CN114040754A - 用于稳定液体蛋白质制剂的组合物及方法 - Google Patents

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CN114040754A CN202080047738.7A CN202080047738A CN114040754A CN 114040754 A CN114040754 A CN 114040754A CN 202080047738 A CN202080047738 A CN 202080047738A CN 114040754 A CN114040754 A CN 114040754A
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Abstract

本公开提供包含多肽和表面活性剂的液体制剂。特别地，本发明公开一种包含多肽和表面活性剂的液体制剂，其中所述表面活性剂的至少约70％(wt％)为异山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯。本发明还提供用于制备所述液体制剂的方法、包含此类液体制剂的制品以及使用此类液体制剂治疗患者的方法。

Description

用于稳定液体蛋白质制剂的组合物及方法
相关申请案的交叉引用
本申请要求2019年6月28日提交的美国临时申请第62/868,615号的优先权权益，所述的美国临时申请以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明大体上涉及包含多肽及表面活性剂的稳定液体药物制剂及其制备方法。
背景技术
聚山梨醇酯(PS)是生物医药蛋白质制剂中的常用表面活性剂，已对多个降解途径表现出敏感性，包括：化学水解、氧化及酶水解。PS降解会导致产生多种过氧化物，这些过氧化物随后在长期储存过程中使蛋白质中的氨基酸残基(例如蛋氨酸)氧化。Levine等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1996)93,15036-15040。此类氨基酸残基的氧化可能对蛋白质的生物活性具有负面影响，从而限制PS在蛋白质制剂中的保护作用。另外，聚山梨醇酯是异质混合物，因此，降解模式在不同的途径之间可能显著不同。因此，在医药蛋白质制剂的研发过程中，仍然需要更有效的赋形剂用于表面活性剂。
发明内容
本公开提供一种包含多肽及表面活性剂的液体制剂，其中至少约70％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯包含约5至30个POE单元。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯包含约20个POE单元。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯包含选自由任选地经取代的C4-28烷基及任选地经取代的C4-28烯基组成的组的脂肪酸链。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯为单酯、二酯或前述两者的混合物。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯选自由异山梨醇POE单月桂酸酯、异山梨醇POE单肉豆蔻酸酯、异山梨醇POE单棕榈酸酯、异山梨醇POE单硬脂酸酯及异山梨醇POE单油酸酯组成的组。
在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯是式(I)化合物：
Figure BDA0003440584380000021
其中：
a和b独立地为2至28的整数，条件为a与b的和为5至30的整数；
R1和R2为独立地选自由氢及-C(O)R"组成的组，其中R"为任选地经取代的C3-27烷基或任选地经取代的C3-27烯基；且
R3和R4独立地为氢。
在一些实施例中，a与b的和为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些实施例中，a与b的和为9。在一些实施例中，a与b的和为20。在一些实施例中，R1为H且R2为-C(O)R"。在一些实施例中，R2为H且R1为-C(O)R"。在一些实施例中，R1及R2都为-C(O)R"。在一些实施例中，R"为未经取代的C3-27烷基。在一些实施例中，R"为未经取代的C11烷基。在一些实施例中，R"为未经取代的C3-27烯基。在一些实施例中，R"为未经取代的C17烯基。
在一些实施例中，表面活性剂进一步包含POE脂肪酸酯。在在一些实施例中，至少约80％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少约85％、至少约90％或至少约95％(wt％)的该表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少约90％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些实施例中，POE脂肪酸酯包含选自由任选地经取代的C4-28烷基及任选地经取代的C4-28烯基组成的组的脂肪酸链。在一些实施例中，POE脂肪酸酯选自由POE单月桂酸酯、POE单肉豆蔻酸酯、POE单棕榈酸酯、POE单硬脂酸酯及POE单油酸酯组成的组。在一些实施例中，少于约20％的表面活性剂为POE脂肪酸酯。在一些实施例中，少于约10％的表面活性剂为POE脂肪酸酯。在一些实施例中，表面活性剂占液体制剂的约0.0005％至0.2％(w:v)。在一些实施例中，表面活性剂包含的异山梨醇POE脂肪酸酯的量大于POE脂肪酸酯的量。在一些实施例中，表面活性剂进一步包含失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，少于约10％、少于约8％、少于约5％、少于约3％或少于约1％的表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。
在一些实施例中，多肽为蛋白质。在一些实施例中，蛋白质选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人类抗体、嵌合抗体及抗体片段组成的组的抗体。在一些实施例中，抗体片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段组成的组。在一些实施例中，抗体浓度为约0.001mg/mL至约300mg/mL。在一些实施例中，液体制剂为复溶的冻干制剂。在一些实施例中，液体制剂用输注溶液进一步稀释至约0.001mg/mL至约100mg/mL的浓度。在一些实施例中，液体制剂实质上不含聚集体。在一些实施例中，液体制剂包含较少游离脂肪酸颗粒的形成。
本文中还提供了一种制品，其包括封装本文中所描述的任何液体制剂的容器。在一些实施例中，容器是IV袋。在一些实施例中，IV袋包括注射装置。在一些实施例中，IV袋包括输注溶液。本文中还提供了一种包含多肽及表面活性剂的冻干制剂，其中至少约70％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些实施例中，冻干制剂通过冻干本文中所公开的任何液体制剂来制备。
本文中还提供了一种制备液体制剂的方法，其包括将多肽及表面活性剂添加至水溶液中，其中至少70％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯包含约5至30个POE单元。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯包含约20个POE单元。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯包含选自由任选地经取代的C4-28烷基及任选地经取代的C4-28烯基组成的组的脂肪酸链。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯是单酯、二酯或前述两者的混合物。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯选自由异山梨醇POE单月桂酸酯、异山梨醇POE单肉豆蔻酸酯、异山梨醇POE单棕榈酸酯、异山梨醇POE单硬脂酸酯及异山梨醇POE单油酸酯组成的组。
在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯是式(I)化合物：
Figure BDA0003440584380000041
其中：
a和b独立地为2至28的整数，条件为a与b的和为5至30的整数；
R1和R2为独立地选自由氢及-C(O)R"组成的组，其中R"为任选地经取代的C3-27烷基或任选地经取代的C3-27烯基；且
R3和R4独立地为氢。
在一些实施例中，a与b的和为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些实施例中，a与b的和为9。在一些实施例中，a与b的和为20。在一些实施例中，R1为H且R2为-C(O)R"。在一些实施例中，R2为H且R1为-C(O)R"。在一些实施例中，R1及R2均为-C(O)R"。在一些实施例中，R"为未经取代的C3-27烷基。在一些实施例中，R"为未经取代的C11烷基。在一些实施例中，R"为未经取代的C3-27烯基。在一些实施例中，R"为未经取代的C17烯基。
在一些实施例中，表面活性剂进一步包含POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少约80％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少约85％、至少约90％或至少约95％(wt％)的该表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些实施例中，该方法进一步包括添加POE脂肪酸酯。在一些实施例中，POE脂肪酸酯包含选自由任选地经取代的C4-28烷基及任选地经取代的C4-28烯基组成的组的脂肪酸链。在一些实施例中，POE脂肪酸酯选自由POE单月桂酸酯、POE单肉豆蔻酸酯、POE单棕榈酸酯、POE单硬脂酸酯及POE单油酸酯组成的组。在一些实施例中，少于约20％的表面活性剂为POE脂肪酸酯。在一些实施例中，少于约10％的表面活性剂为POE脂肪酸酯。在一些实施例中，表面活性剂占液体制剂的约0.0005％至0.2％(w:v)。在一些实施例中，表面活性剂包含的异山梨醇POE脂肪酸酯的量大于POE脂肪酸酯的量。在一些实施例中，表面活性剂进一步包含失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，少于约10％、少于约8％、少于约5％、少于约3％或少于约1％的表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。
在一些实施例中，多肽为蛋白质。在一些实施例中，蛋白质选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人类抗体、嵌合抗体及抗体片段组成的组的抗体。在一些实施例中，抗体片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段组成的组。在一些实施例中，抗体浓度为约0.1mg/mL至约300mg/mL。在一些实施例中，液体制剂为重组冻干制剂。在一些实施例中，液体制剂用输注溶液进一步稀释至约0.1mg/mL至约2mg/mL的浓度。在一些实施例中，液体制剂经进一步冻干以制备冻干制剂。在一些实施例中，液体制剂实质上不含聚集体。在一些实施例中，液体制剂包含较少游离脂肪酸颗粒的形成。
应理解，本文中所描述的各个实施例的一种、一些或所有特性可组合以形成本发明的其他实施例。本发明的这些及其他方面对于本领域技术人员来说是显而易见的。本发明的这些和其他实施例将通过下面的详细描述来进一步描述。
附图说明
图1A及图1B示出了聚山梨醇酯20级分(图1A)及聚山梨醇酯80级分(图1B)的纯度及鉴定的UPLC分析。
图2A及图2B示出了使用荧光染料N-苯基萘-1-胺(NPN)时聚山梨醇酯20级分(图2A)及聚山梨醇酯80级分(图2B)的临界胶束浓度(CMC)。
图3A及图3B示出了聚山梨醇酯20级分(图3A)及聚山梨醇酯80级分(图3B)的表面张力随时间变化。
图4A及图4B示出了聚山梨醇酯20级分(图4A)及聚山梨醇酯80级分(图4B)的微胞大小，其中各级分的浓度为1wt％。
图5示出了含不同种浓度的聚山梨醇酯20级分的抗体制剂的影像。
图6A及图6B示出了含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的抗体制剂的影像。
图7A及图7B示出了含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的mAb B及mAB C抗体制剂的HIAC结果。
图8A、图8B、图9A及图9B示出了含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的mAB B及mAb C抗体制剂的HIAC结果。
图10A及图10B示出了在40℃下储存不同时长的含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的抗体制剂的影像。
图11A及图11B示出了在40℃下储存的含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的mAB B及mAb C抗体制剂的HIAC结果。
图12A、图12B、图13A及图13B示出了40℃下储存的含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的mAb B及mAb C抗体制剂的SEC-HPLC结果。
图14示出了在40℃下储存的含聚山梨醇酯20级分的mAb B抗体制剂的IEC结果。
图15A及图15B示出了在25℃下储存不同时长的含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的抗体制剂的图像。
图16A及图16B示出了在25℃下储存的含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的mAb B及mAb C抗体制剂的HIAC结果。
图17A、图17B、图18A及图18B示出了25℃下储存的含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的mAb B及mAb C抗体制剂的SEC-HPLC结果。
图19示出了在25℃下储存的含聚山梨醇酯20级分的mAb B抗体制剂的IEC结果。
图20A及图20B示出了在5℃下储存不同时长的含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的抗体制剂的图像。
图21A及图21B示出了在5℃下储存的含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的mAb B及mAb C抗体制剂的HIAC结果。
图22A、图22B、图23A及图23B示出了5℃下储存的含不同浓度的聚山梨醇酯20级分的mAb B及mAb C抗体制剂的SEC-HPLC结果。
图24示出了在5℃下储存的含聚山梨醇酯20级分的mAb B抗体制剂的IEC结果。
图25示出了通过由2.5U/mL假单胞菌(Pseudomonas Ceoacia)脂肪酶(PCL)对PS20及F2a(各自处于pH＝6.0制剂缓冲液中)进行强制降解的HIAC结果。
具体实施方式
