NO317726B1 - Farmasoytisk preparat av en plasminogenaktivator, fremgangsmate for fremstilling av preparatet, anvendelse av en kombinasjon av farmasoytiske hjelpestoffer til fremstilling av farmasoytiske administreringsformer og til langtidsstabilisering av farmasoytiske administreringsformer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår farmasøytiske preparater av en plasminogenaktivator, fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater og anvendelse av en kombinasjon av de farmasøytiske hjelpestoffene for fremstilling og stabilisering av preparatene.

Den humane vevsplasminogenaktivator (t-PA) har en stor, terapeutisk betydning ved oppløsning av blodkoagler, hhv. ved hjerteinfarkter. t-PA bevirker oppløsning av blodkoagler gjennom aktiveringen av plasminogen til plasmin. Plasmin løser i sin tur fibrin, som er hovedkomponenten i proteinmatriksen, fra det koagulerte blod.

Naturlig t-PA er sammensatt av flere funksjonelle domener; F, E, Kl, K2 og P. Domene P inneholder det proteolytisk aktive sentrum som bevirker spaltning av plasminogen til plasmin. Den genteknologiske fremstilling av plasminogenaktivatorer (PA), spesielt av t-PA eller forskjellige t-PA-mutanter i eukaryotiske og prokaryotiske celler er allerede kjent. Med dette syntetiseres t-PA-derivater fra prokaryoter, i motsetning til naturlig t-PA, i ikke-glykosylert form.

Som plasminogenaktivatorer kommer ifølge foreliggende oppfinnelse prinsipielt slike t-PA i betraktning, spesielt rekombinant fremstilte derivater av t-PA, som vesentlig omfatter de proteinområder av de naturlige proteiner som er egnede for fibrinolyse av tromber. Det kan også anvendes slike derivater av t-PA som oppviser delesjoner eller substitusjoner av enkelte eller flere aminosyrer i t-PA-sekvensen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan f.eks. de følgende plasminogenaktivatorer anvendes: t-PA (f.eks. Alteplase), LY 210825 (K2P tilgjengelig fra cellelinjer fra "syrian hamster". Circ. 82, 930-940); AFE3x og AFElx (K1K2, Blood 1988, 71,216-219); AFEK1 (K2P fraC127 museceller, J. Cardiovasc. Pharmacol. 1990, 16, 197209); E-6010 (Jap. Circ. J. 1989, 53, s. 918); t-PA-varianter (Thromb. Haemost., 1989, 62, s. 542); K2P og D-K2P (Tromb. Haemost., 1989, 62, s. 393); MB-1018 (FK2K2P, Thromb. Hameost. 1989,62, s. 543); FK2P (FASEB J., 1989, 3, A1031, abstract4791); Aix (Circulation, 1988, 4,11-15); K1K2P (Thromb. Res., 1988, 50, 33-41); FK1K2P (J. Biol. Chem., 1988, 263,1599-1602); TNK-varianter av t-PA (WO 93/24635); bat-PA (Witt et al., Blood 1992; 79: 1213-1217 og Mullot et al., Arterioscler. Thrombos. 1992; 12: 212-221). Spesielt kommer slike plasminogenaktivatorer i betraktning som inneholder kringle-2-domenet ("K2") av t-PA og/eller serinproteasedomenet ("P"). I denne forbindelse skal det f.eks. nevnes t-PA-mutanten VP A" av type K2P, som er beskrevet i EP 0 382 174 (WO 90/09437).

Foreliggende oppfinnelse angår spesielt plasminogenaktivatorer av type K2P, K1K2P, FK1K2P og FK2K2P, slike som beskrevet i de følgende publikasjoner: Protein Engineering 5(1), 93-100 (1992); DE-OS-39 23 339.1; Circ. 1990, 82, 930- 940; J. Cardiovasc. Pharmacol. 1990, 16,197-203; Blood 1988,71,216-219; J. Biol. Chem. 1988,263,1599-1602; Thromb. Haemost. 1989,62, s. 543. Spesielt anvendes rekombinante plasminogenaktivatorer av type K2P, slike som beskrevet i EP-A-

0 382 174, og i Protein Engineering vol. 5(1), s. 93-100 (1992). Ytterligere t-PA-mutanter av denne type er beskrevet i de følgende patentsøknader: US 4 970 159, EP-A-0 196 920, EP-A-0 207 589; AU 61804/86; EP-A-0 231 624; EP-A-0 289 508; JP 63133988; EP-A-0 234 051; EP-A-0 263 172; EP-A-0 241 208; EP-A-0 292 009; EP-A-0 297 066; EP-A-0 302 456; EP-A-0 379 890.

