ml 0,1 mg/ml

Výroba lyofílizátů:

Po sterilní filtraci se 5 ml podíly plní do 20 ml skleněných lahviček. Lyofilizace se provádí následujícím způsobem: Naplnění lahvičky se vloží do lyofilizační sušičky a mrazí při teplotách

-40 až -50 °C teploty plotny 10 hodin při atmosférickém tlaku. Následně se na komoru naloží vakuová hodnota p = 0,01 až 0,1 mbar. Teplota plotny se potom nastaví tak, aby teplota produktu ležela v každém okamžiku spolehlivě pod danou teplotou proměny skla. Když se celé množství ledu odsublimuje, zvýší se teplota plotny na hodnotu 20 až 40 °C a následně se provádí dodatečné sušení ve vakuu. Zbytková vlhkost se určila podle obvyklého způsobu /stanovení podle metody Karla Fischera/ a činí u roztoku A 6 % a u roztoku B 3 %. Uskladnění lyofílizátů pro výzkumy stability nastává při teplotách 4 °C /teplota chladničky/, 20 °C /teplota místnosti/ a 35 °C. Stabilita lyofílizátů po době uskladnění od čtyř do dvanácti týdnů je při uvedených teplotách splněna tak, jak vyplývá z analytických výzkumů, pokud jde o amidolytickou aktivitu a koncentraci proteinu.

Rekonstituce lyofílizátů pro aplikaci: Lyofílizáty se doplní vodou pro injekční účely na 10 ml. Toto odpovídá zředění o faktor dva v poměru k původnímu objemu roztoku před lyofilizaci.

Příklad 7

Zkouška žilní snášenlivosti formulací podle vynálezu

Připravily se dva testované roztoky a dva roztoky placeba se složením uvedeným v tabulce 6 a aplikovaly intravenózně králíkům. Jako aplikační množství se použilo 0,5 ml/zvíře, pro každý ze čtyř testovaných roztoků se použilo 5 zvířat.

Tabulka 6

Složení testovaných roztoků a roztoků placeba

1. Testovaný roztok

	Pokus č. 93/1292	Pokus č. 93/1294
BM06.022	10 MU	10 MU
Hydrogenfosforečnan didraselný	131,0 mg	131,0 mg
Kyselina fosforečná, 85%	58 mg	58 mg
Kyselina trans—4-(aminomethyl)-
cyklohexankarboxylová	8,0 mg	8,0 mg
Sacharóza	250,0 mg	350,0 mg
Polysorbát 80	0,5 mg	0,5 mg
Voda pro injekční účely	do 10,0 ml	do 10,0 ml
pH	6,0	6,0
Osmolarita	320 mOsmol	351 mOsmol

-11CŽ 286682 B6

2. Roztoky placeba

	Pokus č. 93/1291	Pokus č. 93/1293
Hydrogenfosforečnan didraselný	131,0 mg	131,0 mg
Kyselina fosforečná, 85%	58 mg	58 mg
Kyselina trans-4-(aminomethyl)-
cyklohexankarboxvlová	8,0 mg	8,0 mg
Sacharóza	250,0 mg	350,0 mg
Polysorbát 80	0,5 mg	0,5 mg
Voda pro injekční účely	do 10,0 ml	do 10,0 ml
pH	6,0	6,0
Osmolarita	322 mOsmol	343 mOsmol

Výsledek:

Reakce zvířat při injekci a histologické nálezy ukazují, že použité testované roztoky jsou celkově dobře kompatibilní.

Claims

1. Farmaceutický' přípravek obsahující aktivátory plazminogenu, vyznačující se tím, že obsahuje přírodní nebo rekombinantní tkáňový aktivátor plazminogenu nebo jeho derivát, alespoň jeden sacharid vybraný z monosacharidů nebo disacharidů, kyselinu trans-4(aminomethyl)cyklohexankarboxylovou jako jedinou aminokyselinu a popřípadě pufrovou látku, přičemž citrát je jako pufrová látka vyloučen.

2. Přípravky pod le nároku 1, vyznačuj ící se t í m , že sacharidem je disacharid.

3. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že sacharidem je sacharóza nebo trehalóza.

4. Přípravek podle jednoho z nároků laž3, vyznačující se tím, že dodatečně obsahuje pufrovou látku a touto pufrovou látkou je draselná sůl kyseliny fosforečné, zejména hydrogenfosforečnan didraselný.

5. Přípravek podle jednoho z nároků laž4, vyznačující se tím, že přípravek je ve formě zmrazeného roztoku.

6. Přípravek podle jednoho z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že obsahuje 40 až 100 mg/ml sacharidu, obzvláště 50 až 70 mg/ml.

7. Přípravek podle jednoho z nároků laž6, vyznačující se tím, že obsahuje 50 až 300 mmol/1 fosfátového pufru, obzvláště 80 až 220 mmol/1.

8. Přípravek podle jednoho z nároků laž7, vyznačující se tím, že obsahuje 1 až 50 mmol/1 kyseliny trans-4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylové, obzvláště 8 až 12 mmol/1.

-12CZ 286682 B6

9. Přípravek podle jednoho z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že obsahuje 0,005 až 0,1 % m/V (poměr hmotnosti a objemu) tenzidu, obzvláště 0,01 % m/V (poměr hmotnosti a objemu).

10. Přípravek podle jednoho z nároků laž9, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní aktivátor plazminogenu typu K2P, obzvláště BM 06.022.

11. Přípravek podle jednoho z nároků laž9, vyznačující se tím, že obsahuje tkáňový aktivátor plazminogenu nebo jeho derivát v koncentraci až do 10 mg/ml.

12. Přípravek podle jednoho z nároků 1 až 4 nebo 9ažll, vyznačující se tím, že je ve formě lyofilizátů.

13. Přípravek podle jednoho z nároků 1 až 4 nebo 6 až 11, vyznačující se tím, že je ve formě vodného roztoku o hodnotě pH 5,5 až 6,5.

14. Způsob výroby lyofilizo váného farmaceutického přípravku podle nároku 12, vyznačující se tím, že se připraví vodný roztok obsahující aktivátor plazminogenu, sacharid a kyselinu trans-4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylovou, roztok se zmrazí, teplota zmrazeného roztoku se nastaví na hodnotu pod teplotou skelného přechodu, obzvláště mezi -40 a -50 °C, a zmrazený roztok se lyofílizuje ve vakuu.

15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že při lyofilizaci se vychází z roztoků, které obsahují účinnou látku ve trojnásobně vyšší koncentraci v porovnání s hotovým vodným injekčním nebo infúzním roztokem.