本公开基于发现聚山梨醇酯的特定级分在药用蛋白质制剂中提供强保护作用。特别地，其允许使用较少表面活性剂达成相同保护效果，从而将由聚山梨醇酯降解所致的对蛋白质生物活性的负面影响降至最小。在一方面，本公开提供了一种蛋白质制剂，其包含一种或多种这样的聚山梨醇酯级分。本文中所描述的蛋白质制剂已经证明制剂中的蛋白质稳定性增加。本说明书还提供了用于制备蛋白质制剂的剂盒及方法。
I.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文中引用的所有专利、申请案、公开申请及其他出版物都以引用的方式整体并入本文中。如果这部分中提出的定义与以引用的方式并入本文中的专利、申请或其他出版物中所示的定义相反或者不一致，则此部分中所提出的定义优先于以引用的方式并入本文中的定义。
应理解，为清楚起见而描述在单独实施例的内容中的某些本发明特征也可组合提供在单一实施例中。相反，为简要起见而描述于单一实施例的内容中的各种本公开特征也可单独或以任何适合的子组合形式提供。关于特定方法步骤、试剂或条件的实施例的所有组合明确涵盖在本公开中且公开于本文中，如同逐一地且明确地公开各个及每个组合。
如本文中及所附的权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”及“该”包括多个指代物。
本文中提及“约”某一值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提到“约X”的描述包括对“X”的描述。
术语“药物制剂”是指呈允许活性成分的生物活性有效且不含对将施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的其他组分的形式的制剂。在一些实施例中，该制剂是无菌的。
“复溶的”制剂是通过将冻干的蛋白质或抗体制剂溶解于稀释剂中以使蛋白质分散在复溶的制剂中而制备的制剂。复溶的制剂适合于施用(例如，肠外施用)至要用相关蛋白质治疗的患者，且在本发明的某些实施例中可为以是适于皮下施用的制剂。
术语“蛋白质”、“多肽”及“肽”在本文中用于指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可为直链的或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，且其可以被非氨基酸打断。所述的术语还涵盖天然或通过干预，例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分结合而经修饰的氨基酸聚合物。通常，用于本文中的蛋白质将具有至少约5至20kD、或者至少约15至20kD、或至少约20kD的分子量。该定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的蛋白质。本文中的定义内所包含的蛋白质的实例包括哺乳动物蛋白质，例如肾素；生长激素，包括人类生长激素及牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；卵泡刺激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；瘦素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织因子及血管性血友病(von Willebrands)因子；抗凝血因子，如蛋白C；心钠素；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂，如尿激酶或者人类尿液或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；铃蟾素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α及肿瘤坏死因子β；肿瘤坏死因子受体，如死亡受体5及CD120；TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)；B细胞成熟抗原(BCMA)；B淋巴细胞刺激因子(BLyS)；增殖诱导配体(APRIL)；脑啡肽酶；RANTES(活化后调控正常T细胞表达及分泌因子)；人类巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人类血清白蛋白；Muellerian氏管抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；原松弛素；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血管内皮生长因子家族蛋白(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGFD及PlGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)家族蛋白(例如PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其二聚体)；纤维母细胞生长因子(FGF)家族，如aFGF、bFGF、FGF4及FGF9；表皮生长因子(EGF)；激素或生长因子受体，如VEGF受体(例如VEGFR1、VEGFR2及VEGFR3)、表皮生长因子(EGF)受体(例如ErbB1、ErbB2、ErbB3及ErbB4受体)、血小板衍生生长因子(PDGF)受体(例如PDGFR-α及PDGFR-β)及纤维母细胞生长因子受体；TIE配体(血管生成素、ANGPT1、ANGPT2)；血管生成素受体，如TIE1及TIE2；蛋白A或蛋白D；类风湿因子；神经营养因子，如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经滋养素3、神经滋养素4、神经滋养素5或神经滋养素6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子，如NGF-b；转型生长因子(TGF)，如TGF-α及TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子I及胰岛素样生长因子II(IGF-I及IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，如CD3、CD4、CDS、CD19及CD20；红血球生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；趋化因子，如CXCL12及CXCR4；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β及干扰素-γ；群落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSP及G-CSF；细胞介素，如介白素(IL)，例如IL-1至IL-10；中期因子；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如，如AIDS外膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；位址蛋白；调控蛋白；整合蛋白，如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4及VCAM；蝶素(ephrin)；Bv8；δ样配体4(DLL4)；Del-1；BMP9；BMP10；滤泡抑素；肝细胞生长因子(HGF)/扩散因子(SF)；Alkl；Robo4；ESMl；串珠蛋白聚糖；EGF样结构域7(EGFL7)；CTGF及其家族成员；血小板反应蛋白，如血小板反应蛋白1及血小板反应蛋白2；胶原蛋白，如胶原蛋白IV及胶原蛋白XVIII；神经纤毛素，如NRP1及NRP2；多效生长因子(PTN)；前颗粒蛋白；增殖蛋白；Notch蛋白，如Notch1及Notch4；脑信号蛋白，如Sema3A、Sema3C及Sema3F；肿瘤相关抗原，如CA125(卵巢癌抗原)或者HER2、HER3或HER4受体；免疫黏附素；及以上所列出的蛋白质中任一种的片段及/或变异体，以及结合至一种或多种蛋白质(包括例如以上所列出的蛋白质中任一种)的抗体，包括抗体片段。
术语“抗体”在本文中以其最广泛意义使用且具体地，涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段，只要其能展现所需生物活性即可。
“分离”的抗体是已经从其天然环境组分中鉴定并分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，且可包括酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，抗体纯化至(1)如通过例如罗氏方法(Lowry method)所测定达至超过95重量％抗体且在一些实施例中至超过99重量％；(2)通过由使用例如旋杯式定序仪达到足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)在还原或非还原条件下使用例如考马斯蓝(Coomassie blue)或银染色通过SDS-PAGE测定达到均一性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，这是因为该抗体的天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，分离的抗体通常将通过由至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”通常为包含两个一致轻(L)链及两个一致重(H)链的约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白。各轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而二硫键数目因不同的免疫球蛋白同型的重链而各异。各重链及轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。各重链具有处于一端的可变域(VH)及继其之后的众多恒定域。各轻链具有处于一端的可变域(VL)及处于其另一端的恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对准，且轻链可变域与重链的可变域对准。特定氨基酸残基被认为可在轻链和重链可变域之间形成界面。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“整抗体”在本文中可互换用于指其基本上完整形式的抗体，而不是如以下所定义的抗体片段。这种术语尤其是指具有含Fe区的重链的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，任选包含其抗原结合区。抗体片段上的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片片段；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文中所使用的术语“单克隆抗体”是指获自实质上均一的抗体群体的抗体，例如构成该群体的个别抗体除可能的突变，例如可能微量存在的天然存在突变外为一致的。因而，修饰词“单克隆”表明抗体的特征为不是离散抗体的混合物。在某些实施例中，这种单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合多肽序列是通过由包括自多个多肽序列中选择单个靶结合多肽序列的方法来获得。例如，选择过程可以是从多个克隆中，例如杂交瘤克隆池、噬菌体克隆池或重组DNA克隆池中选择独特的克隆。应理解，可进一步改变所选靶标结合序列，例如，以提高对靶标的亲和力、使靶标结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在活体内的免疫原性、以产生多特异性抗体等，且包含经改变的靶标结合序列的抗体也为本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除其特异性以外，单克隆抗体制剂的优势也在于其通常不受其他免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆”表示从基本上均一的的抗体群体中获得的抗体的特征，而不应理解为需要通过任何特定方法来产生抗体。
本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源，而该(等)链的其余部分与衍生自另一物种或者属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列一致或同源，只要其能表现出所需的生物活性即可(参见例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括
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抗体，其中抗体的抗原结合区来源于通过由例如用相关抗原使猕猴免疫而产生的抗体。
非人类(例如鼠类)抗体的“人源化”形式为含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施例中，人源化抗体为人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体HVR的残基被来自如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的非人类物种的HVR残基取代，非人类物种具有所需特异性、亲和力及/或容量。在一些情况下，人类免疫球蛋白的FR残由相应非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含受体抗体中或供体抗体中未发现的残基。可进行此等修饰以进一步精化抗体效能。一般而言，人源化抗体将包含实质上所有至少一个且通常两个可变域，其中所有或实质上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环，且所有或实质上所有FR都为人类免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步细节，参见例如Jones等人,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。另参见例如Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利第6,982,321号及第7,087,409号。
“人类抗体”为具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列及/或已使用如本文中所公开的制备人类抗体的技术中的任一种制备的抗体。此人类抗体定义特别排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。人类抗体可使用本领域已知的多种技术，包括噬菌体展示库来产生。Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。也可用于制备人类单克隆抗体的方法描述于以下文献中：Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。另参见van Dijk及van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原给予转基因动物来制备，所述转基因动物已经被修饰以响应抗原攻击而产生这种抗体，但内源性基因座已被禁用的转殖基因动物(例如免疫异种移植小鼠)施用抗原来制备(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利第6,075,181号及第6,150,584号)。关于通过人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体，另参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,103:3557-3562(2006)。