Fra teknikkens stand er det kjent at sukkerandelen har en betydelig innflytelse på løseligheten og aggregeringen av proteiner (J. Biol. Chem. 263 (1988), 8832-8837). Det er således fastslått i EP-B-458 950 at, f.eks. ikke-glykosylerte rekombinante plasminogenaktivatorer med domenesammensetningen K2P har en vesentlig dårligere løselighet enn glykosylerte t-PA-derivater. Ikke-glykosylerte plasminogenaktivatorer, slik som f.eks. r-PA, løser seg som regel kun i liten grad i de vanligvis anvendte buffere for oppløsning av proteiner, slik som f.eks. 50 mmol/1 Na-sitrat, pH 6, 50 mmol/1 fosfatbuffer, eller fysiologisk NaCl-løsning. For anvendelse som terapeutisk aktivt materiale er det imidlertid nødvendig at plasminogenaktivatorer foreligger i tilstrekkelig høye konsentrasjoner, fortrinnsvis i en konsentrasjon opp til 10 mg/ml.

Fra EP-A-0 217 379 er det kjent at løseligheten av t-PA fra prokaryoter kan forhøyes ved hjelp av nøytrale eller svakt alkaliske argininformuleringer. En ulempe ved denne fremgangsmåte er imidlertid at gode løseligheter av t-PA fra prokaryoter kun kan oppnås med svært høye argininkonsentrasjoner.

Ytterligere galeniske formuleringer av plasminogenaktivatorer eller deres derivater er kjent fra WO 90/01333, WO 89/050347, WO 90/08557, EP 0 297 294, EP 0 156 169 og EP 0 228 862.

I WO 90/01333 (Invitron) er det således beskrevet kombinasjoner av lysin, histidin, arginin og sitrat for t-PA og derivater fra bakterier. Det anvendes 5 mmol/1 sitrat og 150 mmol/1 lysin, histidin og arginin ved pH 6. Albumin tilsettes dessuten.

I WO 89/050347 (Invitron) beskrives kombinasjonen av arginin (20-200 mmol/1) og sitrat (10-80 mmol/1) ved pH 5-8.

I WO 90/08557 (Genetics Institute) beskriver en kombinasjon av kreatinin og forskjellige tilsetningsstoffer som histidin, arginin, prolin, betain, kollin, imidazol, tryptofan, sitrat, eventuelt under tilsetning av glutaminsyre, asparaginsyre og ravsyre.

I EP 0 297 294 (Behring) beskrives kombinasjonen av minst to aminosyrer som lysin, ornitin, arginin, "traneksamsyre" og andre tilsetningsstoffer, ved pH 5-10.

EP 0 156 169 (Asahi) beskriver ornitin og/eller lysin, eventuelt under tilsetning av sitrat, glysin eller fosfat, og EP 0 228 862 (Genentech) beskriver en formulering inneholdende arginin med eller uten klorid, så vel som med eller uten detergent.

Alternative formuleringer av r-PA i nærvær av lysin, hhv. lysinanaloger, i sitronsyrebufrede løsninger, er også beskrevet i EP 0 458 950 (Boehringer Mannheim). Nyere undersøkelser viser imidlertid at løseligheten av r-PA heller ikke er fullstendig tilstrekkelig i disse formuleringer. Det fastslås at løseligheten kan forbedres ved forhøyelse av sitratkonsentrasjonen, men slike formuleringer er ikke eller kun betinget veneforenlige. De høye saltkonsentrasjoner og den dermed forbundne lavere glasstemperatur (Tg<*>) fører dessuten til at lyofilisering av disse formuleringer må utføres ved temperaturer fra -45 til 50 °C. Disse temperaturer er teknisk ofte kun realiserbare med meget høye omkostninger og fordrer kostbare styrings- og overvåkningselementer for å måle og regulere de optimale betingelser for lyofiliseringen. Dette er dessuten også forbundet med et forholdsvis høyt energiforbruk. I tillegg anvendes det ofte for denne tekniske produksjon i stor skala eldre lyofiliseirngsanlegg som ikke disponerer den nødvendige kompliserte målings-og reguleringsteknikk og som følge av dette som regel kun kan garantere en arbeidstemperatur på ca. -45 °C.