“稳定”制剂为其中的蛋白质在储存后基本上保持其物理稳定性及/或化学稳定性及/或生物活性的制剂。在一些实施例中，该制剂在储存后基本上保持其物理及化学稳定性以及其生物活性。一般基于制剂的预期保质期来选择储存期。用于量测蛋白质稳定性的各种分析技术可用于本领域，且综述于例如以下文献中：Peptide and Protein DrugDelivery,247-301,Vincent Lee编,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)；及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。可在所选曝光量及/或温度下量测所选时段内的稳定性。可用多种不同的方式定性及/或定量评估稳定性，包括评估聚集体形成(例如使用粒径排阻层析法、通过量测浊度及/或通过目视检查)；评估ROS形成(例如通过由使用光应力分析法或2,2'-偶氮双(2-甲脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)应力分析法)；使蛋白质的特定氨基酸残基(例如单克隆抗体的Trp残基及/或Met残基)氧化；通过使用阳离子交换层析、影像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区电泳来评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；用于比较还原抗体与完整抗体的SDS-PAGE分析；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估蛋白质的生物活性或靶结合功能(例如抗体的抗原结合功能)等。不稳定性可包括以下任一项或多项：聚集、脱酰胺化(例如Asn脱酰胺化)、氧化(例如Met氧化及/或Trp氧化)、异构化(例如Asp异构化)、截割/水解/片段化(例如铰链区片段化)、琥珀酰亚胺形成、未配对半胱氨酸、N末端延伸、C末端处理、糖基化差异、赋形剂降解、颗粒(例如游离脂肪酸颗粒)形成等。
如果蛋白质在目视检查颜色和/或透明度时或者在通过由紫外光散射或通过由粒径排阻层析法进行量测时显示无或极小聚集、沉淀及/或变性迹象，则其在药物制剂中“保持其物理稳定性”。
如果指定时间的化学稳定性使得蛋白质被视为仍保持其生物活性，如以下所定义，则该蛋白质在药物制剂中“保持其化学稳定性”。可通过由侦测并定量蛋白质的化学变化形式来评估化学稳定性。化学变化可包括蛋白质氧化，其可使用例如胰蛋白酶肽图、逆相高效液相层析(HPLC)及液相层析-质谱(LC/MS)来评估。其他类型的化学变化包括蛋白质的电荷变化，这可通过由例如离子交换层析法或icIEF来评估。
如果蛋白质在指定时间的生物活性在制备药物制剂时所表现出的生物活性的约10％内(在分析误差内)，如例如在单克隆抗体的抗原结合分析中所测定，则该蛋白质在药物制剂中“保持其生物活性”。如本文中所使用，蛋白质的“生物活性”是指蛋白质结合其靶标的能力，例如单克隆抗体结合至抗原的能力。其可进一步包括可在活体外或活体内量测的生物反应。此种活性可为拮抗性或促效性。
如本文中所使用，术语“聚乙二醇”、“PEG”、“聚氧化乙烯”、“PEO”、“聚氧乙烯”及“POE”可互换使用，并且是指包含两个或更多个氧化乙烯次单元的聚醚化合物。“聚乙二醇”可包含氧化乙烯寡聚物(例如，具有二至九个氧化乙烯单体次单元)或氧化乙烯聚合物(例如，具有十个或更多个九个氧化乙烯单体次单元)。
“脂肪酸”为具有长链烃侧基的羧酸。其包含通过由将甲基氧化至醇、醛、且随后氧化至酸的等效方案而衍生自烃的有机一元酸。脂肪酸可为饱和或不饱和的。对于不饱和脂肪酸，其可具有顺式(Z)或反式(E)构型，或两者的组合。
“烷基”包括具有所指示数目的碳原子，例如1至20个碳原子、或1至8个碳原子、或1至6个碳原子的直碳链及分支碳链。例如，C1-6烷基包括1至6个碳原子的直链烷基及支链烷基。当命名具有特定碳数目的烷基残基时，所有具有该碳数目的所有支链及直链型式都包括在内；因此，例如，“丙基”包括正丙基及异丙基；且“丁基”包括正丁基、二级丁基、异丁基及三级丁基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、二级丁基、三级丁基、戊基、2-戊基、3-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基及3-甲基戊基。当提供某一值的范围(例如，C1-6烷基)时，包括该范围内的每一值以及所有中间范围。例如，“C1-6烷基”包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1-6、C2-6、C3-6、C4-6、C5-6、C1-5、C2-5、C3-5、C4-5、C1-4、C2-4、C3-4、C1-3、C2-3及C1-2烷基。
“烯基”是指具有所指示数目的碳原子(例如2至8或2至6个碳原子)和至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基。该基团可关于双键呈顺式或反式构型(Z或E构型)。烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基(例如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基)及丁烯基(例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基)。
术语“经取代”是指规定基团或部分带有一个或多个取代基，包括但不限于如烷氧基、酰基、酰氧基、烷氧基羰基、羰基烷氧基、酰基氨基、氨基、氨基酰基、氨基羰基氨基、氨基羰氧基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、芳氧基、氰基、叠氮基、卤代、羟基、硝基、羧基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基、杂环基、芳烷基、氨基磺酰基、磺酰基氨基、磺酰基、侧氧基及其类似基团的取代基。术语“未经取代”是指规定基团不带有取代基。在使用术语“经取代”来描述结构系统时，取代指将发生在系统上的任何原子价允许的位置。在基团或部分带有超过一个取代基时，应理解，这种取代基可彼此相同或不同。在一些实施例中，经取代的基团或部分带有一至五个取代基。在一些实施例中，经取代的基团或部分带有一个取代基。在一些实施例中，经取代的基团或部分带有两个取代基。在一些实施例中，经取代的基团或部分带有三个取代基。在一些实施例中，经取代的基团或部分带有四个取代基。在一些实施例中，经取代的基团或部分带有五个取代基。
“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情形可能发生或可能不发生，且该描述包括该事件或情形发生的情况及其不发生的情况。例如，“任选经取代的烷基”包括如本文中所定义的“烷基”及“经取代的烷基”两者。本领域技术人员应理解，关于含有一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行及/或固有地不稳定的任何取代或取代模式。还应理解，在基团或部分任选地经取代时，本公开包括该基团或部分经取代的实施例及该基团或部分未经取代的实施例。
“无菌”制剂是无菌的或者不含或基本上不含所有活微生物及其孢子。
II.多肽制剂
本文中提供包含多肽及表面活性剂的制剂，其中表面活性剂包含一种或多种聚山梨醇酯组分。在一些实施例中，制剂为液体制剂。在一些实施例中，制剂为冻干制剂。
表面活性剂
生物药物制剂通常与表面活性剂一起调配以保护活性医药成分免受界面应力影响。与界面(尤其空气-水)的相互作用已显示在搅拌或长期储存期间引起治疗蛋白质聚集。聚山梨醇酯是用于防止生物医药的这种类型的相互作用的常用表面活性剂。一般针对其高表面活性、低临界胶束浓度(CMC)及低毒性对其进行选择。然而，这些表面活性剂为相关化合物的非均混合物，这种化合物组合起来赋予其生物药物制剂所需的独特性能。
聚山梨醇酯(PS)为一类乳化剂，其通常描述为用脂肪酸进行酯化的乙氧基化失水山梨糖醇。PS为具有多层异质性的相关化合物混合物。第一层为脂肪酸酯尾长。美国药典和欧洲药典专论规定，这些酯在PS20中的分布应为40-60％月桂酸酯(C12)酯、14-25％肉豆蔻酸酯(C14)酯及7-15％棕榈酸酯(C16)酯与至多1％己酸酯(C6)酯、10％辛酸酯(C8)酯、10％癸酸酯(C10)酯、7％硬脂酸酯(C18)酯、11％单不饱和C18酯及3％双不饱和C18酯。其他异质性来源于POE链的长度以及二酯及三酯的存在。此外，在由山梨醇合成失水山梨糖醇过程中也形成异山梨醇，由此可产生其特有的具有两个而非四个POE臂的PS20类化合物系列。另参见以下表1。已发现不同的组分具有显著不同的溶液和界面性质。特别地，异山梨醇POE脂肪酸酯组分更大程度地保护多肽的性能。因此，使用高于聚山梨醇酯中(例如，如EP或USP专论中所描述)的异山梨醇POE脂肪酸酯浓度(例如至少70％(wt％))允许在为液体制剂中的多肽提供更大程度的保护的同时使用较少量的表面活性剂。
本文提供了一种生物药物制剂，其包含表面活性剂与在保护制剂中的多肽方面有效的某些聚山梨醇酯组分。在一些实施例中，这种组分允许使用较少表面活性剂但提供较高稳定性。在一些实施例中，使用较少量的表面活性剂导致较少游离脂肪酸颗粒的形成。在一些实施例中，这种组分在更大程度上保护多肽免受游离脂肪酸颗粒影响。
一方面，表面活性剂包含异山梨醇POE脂肪酸酯。另一方面，表面活性剂包含异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。
在一些实施例中，各异山梨醇POE脂肪酸酯及各POE脂肪酸酯独立地具有约5至10个POE单元、约10至15个单元、约15至20个POE单元、约20至25个POE单元、约25至30个POE单元、约15至30个POE单元。在一些实施例中，各异山梨醇POE脂肪酸酯及各POE脂肪酸酯独立地具有5个POE单元、6个POE单元、7个POE单元、8个POE单元、9个POE单元、10个POE单元、11个POE单元、12个POE单元、13个POE单元、14个POE单元、15个POE单元、16个POE单元、17个POE单元、18个POE单元、19个POE单元、20个POE单元、21个POE单元、22个POE单元、23个POE单元、24个POE单元、25个POE单元、26个POE单元、27个POE单元、28个POE单元、29个POE单元、30个POE单元或其组合。在一些实施例中，该异山梨醇POE脂肪酸酯具有约5至10个POE单元、约10至15个单元、约15至20个POE单元、约20至25个POE单元、约25至30个POE单元、约15至30个POE单元。在一些实施例中，该异山梨醇POE脂肪酸酯具有5个POE单元、6个POE单元、7个POE单元、8个POE单元、9个POE单元、10个POE单元、11个POE单元、12个POE单元、13个POE单元、14个POE单元、15个POE单元、16个POE单元、17个POE单元、18个POE单元、19个POE单元、20个POE单元、21个POE单元、22个POE单元、23个POE单元、24个POE单元、25个POE单元、26个POE单元、27个POE单元、28个POE单元、29个POE单元、30个POE单元或其组合。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯具有约20个POE单元。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯两者都具有约5至30个POE单元。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯两者都具有约20个POE单元。
在一些实施例中，各异山梨醇POE脂肪酸酯及各POE脂肪酸酯独立地具有独立地选自由任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基及任选地经取代的炔基组成的组的脂肪酸链。在一些实施例中，烷基是直链的。在一些实施例中，脂肪酸链是未经取代的C4-28烷基。在一些实施例中，脂肪酸链是经选自由以下项组成的组的取代基取代的C4-28烷基：酰基、羟基、环烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、氨基酰基、硝基、卤代、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基或杂环基。在一些实施例中，脂肪酸链是未经取代的C4-28烯基。在一些实施例中，烯基是直链或支链的。在一些实施例中，脂肪酸链具有一个或多个双键。在一些实施例中，各双键具有顺式构型。在一些实施例中，各双键具有反式构型。在一些实施例中，脂肪酸链是经选自由以下项组成的组的取代基取代的C4-28烯基：酰基、羟基、环烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、氨基酰基、硝基、卤代、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基或杂环基。
在一些实施例中，各异山梨醇POE脂肪酸酯独立地具有一、二、三或四个POE臂。在一些实施例中，各异山梨醇POE脂肪酸酯具有两个POE臂。
在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯具有以下式(I)的结构：
Figure BDA0003440584380000171
其中：
a和b独立地为2至28的整数，条件为a与b的和为5至30的整数；
R1和R2为独立地选自由氢及-C(O)R"组成的组，其中R"为任选地经取代的C3-27烷基或任选地经取代的C3-27烯基；且
R3和R4独立地为氢。
在式(I)的一些实施例中，a与b的和为约5至10、约10至15、约15至20、约20至25、约25至30或约15至30。在式(I)的一些实施例中，a与b的和为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一些实施例中，a与b的和为9。在一些实施例中，a与b的和为20。在式(I)的一些实施例中，R1和R2中的至少一个不是氢。在式(I)的一些实施例中，R1和R2两者都为-C(O)R"。在式(I)的一些实施例中，R"为任选地经取代的C3-27烷基。在式(I)的一些实施例中，R"为未经取代的C3-27烷基。在式(I)的一些实施例中，C3-27烷基是直链的。在式(I)的一些实施例中，C3-27烷基是支链的。在式(I)的一些实施例中，R"是为未经取代的C5烷基、C7烷基、C9烷基、C11烷基、C13烷基、C15烷基、C17烷基、C19烷基、C21烷基或C23烷基。在式(I)的一些实施例中，R"为未经取代的直链C11烷基。在式(I)的一些实施例中，R"为任选地经取代的C3-27烯基。在式(I)的一些实施例中，R"为未经取代的C3-27烯基。在式(I)的一些实施例中，C3-27烯基是直链的。在式(I)的一些实施例中，R"是为未经取代的C5烯基、C7烯基、C9烯基、C11烯基、C13烯基、C15烯基、C17烯基、C19烯基、C21烯基或C23烯基。在式(I)的一些实施例中，R"具有两个或更多个双键。在式(I)的一些实施例中，该两个或更多个双键具有顺式构型。在式(I)的一些实施例中，该两个或更多个双键具有反式构型。在式(I)的一些实施例中，R"具有一个双键，该双键具有顺式构型。在式(I)的一些实施例中，R"具有一个双键，该双键具有反式构型。在式(I)的一些实施例中，R"选自由以下项组成的组：-(CH2)7CH＝CH(CH2)3CH3、-(CH2)7CH＝CH(CH2)5CH3、-(CH2)4CH＝CH(CH2)8CH3、-(CH2)7CH＝CH(CH2)7CH3、-(CH2)9CH＝CH(CH2)5CH3、-(CH2)7CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)4CH3、-(CH2)7CH＝CHCH2CH＝CHCH2CH＝CHCH2CH3、-(CH2)3CH＝CHCH2CH＝CHCH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)4CH3及-(CH2)11CH＝CH(CH2)7CH3。在式(I)的一些实施例中，R"为-(CH2)7CH＝CH(CH2)7CH3且该双键具有顺式构型。在式(I)的一些实施例中，R"为-(CH2)7CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)4CH3且两个双键都具有顺式构型。在式(I)的一些实施例中，R"为-(CH2)7CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)4CH3且两个双键都具有反式构型。
在一些实施例中，至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少70％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少80％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少90％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少95％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。
在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯选自单酯、二酯、三酯、四酯及前述各物的组合。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯为单酯。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸单酯选自由以下项组成的组：异山梨醇POE单己酸酯、异山梨醇POE单辛酸酯、异山梨醇POE单癸酸酯、异山梨醇POE单月桂酸酯、异山梨醇POE单肉豆蔻酸酯、异山梨醇POE单棕榈酸酯、异山梨醇POE单棕榈油酸酯、异山梨醇POE单硬脂酸酯、异山梨醇POE单油酸酯、异山梨醇POE单亚麻油酸酯、异山梨醇POE单次亚麻油酸酯及前述各物的组合。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯是二酯。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸二酯是选自由以下项组成的组：异山梨醇POE二己酸酯、异山梨醇POE二辛酸酯、异山梨醇POE二癸酸酯、异山梨醇POE二月桂酸酯、异山梨醇POE二肉豆蔻酸酯、异山梨醇POE二棕榈酸酯、异山梨醇POE二棕榈油酸酯、异山梨醇POE二硬脂酸酯、异山梨醇POE二油酸酯、异山梨醇POE二亚麻油酸酯、异山梨醇POE二次亚麻油酸酯及前述各物的组合。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯是式(I)化合物。
在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯具有相同的脂肪酸链。在一些实施例中，异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯具有不同的脂肪酸链。在一些实施例中，POE脂肪酸酯选自由以下项组成的组：POE单己酸酯、POE单辛酸酯、POE单癸酸酯、POE单月桂酸酯、POE单肉豆蔻酸酯、POE单棕榈酸酯、POE单棕榈油酸酯、POE单硬脂酸酯、POE单油酸酯、POE单亚麻油酸酯、POE单次亚麻油酸酯、POE二己酸酯、POE二辛酸酯、POE二癸酸酯、POE二月桂酸酯、POE二肉豆蔻酸酯、POE二棕榈酸酯、POE二棕榈油酸酯、POE二硬脂酸酯、POE二油酸酯、POE二亚麻油酸酯、POE二次亚麻油酸酯及前述各物的组合。在一些实施例中，表面活性剂包含异山梨醇POE单月桂酸酯及POE单月桂酸酯。在一些实施例中，表面活性剂包含异山梨醇POE单棕榈酸酯及POE单棕榈酸酯。在一些实施例中，表面活性剂包含异山梨醇POE单肉豆蔻酸酯及POE单肉豆蔻酸酯。在一些实施例中，表面活性剂包含异山梨醇POE单油酸酯及POE单油酸酯。在一些实施例中，表面活性剂包含异山梨醇POE单亚麻油酸酯及POE单亚麻油酸酯。在一些实施例中，表面活性剂包含的异山梨醇POE脂肪酸酯的量大于POE脂肪酸酯的量。在一些实施例中，少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约7.5％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％、少于约0.75％、少于约0.5％或少于约0.1％(wt％)的表面活性剂为POE脂肪酸酯。
在一些实施例中，表面活性剂进一步包含失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，各失水山梨糖醇POE脂肪酸酯独立地具有约5至10个POE单元、约10至15个单元、约15至20个POE单元、约20至25个POE单元、约25至30个POE单位、约15至30个POE单元。在一些实施例中，各失水山梨糖醇POE脂肪酸酯独立地具有5个POE单元、6个POE单元、7个POE单元、8个POE单元、9个POE单元、10个POE单元、11个POE单元、12个POE单元、13个POE单元、14个POE单元、15个POE单元、16个POE单元、17个POE单元、18个POE单元、19个POE单元、20个POE单元、21个POE单元、22个POE单元、23个POE单元、24个POE单元、25个POE单元、26个POE单元、27个POE单元、28个POE单元、29个POE单元、30个POE单元或其组合。
在一些实施例中，各失水山梨糖醇POE脂肪酸酯独立地具有独立地选自由任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基及任选地经取代的炔基组成的组的脂肪酸链。在一些实施例中，烷基是直链的。在一些实施例中，脂肪酸链是未经取代的C4-28烷基。在一些实施例中，脂肪酸链是经选自由以下项组成的组的取代基取代的C4-28烷基：酰基、羟基、环烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、氨基酰基、硝基、卤代、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基或杂环基。在一些实施例中，脂肪酸链是未经取代的C4-28烯基。在一些实施例中，烯基是直链或支链的。在一些实施例中，脂肪酸链具有一个或多个双键。在一些实施例中，各双键具有顺式构型。在一些实施例中，各双键具有反式构型。在一些实施例中，脂肪酸链是经选自由以下项组成的组的取代基取代的C4-28烯基：酰基、羟基、环烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、氨基酰基、硝基、卤代、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基或杂环基。
在一些实施例中，各失水山梨糖醇POE脂肪酸酯独立地具有二、三或四个POE臂。在一些实施例中，各失水山梨糖醇POE脂肪酸酯具有四个POE臂。
在一些实施例中，失水山梨糖醇POE脂肪酸酯具有以下式(II)的结构：
Figure BDA0003440584380000211
其中：
w、z、y及x独立地为2至24的整数，条件为w、z、y及x的和为15至30的整数；
R5、R6、R7及R8为独立地选自由氢及-C(O)R’组成的组，其中R’为是任选地经取代的C3-27烷基或任选地经取代的C3-27烯基；且
R9为氢。
在式(II)的一些实施例中，w、z、y及x的和为约15至20、约20至25、约25至30或约15至30。在式(II)的一些实施例中，w、z、y及x的和为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在式(II)的一些实施例中，R5、R6、R7和R8中的至少一个不是氢。在式(II)的一些实施例中，R5、R6、R7及R8中至少两个不是氢。在式(II)的一些实施例中，R5、R6、R7及R8中的每一个都是-C(O)R'。在一些实施例中，R5、R6及R7是H，且R8是-C(O)R'。在一些实施例中，R5及R6是H，且R3及R4是-C(O)R'。在一些实施例中，R6是H，且R5、R7及R8是-C(O)R'。在式(II)的一些实施例中，R’是任选地经取代的C3-27烷基。在式(II)的一些实施例中，R’是未经取代的C3-27烷基。在式(II)的一些实施例中，C3-27烷基是直链的。在式(II)的一些实施例中，C3-27烷基是支链的。在式(II)的一些实施例中，R’是未经取代的C5烷基、C7烷基、C9烷基、C11烷基、C13烷基、C15烷基、C17烷基、C19烷基、C21烷基或C23烷基。在式(II)的一些实施例中，R’是未经取代的直链C11烷基。在式(II)的一些实施例中，R’是任选地经取代的C3-27烯基。在式(II)的一些实施例中，R’是未经取代的C3-27烯基。在式(II)的一些实施例中，C3-27烯基是直链的。在式(II)的一些实施例中，R’是未经取代的C5烯基、C7烯基、C9烯基、C11烯基、C13烯基、C15烯基、C17烯基、C19烯基、C21烯基或C23烯基。在式(II)的一些实施例中，R’具有两个或更多个双键。在式(II)的一些实施例中，两个或更多个双键具有顺式构型。在式(II)的一些实施例中，两个或更多个双键具有反式构型。在式(II)的一些实施例中，R’具有一个双键，双键具有顺式构型。在式(II)的一些实施例中，R’具有一个双键，双键具有反式构型。在式(II)的一些实施例中，R’是选自由以下项组成的组：-(CH2)7CH＝CH(CH2)3CH3、-(CH2)7CH＝CH(CH2)5CH3、-(CH2)4CH＝CH(CH2)8CH3、-(CH2)7CH＝CH(CH2)7CH3、-(CH2)9CH＝CH(CH2)5CH3、-(CH2)7CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)4CH3、-(CH2)7CH＝CHCH2CH＝CHCH2CH＝CHCH2CH3、-(CH2)3CH＝CHCH2CH＝CHCH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)4CH3及-(CH2)11CH＝CH(CH2)7CH3。在式(II)的一些实施例中，R’是-(CH2)7CH＝CH(CH2)7CH3且双键具有顺式构型。在式(II)的一些实施例中，R’是-(CH2)7CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)4CH3且两个双键都具有顺式构型。在式(II)的一些实施例中，R’是-(CH2)7CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)4CH3且两个双键都具有反式构型。
在一些实施例中，少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(wt％)的表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少1％(wt％)的表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少5％(wt％)的表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少10％(wt％)的表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少15％(wt％)的表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。
在一些实施例中，各失水山梨糖醇POE脂肪酸酯独立地是单酯、二酯、三酯或四酯。在一些实施例中，各失水山梨糖醇POE脂肪酸酯独立地选自由以下项组成的组：失水山梨糖醇POE单己酸酯、失水山梨糖醇POE单辛酸酯、失水山梨糖醇POE单癸酸酯、失水山梨糖醇POE单月桂酸酯、失水山梨糖醇POE单肉豆蔻酸酯、失水山梨糖醇POE单棕榈酸酯、失水山梨糖醇POE单棕榈油酸酯、失水山梨糖醇POE单硬脂酸酯、失水山梨糖醇POE单油酸酯、失水山梨糖醇POE单亚麻油酸酯、失水山梨糖醇POE单次亚麻油酸酯、失水山梨糖醇POE二己酸酯、失水山梨糖醇POE二辛酸酯、失水山梨糖醇POE二癸酸酯、失水山梨糖醇POE二月桂酸酯、失水山梨糖醇POE二肉豆蔻酸酯、失水山梨糖醇POE二棕榈酸酯、失水山梨糖醇POE二棕榈油酸酯、失水山梨糖醇POE二硬脂酸酯、失水山梨糖醇POE二油酸酯、失水山梨糖醇POE二亚麻油酸酯、失水山梨糖醇POE二次亚麻油酸酯、失水山梨糖醇POE三己酸酯、失水山梨糖醇POE三辛酸酯、失水山梨糖醇POE三癸酸酯、失水山梨糖醇POE三月桂酸酯、失水山梨糖醇POE三肉豆蔻酸酯、失水山梨糖醇POE三棕榈酸酯、失水山梨糖醇POE三棕榈油酸酯、失水山梨糖醇POE三硬脂酸酯、失水山梨糖醇POE三油酸酯、失水山梨糖醇POE三亚麻油酸酯及失水山梨糖醇POE三次亚麻油酸酯。在一些实施例中，失水山梨糖醇POE脂肪酸酯是式(II)化合物。
在另一方面，本文中所公开的表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)是大于约0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％或约0.1％(w:v)。在另一方面，表面活性剂的表面张力小于约20mN/m、约25mN/m、约30mN/m、约35mN/m、约40mN/m、约45mN/m、约50mN/m、约55mN/m或约60mN/m。
多肽
本文中的公开的内容涉及包含多肽及表面活性剂的液体制剂。在一些实施例中，本文中所述的液体制剂中的多肽是基本上纯的。在一些实施例中，本文中所述的液体制剂中的多肽是基本上均质的(即，不含污染蛋白质)。“基本纯”的多肽是指以组合物的总重量计包含至少约90重量％的多肽的组合物。在一些实施例中，多肽以组合物的总重量计占至少95重量％。“基本上均质”的多肽是指以组合物的总重量计包含至少约99重量％的多肽的组合物。