Formålet for foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe formuleringer av plasminogenaktivatorer og deres derivater med god veneforenlighet, som inneholder det aktive materiale i tilstrekkelig høy konsentrasjon og som sikrer en god løselighet av det aktive materiale, hvorved stabiliteten av PA i lyofilisatet opprettholdes i et lengre tidsrom. Et mål for foreliggende oppfinnelse er dessuten å utvikle formuleringer som også i teknisk produksjonsmålestokk er garantert lyofiliserbare og garanterer en reproduserbar produktkvalitet for lyofilisatet.

Målet for foreliggende oppfinnelse oppnås ved hjelp av et farmasøytisk preparat inneholdende en plasminogenaktivator, idet preparatet som farmasøytisk tilsetningsmateriale inneholder minst ett sukker og traneksamsyre som den eneste aminokarboksylsyre, og som ikke inneholder citrat. Preparatet er lagringsstabilt i et lengre tidsrom i lyofilisert form. Den fremstilte vandige injeksjonsløsning ved re-konstitusjon oppfyller også dette kriterium for forlenget lagringsstabilitet. Dette er spesielt tilfelle når pH-verdien i løsningen innstilles til en verdi mellom 5,5 og 6,5. Som ytterligere tilsetningsmaterialer kan det farmasøytiske preparat inneholde vanlige buffermaterialer eller overflateaktive materialer (anioniske, kationiske eller nøytrale tensider).

For plasminogenaktivatorene (PA) som kommer i betraktning ved foreliggende oppfinnelse anvendes f.eks. plasminogenaktivatoren K2P (BM 06.022) som er nærmere beskrevet i den europeiske patentsøknad EP-A-0 382 174. Den består av kringle 2 (K2)- og proteasedomenet (P) fira det humane t-PA og foreligger på grunn av dens ekspresjon i Escherichia co/i-celler i uglykosylert form. Som sukker inneholder formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis mono- eller disakkarider. Som disakkarider kommer spesielt sakkarose, trehalose, maltose eller laktose i betraktning. Monosakkarider er spesielt galaktose eller det tilsvarende amino-sukker, som f.eks. galaktosamin. Fortrinnsvis anvendes de ikke-reduserende sukkere sakkarose eller trehalose. Konsentrasjonen av sukkeret i den vandige injeksjonsløsning er fortrinnsvis 40-100 mg/ml, fortrinnsvis ligger konsentrasjonen mellom 50 og 70 mg/ml.

Som buffermaterialer kan de farmasøytiske preparater inneholde vanlige materialer som kommer i betraktning for dette formål, saltene fremstilles av sterke syrer med svake baser eller av svake syrer med sterke baser. Spesielt skal det nevnes: alkalisalter av fosforsyre, vinsyre, eplesyre og lignende. Aminosyrer kan likeledes også komme i betraktning. Fortrinnsvis inneholder preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse en fosfatbuffer. Konsentrasjonen av fosfatbuffer i den ferdige injiserbare vandige løsning er nærmere bestemt 50-300 mmol/1, fortrinnsvis 80-220 mmol/1 og spesielt foretrukket 130-170 mmol/1. Som fosfatbuffer anvendes fortrinnsvis di-natrium- eller dikaliumhydrogenfosfat som innstilles til den aktuelle pH-verdi med fosforsyre.

Som løselighetsformidler inneholder preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse traneksamsyre (TES). Konsentrasjonen av traneksamsyre i den ferdige injiserbare, vandige løsning er fortrinnsvis 1-50 mmol/1, mer foretrukket 8-12 mmol/1. Spesielt foretrukket anvendes en konsentrasjon på 10 mmol/1. Det er overraskende funnet at traneksamsyre forhøyer løseligheten av plasminogenaktivatorer, spesielt av ikke-glykosylerte plasminogenaktivatorer, i vandige medier. For plasminogenaktivatorderivatet r-PA forhøyes løseligheten minst med en faktor på 1,5 i forhold til en traneksamfri løsning. Faktoren for løselighetsforhøyelsen ligger fortrinnsvis i området fra 2 til 3. Denne effekt er fremfor alt fordelaktig innen rammen for fremstilling av lyofiliserte, farmasøytiske preparater av plasminogenaktivatorer, fordi muligheten for konsentrasjonsforhøyelse av plasminogenaktivator i de anvendte løsninger kan betydelig redusere vannmengden som anvendes i framstillingsprosessen, og totalt oppnå en energisparende og kostnadsgunstig fremstilling. Ved dette forkortes spesielt lyofiliseirngstidene i fremstillingsprosessen.

Som tensid kan det anvendes ikke-ioniske, anioniske eller kanoniske tensider, fortrinnsvis imidlertid ikke-ioniske tensider som f.eks. Tween 80 eller Tween 20. Tensidkonsentrasjonen er 0,005-1,0 % (vekt/volum), fortrinnsvis 0,01 %.

Egnet for et farmasøytisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse i vandig form er en pH-verdi mellom 5,5 og 6,5, fortrinnsvis en pH-verdi på 5,8-6,2.

Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder det aktive materiale i en konsentrasjon opp til 10 mg/ml, fortrinnsvis 3-5 mg/ml.

De farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes som injeksjons- eller infusjonsløsninger. Preparatene kan stilles til rådighet som en allerede injeksjonsferdig løsning som har sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse. Det er imidlertid også mulig at de farmasøytiske preparater stilles til rådighet i form av lyofilisater. Disse rekonstitueres deretter med egnede midler eller løsninger (f.eks. med vann) kjent for injeksjonsformål. Som injeksjonsmedium anvendes det for preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis vann som eventuelt kan inneholde vanlige isotoniske tilsetningsmidler som f.eks. en fysiologisk NaCl-konsentrasjon.

Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelse som er kjennetegnet ved at plasminogenaktivatoren sammen med sukker og traneksamsyre overføres i en egnet farmasøytisk administreringsform.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en kombinasjon av de farmasøytiske hjelpestoffene sukker, fosfatbuffer, traneksamsyre og tensid for fremstilling av farmasøytiske administreringsformer som blir tolerert av venene, og for fremstilling av administreringsformer som har lagringsstabilitet på minst to år.

Ytterligere omfattet av foreliggende oppfinnelse er anvendelse av en kombinasjon av de farmasøytiske hjelpestoffene sukker og traneksamsyre for langtidsstabilisering av farmasøytiske administreirngsformer ifølge oppfinnelsen, spesielt for å motvirke tap av den biologiske aktiviteten til plasminogenaktivatoren eller for å motvirke dannelsen av aggregater i farmasøytiske administreirngsformer inneholdende en plasminogenaktivator.

Stabilitetsundersøkelser viser at preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse er stabile som løsninger ved 4 °C i minst 30 dager. Stabiliteten av det aktive materiale i lyofilisatene ifølge foreliggende oppfinnelse er ved 4 °C mellom 2 og 5 år. Et spesielt fordelaktig faktum er også at legemiddelpreparatene oppviser en utmerket stabilitet også ved høyere termisk belastning, hvilket i høy grad gjør dem uømfintlige overfor temperatursvingninger som spesielt kan opptre i varmere klimaområder av jorden, spesielt et brudd i et kjøleelement. På grunn av de ofte lange omsetningsveier i tilfellet med farmasøytiske administreirngsformer fra legemiddel-produsent til sluttforbruker i de forskjellige land, kan det ikke utelukkes at preparatene også eventuelt utilsiktet utsettes for temperatursvingninger over et lengre tidsrom, hvilket fører til et aktivitetstap for proteinene og også i ekstreme tilfeller kan sette spørsmålstegn ved det terapeutiske behandlingsresultat. Administreirngsformene ifølge foreliggende oppfinnelse er imidlertid i høy grad ufølsomme overfor slike temperatursvingninger. I de foreløpige stabilitetsundersøkelser kunne det vises at det for preparatene, selv ved en temperatur på 35 °C i et tidsrom på 30 dager, ikke kunne fastslås noen nevneverdig innflytelse med hensyn til stabiliteten av proteinene. Som følge av dette utgås det fra at preparatene ved korrekt lagring ved kjøleskapstemperatur oppviser en stabilitet på 2 til 5 år.

Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse har dessuten den fordel at glasstemperaturen (Tg<1>) til den innfrosne løsning for fremstilling av lyofilisatene er forholdsvis høy og ligger mellom -33 °C og -40 °C, slik at reproduserbarheten for lyofilisatenes produktkvalitet også i produksjonsmålestokk garanteres med tilstrekkelig sikkerhet. Den relativt høye glasstemperatur er dessuten spesielt fordelaktig fordi at ved teknisk betingede eller uforutsette temperaturøkninger under de ofte meget lange lyofiliseringstider, er risikoen for en utilsiktet opptining av de nedfrosne løsninger mindre sannsynlig. I tilfeller hvor glasstemperaturen ligger under -40 °C og denne temperatur overskrides under lyofiliseringsprosessen, hvilket spesielt skjer ved tekniske lyofiliseirngsanlegg som arbeider ved temperaturer i nærheten av - 45 °C, kan den uønskede overskridelse av glasstemperaturen føre til ufordelaktige forandringer av den nedfrosne løsning. En tilstrekkelig god produktkvalitet kan da ikke mer garanteres. For proteinholdige lyofilisater kan det ved dette spesielt inntre aktivitetstap for proteinene, hhv. dannelse av aggregater. En ytterligere fordel ved preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse med en glasstemperatur på -33 til -40 °C består i at det nødvendige energiforbruk for lyofiliseringsprosessen blir minimalisert fordi lyofiliseringsprosessen ikke nødvendigvis må gjennomføres ved temperaturer lavere enn -50 °C.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan det spesielt oppnås forholdsvis høye glasstemperaturer for de nedfrosne løsninger når det som fosfatbuffer i lyofiliseringsløsningene anvendes et kaliumsalt, som f.eks. dikaliumhydrogenfosfat eller kaliumdihydrogenfosfat. Med hensyn til dette kommer spesielt dikaliumhydrogenfosfat i en konsentrasjon på 20-40 mg/ml, fortrinnsvis 20-30 mg/ml, i betraktning. Økningen av glasstemperaturen kan forsterkes ved tilsetning av sakkarose. Sakkarosen tilsettes fortrinnsvis i en konsentrasjon på 60-90 mg/ml, spesielt 60-80 mg/ml. Spesielt foretrukket anvendes en løsning som inneholder ca.

26 mg/ml dikaliumhydrogenfosfat (K2HP04x 12 H20) og ca. 70 mg/ml sakkarose. pH-verdien i løsningen innstilles fortrinnsvis med 85 % fosforsyre (ca. 12 mg/ml) til en verdi på 6. Løsningen inneholder dessuten ca. 0,5-5 mg/ml, fortrinnsvis 1-2 mg/ml, traneksamsyre, spesielt ca. 1,6 mg/ml. Løsningen kan dessuten inneholder tensider, slik som f.eks. Tween 80, som fortrinnsvis tilsettes i en konsentrasjon på 0,01-

0,3 mg/ml, spesielt foretrukket 0,1 mg/ml.

En ytterligere fordel ved lyofilisatene ifølge foreliggende oppfinnelse består i at de etter avslutning av lyofiliseringen oppviser en forholdsvis liten restfuktighet. Restfuktigheten ligger nærmere bestemt ved verdier lavere enn 5 %, fortrinnsvis mellom 0,5 og 4 %, spesielt 1-3 %. Vanligvis ligger verdier for lyofilisater høyere enn 6 %. Den lavere restfuktighet medfører at preparatene har en bedre lagringsstabilitet. Preparater med høyere restfuktighet fører ofte til en ustabilitet hos proteiner som kan merkes ved tap av biologisk aktivitet eller ved dannelse av aggregater.