在一些实施例中，多肽是抗体。本文的抗体针对相关的“抗原”。在一些实施例中，抗原是生物学上重要的蛋白质，且向患有疾病或病症的哺乳动物施用抗体可在该哺乳动物中产生治疗益处。在一些实施例中，针对非蛋白质抗原(如肿瘤相关糖脂抗原；参见例如美国专利5,091,178)的抗体。当抗原是蛋白质时，其可为跨膜分子(例如受体)或配体，如生长因子。示例性抗原包括本文中所述的任何蛋白质。在一些实施例中，本公开包括的抗体的分子靶标包括CD多肽，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20及CD34；HER受体家族成员，如EGF受体(HER1)、HER2、HER3或HER4受体；介白素(Il)，例如IL-1至Il-10；细胞黏附分子，如LFA-1、Macl、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM及av/b3整合蛋白，包括其a或b次单元(例如，抗Cd11a、抗CD18或抗Cd11b抗体)；生长因子，如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；程序性死亡蛋白1(PD-1)；程序性死亡配体1(PD-L1)；多肽C等。任选与其他分子结合的可溶性抗原或其片段可用作免疫原以产生抗体。对于跨膜分子，如受体，可使用此等的片段(例如，受体的细胞外域)作为免疫原。替代性地，可使用表达跨膜分子的细胞作为免疫原。这种细胞可来源于天然来源(例如癌细胞系)，或可以是通过重组技术转型以表达跨膜分子的细胞。
在一些实施例中，抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人类抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体及异源结合抗体。在一些实施例中，抗体包括抗体片段及完整抗体。在一些实施例中，抗体片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段组成的组。
可使用本领域已知的方法来制备制剂中的多肽，如通过培养用含有编码多肽的核酸的载体转型或转染的细胞，或通过合成技术(例如重组技术及肽合成或这些技术的组合)来制备，或者可以从多肽的内源中分离。
A.蛋白质制备
通过重组方式制备蛋白质以便通过本发明的方法进行调配可通过用表达或克隆载体转染或转化合适的宿主细胞，进行转染或转型并且在适当时经调节的习知营养培养基中培养以诱导启动子、选择转型子或扩增编码所要序列的基因来实现。培养条件，如培养基、温度、pH及其类似培养条件，可由技术人员选择而无需过度实验。一般来说，使细胞培养物的生产力最大化的原理、方案及实用技术可见于以下文献中：Mammalian CellBiotechnology:A Practical Approach,M.Butler编(IRL Press,1991)；及Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Press。转染方法对本领域普通技术人员是已知的，且包括例如CaPO4及CaCl2转染、电穿孔、显微注射等。适合的技术也在Sambrook等人,的上述文献中有所描述。其他转染技术描述于以下文献中：Shaw等人,Gene23:315(1983)；WO 89/05859；Graham等人,Virology52:456-457(1978)；及美国专利4,399,216。
编码用于根据本发明方法调配的所需蛋白质的核酸插入至可复制载体中以进行克隆或表达。适合的载体是可公开获得的，且可采用质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体形式。可通过多种程序将合适的核酸序列插入载体中。一般来说，使用本领域已知的技术将DNA插入合适的限制性的内切核酸酶位点。载体组分通常包括但不限于信号序列、复制起点、一个或多个标记基因及增强子元件、启动子及转录终止序列中的一个或多个。含有这些组分中的一种或多种的合适载体的构建采用熟练技术人员已知的标准连接技术。
待调配的蛋白质形式可以从培养基或自宿主细胞裂解物中回收。如果与膜结合，可以使用适合的清洁剂或经由酶解使其从膜中释放出来。也可以通过各种物理或化学手段，如冻融循环、超声波处理、机械破坏或细胞溶解剂来破坏用于表达的细胞。
待调配的蛋白质的纯化可通过本领域已知的任何适合的技术来实现，例如，如离子交换色谱柱上分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化矽或阳离子交换树脂上层析(例如DEAE)、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、使用蛋白A琼脂糖凝胶柱(例如
Figure BDA0003440584380000261
G-75)进行凝胶过滤以去除污染物(如IgG)及用以结合抗原决定基标记形式的金属螯合色谱柱。
B.抗体制备
在本发明的某些实施例中，所选择的蛋白质为抗体。用于产生抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、双特异性抗体及异源结合抗体的技术如下。
1.多克隆抗体
一般通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原及佐剂在动物中产生多克隆抗体。其可用于结合相关抗原与在待免疫的物种中具免疫原性的蛋白质，例如匙孔锁蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。可采用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂及MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A、合成海藻糖二白喉菌酸酯)。免疫方案可由本领域技术人员选择而无需过度实验。
一个月后，利用含1/5至1/10原始量的肽或结合物的弗氏完全佐剂通过在多个部位皮下注射对动物进行加强免疫。7至14天后，对动物进行放血并且对血清进行抗体滴度分析。对动物进行加强免疫直至效价稳定。在一些实施例中，用相同抗原但结合至不同蛋白质及/或不同交联试剂的结合物对动物进行加强免疫。也可在重组细胞培养物中制备作为蛋白质融合物形式的结合物。如明矾的聚集剂也适用于增强免疫反应。
2.单克隆抗体。
单克隆抗体是从实质上均质的抗体群体，即，组成该群体的个别抗体除可能微量存在的可能的自然发生的突变外为一致的。因而，修饰词“单克隆”表明抗体的特征不是离散抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可使用首先由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)来制备的。
在杂交瘤方法中，如上文所述使小鼠或其他合适的宿主动物(如仓鼠)免疫以诱导产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。替代性地，可在活体外使淋巴细胞免疫。随后使用合适的融合剂，如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。
免疫制剂通常将包括待调配的蛋白质。一般来说，在需要人类来源的细胞时使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者在需要非人类哺乳动物来源时使用脾细胞或淋巴结细胞。随后使用适合的融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986),第59-103页。
永生化细胞系通常为转型哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。接种如此制备的杂交瘤细胞并且在任选含有一种或多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的适合培养基中生长。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤及胸苷(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT缺乏细胞的生长。
适合的永生化骨髓瘤细胞是那些有效融合、支持所选抗体产生细胞稳定高水平产生抗体且对如HAT培养基的培养基敏感的骨髓瘤细胞。在一些实施例中，骨髓瘤细胞系是鼠类骨髓瘤细胞系，如来源于可得自索尔克研究所细胞分布中心(Salk Institute CellDistribution Center)(San Diego，California USA)的MOPC-21及MPC-11小鼠肿瘤的细胞，以及可得自美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassus，Virginia USA)的SP-2细胞(及其衍生物，例如X63-Ag8-653)。也已描述用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤及小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞系(Kozbor,J.lmmunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
分析杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。在一些实施例中，通过免疫沉淀或通过活体外结合分析法，如放射免疫分析法(RIA)或酶联免疫吸附分析法(ELISA)来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
可以分析培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对所需抗原的单克隆抗体。在一些实施例中，通过免疫沉淀或通过活体外结合分析法，如放射免疫分析法(RIA)或酶联分析法(ELISA)来测定单克隆抗体的结合亲和力及特异性。这种技术及分析法在本领域为已知的。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定产生具有所要特异性、亲和力及/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可通过限制稀释程序对纯系进行次选殖且通过标准方法使其生长(Goding,同上)。用于此目的的适合培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，可使杂交瘤细胞在动物中活体内生长作为腹水肿瘤。
通过常规的免疫球蛋白纯化程序，例如，如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清中适当地分离由次纯系分泌的单克隆抗体。
也可通过重组DNA方法，如美国专利第4,816,567号中所描述及如以上所述的方法来产生单克隆抗体。可使用常规的程序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠类抗体重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)可以容易地分离编码单克隆抗体的DNA并进行定序。在一些实施例中，杂交瘤细胞用作这种DNA的来源。一旦分离，便可将DNA置于表达载体中，随后转染至宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或或骨髓瘤细胞，这些细胞不产生免疫球蛋白，以便在这种重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)及Pliickthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一实施例中，可自使用McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)所描述的技术产生的抗体噬菌体库分离抗体。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)及Marks等人,J.Mal.Biol.,222:581-597(1991)分别描述使用噬菌体库分离鼠类及人类抗体。后续出版物描述通过链改组(Marks等人,Bio/I'echnology,10:779-783(1992))，以及作为构建极大噬菌体库的策略的组合感染及活体内重组(Waterhouse等人,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993))来产生高亲和力(nM范围)人类抗体的方法。因此，这些技术为用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
也可通过例如用人类重链及轻链恒定域的编码序列代替同源鼠类序列(美国专利第4,816,567号；Morrison等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))或通过将非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列共价接合至免疫球蛋白编码序列来修饰DNA。通常，这种非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定域，或者其取代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生包含对一个抗原具有特异性的一个抗原结合位点及对不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点的嵌合二价抗体。
本文中所描述的单克隆抗体可以是单价的，其制备在本领域是众所周知的。例如，一种方法包括重组表达免疫球蛋白轻链及经修饰的重链。重链一般在Fc区中的任一点截短，以防止重链交联。替代性地，相关的半胱氨酸残基可经另一氨基酸残基取代或者删除以防止交联。活体外方法也适用于制备单价抗体。可使用本领域已知的常规技术来消化抗体以产生其片段，尤其是Fab片段。
也可使用合成蛋白质化学中已知的方法，包括涉及交联剂的方法在活体外制备嵌合或杂交抗体。例如，可使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的适合试剂的实例包括亚氨基硫醇盐及甲基-4-巯基丁酰亚氨酸盐。
3.人源化抗体。
本发明的抗体可进一步包含人源化或人类抗体。非人类(例如鼠类)抗体的人源化形式是含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原结合子序列)。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补性决定区(CDR)的残基替换为来自如小鼠、大鼠或兔的非人类物种且具有所要特异性、亲和力及容量的CDR(供体抗体)的残基。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架残基替换为相应非人类残基。人源化抗体也可包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或构架序列中的残基。一般而言，人源化抗体将包含实质上所有至少一个且通常两个可变域，其中所有或实质上所有CDR区都对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，且所有或实质上所有FR区都是人类免疫球蛋白一致序列的FR区。人源化抗体最好还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。Jones等人,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Opin.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