En ytterligere fordel ved preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse består i at ved fremstilling av lyofilisatene, på grunn av den ved tilsetning av traneksamsyre oppnådde løselighetsforhøyelse av ikke-glykosylerte plasminogenaktivatorer, spesielt i tilfelle med mutanter av type K2P, K1K2P eller P, kan utgås fra mindre volumer (f.eks. ca. 5 ml pr. enhetsadministreringsform) av løsningene som skal nedfryses, slik at lyofiliseringstiden forkortes betydelig i forhold til de hittil anvendte løsninger for fremstilling av lyofilisater (f.eks. ca. 10 ml pr. administreirngsform). Fortrinnsvis utgås det fra løsninger som inneholder det aktive materiale i ca. to ganger høyere konsentrasjon sammenlignet med de injeksjonsferdige, vandige administreringsformer, slik at det kan anvendes vandige løsninger på 5 ml i stedet for de hittil vandige løsninger på 10 ml.

Undersøkelser på veneforenlighet viser en god forenlighet av preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse.

De etterfølgende utførelseseksempler gir en nærmere belysning av foreliggende oppfinnelse uten å begrense dem:

Eksempel 1

Uklarhetsdannelse etter mekanisk belastning/ måling av lvsspredningen av preparater ifølge foreliggende oppfinnelse

r-PA (BM 06.022) ble innstilt til en proteinkonsentrasjon (Cprot.) på

6 mg/ml (ultrafiltrering gjennom en Amicon YM 10-membran) og dialysert mot den angitte buffer. Probene ble deretter innstilt til CProt. = 4 mg/ml og a) hensatt uendret, b) omrørt med 0,01 % Tween 80 og c) med 0,01 % Tween 20.

Belastningen av probene ble utført i 10 sekunder på en Whirl Mix (Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik VF2, maksimalt omdreinings tall). Probene ble deretter inkubert i 2 minutter ved romtemperatur.

Lysspredningen i de ubelastede og belastede prober ble målt fluorometrisk ved 25 °C (Ex. 360 nm, Em.: 360 nm; Ex.-bandpath: 3 nm; Em.-bandpath: 10 nm; måleintervall: 10 sekunder i 3 minutter). I figur 1 er verdien for

spredningen av proben angitt korrigert for fluorescensen av bufferen.

Resultat: De foreliggende data viser at uten tilsetning av detergenter under mekanisk belastning blir en betydelig økning av lysspredningen i proben (figur 1). Økning kan ved tilsetning av detergenter undertrykkes i betydelig grad. Innen rammen for målenøyaktigheten kan det ikke påvises noen forskjell mellom Tween 80 og Tween 20.

I figur 1 (mekaniske belastninger av probene A, B, C, D) er de oppnådde resultater sammenfattet. De anvendte forkortelser i figur 1 betegner:

A) 150 mM Na2HP<VH3P04, pH 6,0

10 mM TES

50 mg/ml sakkarose

a) uten detergent

b) med 0,01% Tween 80

c) med 0,01 % Tween 20

B) 150 mM Na2HP04/H3P04, pH 6,0

10 mM TES

50 mg/ml trehalose

a) uten detergent

b) med 0,01 % Tween 80

c) med 0,01 % Tween 20

C) 150 mM K2HPO4/H3PO4, pH 6,0

lOmMTES

50 mg/ml sakkarose

a) uten detergent

b) med 0,01 % Tween 80

c) med 0,01 % Tween 20

D) 150 mM K2HPO4/H3PO4, pH 6,0

10 mM TES

50 mg/ml trehalose

a) uten detergent

b) med 0,01 % Tween 80

c) med 0,01 % Tween 20

Eksempel 2

Lagring av r- PA ( BM 06. 022) i TES/ sakkaroseholdige formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse/ Zflere gangers nedfrysing og opptining

r-PA ble dialysert mot bufferen angitt i tabell 1 (uten Tween 80), innstilt til Cprot. = 4 mg/ml, omrørt med Tween 80 ved C = 0,01 %, porsjonert og sterilfiltrert. Ni prober ble nedfrosset ved -20 °C , hhv. -70 °C . På dagene angitt i tabellen ble alle prober unntatt kontrollen opptint (15 minutter ved 25 °C i vannbad). Én probe ble analysert (CproLog amidolytisk aktivitet). Resten av probene ble på nytt nedfrosset til - 20 °C , hhv. -70 °C . Etter avslutning av serien ble aktiviteten den ikke-belastede kontroll bestemt.

Resultat: Som det fremgår fra dataene i tabell 1 kan r-PA nedfryses og opptines minst 8 ganger uten aktivitetstap.

Kontroll: Probe målt ubehandlet.

AA: Amidolytisk aktivitet CProL: Proteinkonsentrasjon

Eksempel 3

Stabilitet av r- PA i løsning

Sammenligning mellom forskjellige formuleringer ved Cpmt= 4 mg/ ml

r-PA (BM 06.022) ble konsentrert gjennom en Amicon YM 10-membran til 5 mg/ml og dialysert mot bufferen angitt i tabell 2 (uten Tween 80). Dialysatet ble innstilt CProt. = 4 mg/ml, omrørt med Tween 80 ved C = 0,01 %, porsjonert og lagret ved -20 og 4 °C. Etter 7,14, 20 og 30 dager ble den amidolytiske aktivitet og proteinkonsentrasjonen bestemt i de belastede prober.

Resultat: Probene lagret ved -20 og 4 °C forble uforandret i 30 dager.

AA: Amidolytisk aktivitet CProt.: Proteinkonsentrasjon

Eksempel 4

Stabilitet av r- PA i løsning

Sammenligning mellom forskjellige formuleringer ved Cpmt= 6 mg/ ml

r-PA (BM 06.022) ble dialysert over natten mot den nedenfor angitte buffer og innstilt på Cp,^.~6 mg/ml ved konsentrering gjennom en Amicon YM-10 membran. Probene ble oppfylt i 1 ml porsjoner og lagret i 30 dager ved -20 og 4 °C. Etter 1,2, 5,9,15 og 29 dager ble aktiviteten og proteininnholdet bestemt.

Resultat: Det fremgår fra tabellene at det aktive materiale BM 06.022 i de angitte formuleringer er stabile i minst 29 dager ved -20 °C og 4 °C .

Eksempel 5

Løselighet av r- PA i formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse

r-PA (BM 06.022) ble konsentrert gjennom YM 10 til 6 mg/ml og dialysert mot den nedenfor angitte buffer. Dialysatet ble på nytt konsentrert gjennom en Amycon YM 10-membran så lenge at det inntrådte en uklarhet. Etter sentrifugering av probene ble supernatantene lagret i S dager ved 4 °C. I begynnelsen og ved slutten av lagringen ble den amidolytiske aktivitet og CProtbestemt.

Tabell 5

150 mM Na2HP04/H3P04, pH 6,0

10 mM TES

50 mg/ml sakkarose

0,01 % Tween 80

Resultat: Løseligheten av r-PA oppgår til ca. 10 mg/ml. Ved den maksimale proteinkonsentrasjon kan proben lagres ved 4 °C uten forandring av den amidolytiske aktivitet i det minste inntil 5 dager.

Eksempel 6

Fremstilling av flytende administreirngsformer

De følgende administreirngsformer ble fremstilt som løsninger før lyofilisering:

Sammensetning av løsningene før lyofilisering.

Fremstilling av lyofilisat:

Etter sterilfiltrering ble aliquoter på 5 ml fylt på 20 ml glassflasker. Lyofiliseringen ble utført som følger: De fylte glassflasker ble plassert i en frysetørker og nedfrosset ved temperaturer fra -40 til -50 °C platetemperatur i 10 timer ved atmosfærisk trykk. Deretter ble det i kammeret påført en vakuumverdi på p = 0,01 til 0,1 mbar. Platetemperaturen ble deretter innstilt slik at produkttemperaturen til enhver tid med sikkerhet lå under glassovergangstemperaturen. Etter at den samlede ismengde var sublimert ble platetemperaturen forhøyet til en verdi 20-40 °C og deretter ble det utført en ettertørking i vakuum. Restfuktigheten ble bestemt etter vanlige frem-gangsmåter (bestemmelse etter metoden ifølge Karl Fischer) og var for løsning A 6 % og løsning B 3 %. Lagringen av lyofilisatene for stabilitetsundersøkelser ble utført ved temperaturer på 4 °C (kjøleskapstemperatur), 20 °C (romtemperatur) og 35 °C. Stabiliteten av lyofilisatene etter en lagringstid på 4 til 12 uker ble fullført ved de angitte temperaturer slik som det fremgår fra de analytiske undersøkelser med hensyn til amidolytisk aktivitet og proteinkonsentrasjon.