用于使非人类抗体人源化的方法在本领域是众所周知的。一般来说，人源化抗体具有一个或多个自非人类来源引入至其中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“导入”残基，其通常取自“导入”可变域。人源化可以基本上按照Winter及同事,Jones等人,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science239:1534-1536(1988)的方法，或通过将啮齿动物CDR或CDR序列取代为人类抗体的相应序列来进行。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中实质上小于完整人类可变域已由来自非人类物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是一些CDR残基以及可能的一些FR残基由来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人类抗体。
用于制备人源化抗体的人类可变域(轻链及重链两者)的选择对降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人类可变域序列的整个库筛检啮齿动物抗体的可变域序列。随后接受最接近啮齿动物序列的人类序列作为人源化抗体的人类框架(FR)。Sims等人,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mal.Biol.,196:901(1987)。另一方法使用来源于特定轻链或重链亚组的所有人类抗体的一致序列的特定构架。该相同框架可用于若干不同的人源化抗体。Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人,J.Immnol.,151:2623(1993)。
将抗体人源化并保留对抗原的高亲和力及其他有利生物学特性更重要。为实现这个目标，在一些实施例中，通过使用亲本序列及人源化序列的三维模型，分析亲本序列及各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型为常用的是本领域技术人员所熟知的。计算机程序可用于说明和显示选定候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可自受体和导入序列中选择FR残基并组合，从而达成所要抗体特征，如增加对靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。
考虑了人源化抗体的各种形式。例如，人源化抗体可以是抗体片段，如Fab，其任选地与一种或多种细胞毒性剂结合以产生免疫结合物。替代性地，人源化抗体可以是完整抗体，如完整IgG1抗体。
4.人类抗体。
作为人源化的替代方案，可产生人类抗体。例如，现有可能产生免疫后能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生人类抗体全库的转殖基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合及种系突变小鼠中抗体重链接合区(JH)基因的同型结合缺失完全抑制内源抗体产生。这种种系突变小鼠中的人类生殖系免疫球蛋白基因阵列转移将在抗原攻击后产生人类抗体。参见例如Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等人,Year in Immuno.,1:33(1993)；美国专利第5,591,669号及WO 97/17852。
替代性地，噬菌体展示技术可用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因库在活体外产生人类抗体及抗体片段。McCafferty等人,Nature348:552-553(1990)；Hoogenboom及Winter,J.Mal.Biol.227:381(1991)。根据此技术，将抗体V结构域基因框内克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因(如M13或fd)中，并作为功能抗体片段展示在噬菌体粒子的表面上。因为丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA复本，所以基于抗体的功能特性进行选择也选择编码展现彼等特性的抗体的基因。因而，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，参见例如Johnson,Kevin S.及Chiswell,DavidJ.,Curr.Opin Struct.Biol.3:564-571(1993)。V基因片段的几种来源可用于噬菌体展示。Clackson等人,Nature352:624-628(1991)自来源于免疫小鼠脾脏的V基因的小型随机组合库分离多种不同的抗恶唑酮抗体。可构建来自未免疫人类供体的V基因库，且可遵循Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等人,EMBO J.12:725-734(1993)所描述的技术基本上分离针对多种不同的抗原(包括自身抗原)的抗体。另参见美国专利第5,565,332号及第5,573,905号。
Cole等人及Boerner等人的技术也可用于制备人类单克隆抗体(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；及Boerner等人,J.Immunol.147(1):86-95(1991))。类似地，可通过将人类免疫球蛋白基因座引入内源免疫球蛋白基因已部分或完全不失活的转基因动物，例如小鼠中来制备人类抗体。攻击后观察到人类抗体产生，在所有方面都与人类中所见相似，包括基因重排、组装及抗体库。这种方法描述于例如美国专利第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号中以及以下科学出版物中：Marks等人,Bio/I'echnology10:779-783(1992)；Lenberg等人,Nature368:856-859(1994)；Morrison,Nature368:812-13(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology14:826(1996)；以及Lenberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
最后，也可由活化B细胞在活体外产生人类抗体(参见美国专利第5,567,610号及第5,229,275号)。
5.抗体片段
在某些情况下，使用抗体片段比使用完整抗体有优势。较小片段尺寸允许快速清除，且可导致实体瘤更容易接近。
已开发用于产生抗体片段的多种技术。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化而获得(参见例如Morimoto等人,J Biochem Biophys.Method.24:107-117(1992)；及Brennan等人,Science229:81(1985))。然而，现可由重组宿主细胞直接产生这些片段。Fab、Fv及scFv抗体片段都可以表达于大肠杆菌中且自其分泌，因而允许轻易产生大量这些片段。也可自以上所述的抗体噬菌体库中分离抗体片段。替代性地，可以直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并且化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人,Bio/Technology10:163-167(1992))。根据另一方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab')2片段。具有增加的活体内半衰期的Fab及F(ab')2描述在美国专利第5,869,046号中。在其他实施例中，所选抗体为单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利第5,571,894号及美国专利第5,587,458号。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，如美国专利5,641,870中所描述的。这种线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
6.双特异性及多特异性抗体。
双特异性抗体(BsAb)是对至少两个不同的抗原决定基，包括相同或另一蛋白质上的那些抗原决定基具有结合特异性的抗体。替代性地，一个臂可以结合至靶抗原，而另一臂可与结合至白血球上的触发分子，如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγR1(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)的臂组合，以便使细胞防御机制聚焦并定位至表达靶抗原的细胞。这种抗体可来源于全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)。
双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位于表达靶抗原的细胞。此种抗体具有结合所要抗原的一个臂及结合细胞毒性剂(例如皂甙元、抗干扰素-a、长春花碱、篦麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的另一臂。已知的双特异性抗体的实例包括抗ErbB2/抗FcgRIII(WO96/16673)、抗ErbB2/抗FcgRI(美国专利5,837,234)、抗ErbB2/抗CD3(美国专利5,821,337)。
用于制备双特异性抗体的方法在本领域是已知的。全长双特异性抗体的传统产生是基于共表达的两个免疫球蛋白重链-轻链配对，其中两个链具有不同的特异性。Millstein等人,Nature,305:537-539(1983)。由于免疫球蛋白重链及轻链的随机分类，这些杂交瘤(四源杂交瘤)可产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子纯化相当麻烦，且产物产率低。类似程序公开于WO 93/08829及Traunecker等人,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中。
根据不同的方法，使具有所需结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定域序列融合。在一些实施例中，与包含铰链、CH2及CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定域融合。在一些实施例中，含有轻链结合所必需位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一个融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合物及(如有需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入至个别表达载体中，并共转染至适合的宿主生物体中。在构建中所使用的三个多肽链的不相等比率提供最佳产率时，这为调节实施例中的三个多肽片段的相互比例方面提供了巨大灵活性。然而，当至少两个多肽链以相等比率表达导致高产量时或当比率不特别重要时，有可能在一个表达载体中插入两个或所有三个多肽链的编码序列。
在一些实施例中，双特异性抗体由一个臂中的具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链及另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已经发现，这种不对称结构有助于分离所要双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合，因为仅一半双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供容易的分离途径。这种方法公开于WO 94/04690中。关于产生双特异性抗体的更多细节，参见例如Suresh等人,Methods inEnzymology121:210(1986)。
根据WO 96/27011或美国专利5,731,168中所描述的另一种方法，可对成对抗体分子之间的界面进行工程化以使自重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。在一些实施例中，界面包含抗体恒定域的CH3区的至少一部分。在此方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链置换为较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)。通过将大氨基酸侧链替换为较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)在第二抗体分子的界面上产生与大侧链具有一致或类似大小的补偿性“空腔”。这提供了一种增高异二聚体产率超过其他不需要的最终产物(如同二聚体)的机制。
由抗体片段产生双特异性抗体的技术已描述于文献中。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等人,Science229:81(1985)描述其中完整抗体经蛋白水解切割以产生F(ab')2片段的程序。在二硫醇复合剂亚砷酸钠存在下还原这些片段，以稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫键形成。随后将所产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。随后将Fab'-TNB衍生物其中一种再转化为Fab'-TNB衍生物以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。
可直接从大肠杆菌回收Fab’片段并化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab')2分子的产生。各Fab’片段分别从大肠杆菌分泌，并且在活体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。因而形成的双特异性抗体能够结合至过度表现ErbB2受体的细胞及正常人类T细胞，以及触发人类细胞毒性淋巴细胞对人类乳腺肿瘤靶标的溶解活性。
还描述了用于直接从重组细胞培养物制备并分离二价抗体片段的各种技术。例如，已使用亮氨酸拉链产生二价异二聚体。Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos及Jun蛋白的白氨酸拉链肽连接到两种不同抗体的Fab’部分。将抗体同型二聚体在铰链区还原以形成单体，随后再氧化以形成抗体异二聚体。Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)所描述的“双功能抗体”技术提供用于制备双特异性/二价抗体片段的替代机制。这些片段包含通过因过短而不允许同一链上的两个结构域之间发生配对的连接子连接至轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)。因此，促使一个片段的VH及VL结构域与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(scFv)二聚体产生双特异性/二价抗体片段的另一策略。参见Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994)。
虑了具有两个以上效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)。
示例性双特异性抗体可结合至给定分子上的两个不同的抗原决定基。替代性地，抗蛋白质臂可与结合至白血球上的触发分子，如IgG的T细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)或Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)的臂组合，以便将细胞防御机制聚焦至表达特定蛋白质的细胞。双特异性抗体也可用于将细胞毒剂定位于表达特定蛋白质的细胞。这种抗体具有蛋白质结合臂及结合细胞毒性剂或放射性核种螯合剂，如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。另一相关双特异性抗体结合相关蛋白质，并进一步结合组织因子(TF)。
制剂
本文提供了包含多肽及表面活性剂的液体制剂。本文中所述的任何表面活性剂都可用于该液体制剂中。在一些实施例中，液体制剂中的表面活性剂的浓度为该液体制剂的约0.0005％至0.2％、约0.0005％至0.001％、约0.001％至0.002％、约0.002％至0.003％、约0.003％至0.004％、约0.004％至0.005％、约0.005％至0.006％、约0.006％至0.007％、约0.007％至0.008％、约0.008％至0.009％、约0.009％至0.01％、约0.01％至0.015％、约0.015％至0.02％、约0.02％至0.025％、约0.025％至0.03％、约0.03％至0.035％、约0.035％至0.04％、约0.04％至0.045％、约0.045％至0.05％、约0.05％至0.055％、约0.055％至0.06％、约0.06％至0.065％、约0.065％至0.07％、约0.07％至0.075％、约0.075％至0.08％、约0.08％至0.085％、约0.085％至0.09％、约0.09％至0.095％、约0.095％至0.1％、约0.1％至0.11％、约0.11％至0.12％、约0.12％至0.13％、约0.13％至0.14％、约0.14％至0.15％、约0.15％至0.16％、约0.16％至0.17％、约0.17％至0.18％、约0.18％至0.19％、约0.19％至0.2％、约0.0005％至0.01％、约0.01％至0.02％、约0.02％至0.03％、约0.03％至0.04％、约0.04％至0.05％、约0.05％至0.06％、约0.06％至0.07％、约0.07％至0.08％、约0.08％至0.09％、约0.09％至0.1％、约0.1％至0.12％、约0.12％至0.14％、约0.14％至0.16％、约0.16％至0.18％、约0.18％至0.2％或约0.0005％至0.02％(w:v)。
在一些实施例中，液体制剂中的异山梨醇POE脂肪酸酯的浓度为液体制剂的约0.00035％至0.2％、约0.00035％至0.0005％、约0.0005％至0.001％、约0.001％至0.002％、约0.002％至0.003％、约0.003％至0.004％、约0.004％至0.005％、约0.005％至0.006％、约0.006％至0.007％、约0.007％至0.008％、约0.008％至0.009％、约0.009％至0.01％、约0.01％至0.015％、约0.015％至0.02％、约0.02％至0.025％、约0.025％至0.03％、约0.03％至0.035％、约0.035％至0.04％、约0.04％至0.045％、约0.045％至0.05％、约0.05％至0.055％、约0.055％至0.06％、约0.06％至0.065％、约0.065％至0.07％、约0.07％至0.075％、约0.075％至0.08％、约0.08％至0.085％、约0.085％至0.09％、约0.09％至0.095％、约0.095％至0.1％、约0.1％至0.11％、约0.11％至0.12％、约0.12％至0.13％、约0.13％至0.14％、约0.14％至0.15％、约0.15％至0.16％、约0.16％至0.17％、约0.17％至0.18％、约0.18％至0.19％、约0.19％至0.2％、约0.00035％至0.01％、约0.01％至0.02％、约0.02％至0.03％、约0.03％至0.04％、约0.04％至0.05％、约0.05％至0.06％、约0.06％至0.07％、约0.07％至0.08％、约0.08％至0.09％、约0.09％至0.1％、约0.1％至0.12％、约0.12％至0.14％、约0.14％至0.16％、约0.16％至0.18％、约0.18％至0.2％或约0.00035％至0.14％(w:v)。
液体制剂中的多肽的浓度可基于储存容器构型及所需施用途径(例如皮下、肌内或玻璃体内施用、静脉内注射或输注等)而变化。在一些实施例中，液体制剂中的多肽的浓度为约0.1mg/mL至300mg/mL、约0.1mg/mL至0.5mg/mL、约0.5mg/mL至1mg/mL、约1mg/mL至1.5mg/mL、约1.5mg/mL至2mg/mL、约2mg/mL至2.5mg/mL、约2.5mg/mL至3mg/mL、约3mg/mL至3.5mg/mL、约3.5mg/mL至4mg/mL、约4mg/mL至4.5mg/mL、约4.5mg/mL至5mg/mL、约0.1mg/mL至1mg/mL、约1mg/mL至2mg/mL、约2mg/mL至3mg/mL、约3mg/mL至4mg/mL、约4mg/mL至5mg/mL、约5mg/mL至10mg/mL、约10mg/mL至15mg/mL、约15mg/mL至20mg/mL、约20mg/mL至30mg/mL、约30mg/mL至40mg/mL、约40mg/mL至50mg/mL、约50mg/mL至100mg/mL、约100mg/mL至150mg/mL、约150mg/mL至200mg/mL、约200mg/mL至250mg/mL、约250mg/mL至300mg/mL、约0.1mg/mL至2mg/mL、约0.5mg/mL至2mg/mL、约50mg/mL至150mg/mL、约150mg/mL至200mg/mL或200mg/mL至300mg/mL。在一些实施例中，液体制剂中的多肽的浓度为约0.5mg/mL。在一些实施例中，液体制剂中的多肽的浓度大于约50mg/mL、大于约150mg/mL、大于约200mg/mL、大于约250mg/mL或大于约300mg/mL。在一些实施例中，可稀释液体制剂以使多肽浓度降低约1-5倍、约5-10倍、约10-15倍、约15-20倍、约20-30倍、约30-40倍、约40-50倍、约50-100倍、约100-150倍、约150-200倍、约200-300倍、约300-400倍、约400-500倍、约500-600倍、约600-700倍、约700-800倍、约800-900倍、约900-1000倍、约1000-1500倍、约1500-2000倍、约2000-2500倍、约2500-3000倍或约3000-5000倍。
在一些实施例中，用输注溶液稀释液体制剂。在一些实施例中，输注溶液包括但不限于含葡萄糖的溶液、乳酸化林格氏溶液(Ringer’s solution)、生理盐水、半生理盐水或缓冲生理盐水。在一些实施例中，生理盐水是生理盐水(约0.9％(w:v))。在一些实施例中，生理盐水是等渗生理盐水。在一些实施例中，生理盐水是缓冲生理盐水，包括但不限于磷酸盐缓冲生理盐水或克雷伯氏-林格氏溶液(Krebs-Ringer’s solution)。在一些实施例中，生理盐水与来自受试者的血液的渗透压等渗或近似等渗。生理盐水包括盐，如氯化钠、氯化钾、氯化镁或氯化钙。在一些实施例中，生理盐水包括一种或多种缓冲液，如磷酸盐缓冲液(如磷酸钠或磷酸钾)、碳酸钠或HEPES。当使用缓冲生理盐水时，pH保持在使该多肽的治疗效果最佳化的范围内，特别是当其稳定性依赖于pH时。
A.冻干制剂
在一些实施例中，本文中所述的液体制剂也可制备成复溶的冻干制剂。可将本文中所描述的多肽冻干，随后复溶以产生液体制剂。在一些实施例中，在如以上所描述制备相关蛋白质之后，产生“预冻干制剂”。在一些实施例中，复溶的制剂中的多肽浓度高于预冻干制剂中的多肽浓度。在一些实施例中，复溶的制剂中的多肽浓度低于预冻干制剂中的多肽浓度。考虑所要剂量体积、施用方式等来确定预冻干液体制剂及复溶的液体制剂中存在的多肽浓度。
1.冻干制剂的制备。
当制备冻干制剂时，待调配的蛋白质一般存在于溶液中。例如，在本发明的升高离子强度降低黏度制剂中，蛋白质可存在于pH为约4-8且优选为约5-7的pH缓冲溶液中。缓冲液浓度可为约1mM至约20mM，或者约3mM至约15mM，这取决于例如缓冲液及制剂(例如复溶的制剂)的所需张力。示例性缓冲液及/或盐为药用的，且可由合适的酸、碱及其盐产生，如“药用的”酸、碱或缓冲液下所定义者。
在一些实施例中，向预冻干制剂中添加冻干保护剂。预冻干制剂中的冻干保护剂的量一般使得复溶后所得制剂将为等渗的。然而，高渗复溶的制剂也可以是合适的。另外，冻干保护剂的量不能过低而使得冻干后出现不可接受的量的蛋白质降解/聚集。然而，预冻干制剂中的示例性冻干保护剂浓度为约10mM至约400mM，或者约30mM至约300mM，或者约50mM至约100mM。示例性冻干保护剂包括糖及糖醇，如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇及甘露醇。然而，在特定情况下，某些冻干保护剂也可能导致增加制剂的黏度。因而，应注意选择最小化或中和这种作用的特定冻干保护剂。上文在“冻干保护剂”的定义下描述的其他冻干保护剂在本文中也称为“药用的糖”。
蛋白质与冻干保护剂的比率可针对各特定蛋白质或抗体及冻干保护剂组合而变化。在以抗体作为所选蛋白质且以糖(例如蔗糖或海藻糖)作为冻干保护剂以产生具有高蛋白质浓度的等渗复溶的制剂的情况下，冻干保护剂与抗体的莫耳比可为约100至约1500莫耳冻干保护剂对1莫耳抗体，或约200至约1000莫耳冻干保护剂对1莫耳抗体，例如约200至约600莫耳冻干保护剂对1莫耳抗体。
本文中的制剂也可在所治疗的特定适应症必需时含有超过一种蛋白质，如具有不会不利地影响其他蛋白质的互补活性的蛋白质。例如，可能需要在单一制剂中提供两种或更多种结合至所要靶标(例如受体或抗原)的抗体。此种蛋白质以对预定目的有效的量适当地存在于组合中。
用于活体内施用的制剂必须为无菌的。此可在冻干及复溶前后通过经无菌过滤膜过滤容易地实现。替代性地，整个混合物的无菌性可通过例如在约120℃下将除蛋白质以外的成分高压釜处理约30分钟来实现。
在蛋白质、可选冻干保护剂及其他可选组分混合在一起之后，将制剂冻干。许多不同的冷冻干燥机可用于此目的，如Hull50TM(Hull，USA)或GT20TM(Leybold-Heraeus，Germany)冷冻干燥机。冷冻干燥是通过将制剂冷冻且随后在适合初步干燥的温度下使冰自冷冻成分升华来实现。在此条件下，产物温度低于制剂的共熔点或塌陷温度。在通常在约50至250毫托的范围内的适合压力下，初步干燥的货架温度通常将在约-30至25℃的范围内(条件为产物在初步干燥期间保持冷冻)。制剂、容纳样品的容器(例如玻璃小瓶)的大小及类型以及液体的体积将主要指示干燥所需的时间，该时间可在数小时至数天(例如40-60小时)的范围内。任选地，也可根据产物中的所需残余水分水平进行二次干燥阶段。进行二次干燥的温度在约0-40℃的范围内，主要取决于容器的类型及大小以及所采用的蛋白质的类型。例如，贯穿冻干的整个除水阶段的货架温度可为约15-30℃(例如约20℃)。二次干燥所需的时间及压力将是产生例如温度及其他参数适合冻干饼的时间和压力。二次干燥时间由产物中的所要残余水分水平决定，且通常需要至少约5小时(例如10-15小时)。压力可与初步干燥步骤中所采用的压力相同。冷冻干燥条件可以根据制剂及小瓶大小而变化。
2.冻干制剂的复溶。
在向患者施用之前，使用药用稀释剂将冻干制剂复溶，使得复溶的制剂中的蛋白质浓度为至少约50mg/mL，例如约50mg/mL至约400mg/mL、或者约80mg/mL至约300mg/mL、或者约90mg/mL至约150mg/mL。如果希望皮下递送复溶的制剂，复溶的制剂中的这种高蛋白质浓度被视为特别有用。然而，对于其他施用途径，如静脉内施用，可能需要复溶的制剂中的蛋白质浓度较低(例如复溶的制剂中的约0.1-2mg/mL、约2-10mg/mL、或约10-50mg/mL的蛋白质)。在某些实施例中，复溶的制剂中的蛋白质浓度显著高于预冻干制剂中的蛋白质浓度。在某些实施例中，复溶的制剂中的蛋白质浓度显著低于预冻干制剂中的蛋白质浓度。
复溶一般在约25℃的温度进行以确保完全水合，但需要时可采用其他温度。复溶所需的时间将取决于例如稀释剂的类型、赋形剂的量及蛋白质。示例性稀释剂包括无菌水、无菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲生理盐水)、无菌生理盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。稀释剂任选地含有防腐剂。以上已描述示例性防腐剂，其中芳族醇，如苯甲醇或酚醇为优选的防腐剂。通过针对不同的防腐剂浓度评估与蛋白质的相容性及防腐效果测试，确定防腐剂的用量。例如，如果防腐剂为芳族醇(例如苯甲醇)，则其可以以约0.1-2.0％、或约0.5-1.5％、或约1.0-1.2％的量存在。
在一些实施例中，液体制剂(包括但不限于复溶的液体制剂)实质上不含聚集体。在一些实施例中，液体制剂(包括但不限于复溶的液体制剂)包含较低游离脂肪酸颗粒形成。
III.制备液体制剂的方法
本文中还提供了用于制备液体制剂的方法，包括将多肽及表面活性剂添加入水溶液中，其中该表面活性剂包含一种或多种聚山梨醇酯组分。
在一些实施例中，表面活性剂包含异山梨醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，表面活性剂进一步包含POE脂肪酸酯。在一些实施例中，等异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯独立地具有约5至30个POE单元。在一些实施例中，等异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯独立地具有独立地选自由任选地经取代的C4-28烷基及任选地经取代的C4-28烯基组成的组的脂肪酸链。在一些实施例中，等异山梨醇POE脂肪酸酯是式(I)化合物。在一些实施例中，至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％(wt％)的表面活性剂为异山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些实施例中，等异山梨醇POE脂肪酸酯系选自由以下项组成的组：异山梨醇POE单己酸酯、异山梨醇POE单辛酸酯、异山梨醇POE单癸酸酯、异山梨醇POE单月桂酸酯、异山梨醇POE单肉豆蔻酸酯、异山梨醇POE单棕榈酸酯、异山梨醇POE单棕榈油酸酯、异山梨醇POE单硬脂酸酯、异山梨醇POE单油酸酯、异山梨醇POE单亚麻油酸酯、异山梨醇POE单次亚麻油酸酯及前述各物的组合。在一些实施例中，这些POE脂肪酸酯是选自由以下项组成的组：POE单己酸酯、POE单辛酸酯、POE单癸酸酯、POE单月桂酸酯、POE单肉豆蔻酸酯、POE单棕榈酸酯、POE单棕榈油酸酯、POE单硬脂酸酯、POE单油酸酯、POE单亚麻油酸酯、POE单次亚麻油酸酯及前述各物的组合。在一些实施例中，表面活性剂包含异山梨醇POE单月桂酸酯及POE单月桂酸酯。在一些实施例中，表面活性剂包含异山梨醇POE单棕榈酸酯及POE单棕榈酸酯。在一些实施例中，表面活性剂包含异山梨醇POE单肉豆蔻酸酯及POE单肉豆蔻酸酯。在一些实施例中，表面活性剂包含异山梨醇POE单油酸酯及POE单油酸酯。在一些实施例中，表面活性剂包含异山梨醇POE单亚麻油酸酯及POE单亚麻油酸酯。