Rekonstituering av lyofilisatene for anvendelse: Lyofilisatene ble fortynnet med vann for injeksjonsformål til 10 ml. Dette tilsvarer en fortynning en faktor på 2 i forhold til de opprinnelige volumer av løsningen før lyofiliseringen.

Eksempel 7

Test på veneforenlighet av formuleringer ifølge forelig<g>ende oppfinnelse

Det ble tillaget to vemm- og to placeboløsninger av preparatene oppført i tabell 6 og disse ble administrert til kaniner intravenøst. Som appliseringsmengde ble det anvendt 0,5 ml/dyr, for hver av de fire testløsninger ble det anvendt 5 dyr.

Tabell 6

Sammensetning av verum- og placeboløsninger

1. Verumløsning

2. Placeboløsning

Resultat: Reaksjonen til dyrene ved injeksjonen og de histologiske funn viser at samtlige av de anvendte prøveløsninger er godt forenlige.

Claims (13)

1. Farmasøytisk preparat av en plasminogenaktivator, karakterisert vedat det inneholder sukker og traneksamsyre som den eneste aminokarboksylsyre og som ikke inneholder citrat.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert vedat sukkeret er et disakkarid, helst sukrose eller trehalose.

3. Preparat ifølge ett av kravene 1 eller 2, karakterisert vedat preparatet foreligger som en løsning og inneholder 40-100 mg/ml sukker, helst 50-70 mg/ml sukker.

4. Preparat ifølge ett av kravene 1-3, karakterisert vedat preparatet foreligger som en løsning og inneholder 1-50 mMol/1 traneksamsyre, helst 8-12 mMol/1 traneksamsyre.

5. Preparat ifølge ett av kravene 1-4, karakterisert vedat preparatet inneholder 0,005-0,1 % (w/v) tensid, helst 0,01 % (w/v) tensid.

6. Preparat ifølge ett av kravene 1-5, karakterisert vedat plasminogenaktivatoren er et protein av type K2P, K1K2P, FK1K2P eller FK2K2P.

7. Preparat ifølge ett av kravene 1-5, karakterisert vedat plasminogenaktivatoren er t-PA eller et derivat av t-PA fremskaffet ved delesjon eller substitusjon av en eller flere aminosyrer.

8. Preparat ifølge ett av kravene 1,2 eller 5-7, karakterisert vedat den farmasøytiske administreringsform er et lyofilisat.

9. Preparat ifølge ett av kravene 1-7, karakterisert vedat administreringsformen er en vandig løsning og løsningens pH-verdi er 5,5-6,5.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat ifølge ett av kravene 1-9, karakterisert vedat plasminogenaktivatoren sammen med sukker og traneksamsyre overføres i en egnet farmasøytisk administreringsform.

11. Anvendelse av en kombinasjon av de farmasøytiske hjelpestoffene sukker, fosfatbuffer, traneksamsyre og tensid for fremstilling av farmasøytiske administreringsformer som blir tolerert av venene, ifølge krav 1.

12. Anvendelse ifølge krav 11 for fremstilling av administreringsformer som har lagringsstabilitet på minst to år.

13. Anvendelse av en kombinasjon av de farmasøytiske hjelpestoffene sukker og traneksamsyre for langtidsstabilisering av farmasøytiske administreringsformer ifølge krav 1, spesielt for å motvirke tap av den biologiske aktiviteten til plasminogenaktivatoren eller for å motvirke dannelsen av aggregater i farmasøytiske administreringsformer inneholdende en plasminogenaktivator.