在一些实施例中，表面活性剂进一步包含失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，这些失水山梨糖醇POE脂肪酸酯独立地具有独立地选自由任选地经取代的C4-28烷基及任选地经取代的C4-28烯基组成的组的脂肪酸链。在一些实施例中，这些失水山梨糖醇POE脂肪酸酯是式(II)化合物。在一些实施例中，少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(wt％)的该表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少1％(wt％)的表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少5％(wt％)的表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少10％(wt％)的表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。在一些实施例中，至少15％(wt％)的表面活性剂为失水山梨糖醇POE脂肪酸酯。
在一些实施例中，各失水山梨糖醇POE脂肪酸酯独立地选自由以下项组成的组：失水山梨糖醇POE单己酸酯、失水山梨糖醇POE单辛酸酯、失水山梨糖醇POE单癸酸酯、失水山梨糖醇POE单月桂酸酯、失水山梨糖醇POE单肉豆蔻酸酯、失水山梨糖醇POE单棕榈酸酯、失水山梨糖醇POE单棕榈油酸酯、失水山梨糖醇POE单硬脂酸酯、失水山梨糖醇POE单油酸酯、失水山梨糖醇POE单亚麻油酸酯、失水山梨糖醇POE单次亚麻油酸酯、失水山梨糖醇POE二己酸酯、失水山梨糖醇POE二辛酸酯、失水山梨糖醇POE二癸酸酯、失水山梨糖醇POE二月桂酸酯、失水山梨糖醇POE二肉豆蔻酸酯、失水山梨糖醇POE二棕榈酸酯、失水山梨糖醇POE二棕榈油酸酯、失水山梨糖醇POE二硬脂酸酯、失水山梨糖醇POE二油酸酯、失水山梨糖醇POE二亚麻油酸酯、失水山梨糖醇POE二次亚麻油酸酯、失水山梨糖醇POE三己酸酯、失水山梨糖醇POE三辛酸酯、失水山梨糖醇POE三癸酸酯、失水山梨糖醇POE三月桂酸酯、失水山梨糖醇POE三肉豆蔻酸酯、失水山梨糖醇POE三棕榈酸酯、失水山梨糖醇POE三棕榈油酸酯、失水山梨糖醇POE三硬脂酸酯、失水山梨糖醇POE三油酸酯、失水山梨糖醇POE三亚麻油酸酯及失水山梨糖醇POE三次亚麻油酸酯。
本文中所描述的任何表面活性剂得可用于制备液体制剂的方法中。
在一些实施例中，液体制剂中烦人表面活性剂的浓度为该液体制剂的约0.0005％至0.2％、约0.0005％至0.001％、约0.001％至0.002％、约0.002％至0.003％、约0.003％至0.004％、约0.004％至0.005％、约0.005％至0.006％、约0.006％至0.007％、约0.007％至0.008％、约0.008％至0.009％、约0.009％至0.01％、约0.01％至0.015％、约0.015％至0.02％、约0.02％至0.025％、约0.025％至0.03％、约0.03％至0.035％、约0.035％至0.04％、约0.04％至0.045％、约0.045％至0.05％、约0.05％至0.055％、约0.055％至0.06％、约0.06％至0.065％、约0.065％至0.07％、约0.07％至0.075％、约0.075％至0.08％、约0.08％至0.085％、约0.085％至0.09％、约0.09％至0.095％、约0.095％至0.1％、约0.1％至0.11％、约0.11％至0.12％、约0.12％至0.13％、约0.13％至0.14％、约0.14％至0.15％、约0.15％至0.16％、约0.16％至0.17％、约0.17％至0.18％、约0.18％至0.19％、约0.19％至0.2％、约0.0005％至0.01％、约0.01％至0.02％、约0.02％至0.03％、约0.03％至0.04％、约0.04％至0.05％、约0.05％至0.06％、约0.06％至0.07％、约0.07％至0.08％、约0.08％至0.09％、约0.09％至0.1％、约0.1％至0.12％、约0.12％至0.14％、约0.14％至0.16％、约0.16％至0.18％、约0.18％至0.2％或约0.0005％至0.02％(w:v)。
液体制剂中的多肽的浓度可基于储存配置及所要施用途径(例如皮下、肌肉内或玻璃体内施用、静脉内注射或输注等)而变化。在一些实施例中，液体制剂中的多肽的浓度为约0.1mg/mL至300mg/mL、约0.1mg/mL至0.5mg/mL、约0.5mg/mL至1mg/mL、约1mg/mL至1.5mg/mL、约1.5mg/mL至2mg/mL、约2mg/mL至2.5mg/mL、约2.5mg/mL至3mg/mL、约3mg/mL至3.5mg/mL、约3.5mg/mL至4mg/mL、约4mg/mL至4.5mg/mL、约4.5mg/mL至5mg/mL、约0.1mg/mL至1mg/mL、约1mg/mL至2mg/mL、约2mg/mL至3mg/mL、约3mg/mL至4mg/mL、约4mg/mL至5mg/mL、约5mg/mL至10mg/mL、约10mg/mL至15mg/mL、约15mg/mL至20mg/mL、约20mg/mL至30mg/mL、约30mg/mL至40mg/mL、约40mg/mL至50mg/mL、约50mg/mL至100mg/mL、约100mg/mL至150mg/mL、约150mg/mL至200mg/mL、约200mg/mL至250mg/mL、约250mg/mL至300mg/mL、约0.1mg/mL至2mg/mL、约0.5mg/mL至2mg/mL、约50mg/mL至150mg、约150mg/mL至200mg/mL或200mg/mL至300mg/mL。在一些实施例中，液体制剂中的多肽的浓度为约0.5mg/mL。在一些实施例中，液体制剂中的多肽的浓度大于约50mg/mL、大于约150mg/mL、大于约200mg/mL、大于约250mg/mL或大于约300mg/mL。
在一些实施例中，该方法进一步包括稀释该液体制剂以使多肽浓度降低约1-5倍、约5-10倍、约10-15倍、约15-20倍、约20-30倍、约30-40倍、约40-50倍、约50-100倍、约100-150倍、约150-200倍、约200-300倍、约300-400倍、约400-500倍、约500-600倍、约600-700倍、约700-800倍、约800-900倍、约900-1000倍、约1000-1500倍、约1500-2000倍、约2000-2500倍、约2500-3000倍或约3000-5000倍。在一些实施例中，该方法进一步包括用输注溶液稀释该液体制剂。在一些实施例中，输注溶液包括但不限于含葡萄糖的溶液、乳酸化林格氏溶液、生理盐水、或缓冲生理盐水。在一些实施例中，生理盐水是生理盐水(约0.9％(w:v))。在一些实施例中，生理盐水是等渗生理盐水。在一些实施例中，生理盐水为缓冲生理盐水，包括但不限于磷酸盐缓冲生理盐水或克雷伯氏-林格氏溶液。在一些实施例中，生理盐水与来自受试者的血液的渗透压等渗或近似等渗。生理盐水包括盐，如氯化钠、氯化钾、氯化镁或氯化钙。在一些实施例中，生理盐水包括一种或多种缓冲液，如磷酸盐缓冲液(如磷酸钠或磷酸钾)、碳酸钠或HEPES。当使用缓冲生理盐水时，pH保持在使多肽的治疗效果最优化的范围内，尤其在其稳定性依赖于pH时。在一些实施例中，在受试者施用之前稀释该液体制剂。
当通过复溶的冻干制剂来制备该液体制剂时，复溶一般在约25℃的温度下进行以确保完全水合，但需要时可采用其他温度。复溶所需的时间将取决于例如稀释剂的类型、赋形剂的量及多肽。示例性稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲生理盐水)、无菌生理盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。稀释剂任选含有防腐剂。
在一些实施例中，该方法中所使用的多肽为抗体。在一些实施例中，该抗体为多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人类抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体或异源结合抗体。在一些实施例中，抗体包括抗体片段及完整抗体。在一些实施例中，抗体片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段组成的组。
在另一方面，这种方法可用于制备本文中所描述的任何液体制剂。
IV.制品
本文中提供包括封装液体制剂的容器的制品，其中该液体制剂包含多肽及表面活性剂，其中该表面活性剂包含一种或多种聚山梨醇酯组分。
制品包括容器。合适的容器包括但不限于瓶、小瓶(例如双室小瓶)、注射器(例如单室或双室注射器)、试管及静脉内治疗(IV)袋。在一些实施例中，IV袋包括输注溶液。在一些实施例中，输注溶液包括但不限于含葡萄糖的溶液、乳酸林格氏溶液、生理盐水、或缓冲生理盐水。容器可由多种材料形成，如玻璃、金属合金(例如不锈钢)或塑胶。处于容纳液体制剂的容器上或与之相关联的标签可指示复溶及/或使用指南。在一些实施例中，标签可进一步指示制剂可用于或将用于皮下施用。在一些实施例中，标签可进一步指示制剂可用于或将用于静脉内施用(例如作为药团或通过在一段时间内连续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊液内、皮下、关节内、滑膜内、或鞘内施用)。在一些实施例中，标签可进一步指示该制剂可用于或将用于玻璃体内施用。容纳制剂的容器可为多次使用小瓶，其允许重复施用(例如2-6次施用)液体制剂。在一些实施例中，制品包含浓度为约0.1mg/mL至约300mg/mL的多肽。制品可进一步包括第二容器，该第二容器包含合适的稀释剂(例如水、调配缓冲液、表面活性剂溶液及输注溶液，如含葡萄糖的溶液、生理盐水、乳酸林格氏溶液及BWFI)。在将稀释剂与该液体制剂混合后，经稀释的制剂中的最终蛋白质浓度一般将为至少0.001mg/mL。在一些实施例中，将稀释剂与冻干制剂混合以形成复溶的液体制剂。在一些实施例中，液体制剂(包括该复溶的液体制剂)中的最终蛋白质浓度为约0.5mg/mL至约2mg/mL。制品可进一步包括自商业及使用者观点看来合乎需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器及带有使用说明书的包装插页。在一些实施例中，制品含有用于静脉内施用的注射器或设备，及/或用于制备冻干组合物以供施用的无菌缓冲溶液。
在另一方面，制品可含有本文中所述的任何液体制剂。在另一方面，制品可含有根据本文中所描述的任何制备方法制备的液体制剂。
V.使用液体制剂的药物及治疗方法
本文中还提供了用于治疗受试者的疾病或病症的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本文中所描述的液体制剂。本文中还提供本文中所描述的液体制剂在制备用于治疗需要用液体制剂中的多肽治疗的患者的药物中的用途。还提供了如本文中所描述的液体制剂以用于治疗需要用该液体制剂中的多肽治疗的受试者的疾病或病症。还提供了如本文中所描述的液体制剂以用于治疗患者，包括向该患者施用有效量的该液体制剂。
在制剂中的抗体结合至HER2时，可使用悬浮液制剂治疗癌症。该癌症一般将包含表达HER2的细胞，使得本文中的HER2抗体能够结合至癌细胞。因而，本发明在此实施例中是关于一种用于治疗受试者的表达HER2的癌症的方法，该方法包括以对治疗癌症有效的量向该受试者施用HER2抗体药物制剂。本文用HER2抗体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)或帕妥珠单抗(pertuzumab))治疗的示例性癌症为HER2阳性乳腺癌或胃癌。
在制剂中的抗体结合至B细胞表面标记物(如CD20)时，该制剂可用于治疗B细胞恶性肿瘤，如NHL或CLL，或者自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎或血管炎)。
在制剂中的抗体结合VEGF(例如贝伐珠单抗(bevacizumab))时，该制剂可用于抑制血管生成、治疗癌症(如结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCL)、胶质母细胞瘤、乳腺癌和肾细胞癌)，或治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)或黄斑水肿。
在适应症为癌症时，可用悬浮液制剂与化疗剂的组合治疗患者。组合施用包括使用单独制剂或单一药物制剂共同施用或同时施用，以及以任一顺序连续施用，其中有两种(或所有)活性剂同时发挥其生物活性的时间段。因而，化疗剂可在施用组合物之前或之后施用。在此实施例中，至少一次施用化疗剂与至少一次施用制剂之间的时间为约1个月或更短，或者约2周或更短。替代性地，将化疗剂及制剂于单一制剂或单独制剂中同时施用患者。
用悬浮液制剂治疗将改良疾病或病症的病征或症状。此外，用化疗剂及抗体制剂的组合治疗可对患者产生协同或超过加和治疗益处。
在一些实施例中，经静脉内施用本文中所描述的液体制剂。在一些实施例中，本文中所描述的液体制剂是通过静脉内注射以受控施用速率施用，使得施用发生至少约30分钟或更久。给药方案及实际施用剂量可取决于如感染性质及严重程度、患者的年龄、体重及总体健康状况以及将治疗的疾病或病症的因素而变化，并且将可由健康专业人员确定。一次性或在一系列治疗中将液体制剂适当地施用到受试者。视疾病的类型及严重程度而定，约1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体为施用患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或是多次单独施用。抗体的剂量一般将为约0.05mg/kg至约10mg/kg。如果施用化疗剂，则其通常以已知剂量施用，或者由于药物的组合作用或可归因于化疗剂的负面副作用而任选地降低。
实例
提供以下实例是为了说明而不是限制本发明。本领域技术人员将认识到，可以使用本领域普通技术人员已知的方法修改以下程序。
材料
单克隆抗体A至D是由基因泰克公司(South San Francisco，CA，USA)制造。含有约99％月桂酸酯的聚山梨醇酯20是由BASF SE(Ludwigshafen，Germany)合成。聚山梨醇酯80HX2超纯级(含有约98％油酸酯)是由NOF America公司(Irvine，CA)合成。所有聚山梨醇酯样品在不使用时都在氮气覆盖下在2-8℃储存。乙腈及甲醇(HPLC级)是购自AvantorPerformance Materials公司(Phillipsburg，NJ)。
实例1聚山梨醇酯分级及分析
聚山梨醇酯分级
使用Gilson PLC-2050制备型HPLC系统进行聚山梨醇酯(PS)分级。对于所有PS样品，将2克聚山梨醇酯20(PS20)或聚山梨醇酯80(PS80)溶解于8mL>18MΩ·cm水中，并注入到Waters X-Bridge BEH C4色谱柱(30×100mm)上。随后使用>18MΩ·cm水(流动相A)及乙腈(流动相B)的梯度对样品进行分级。梯度条件为：0.0-3.0分钟，5％B；3.0-20.0分钟，5-100％B；20.0-27.0分钟，100％B；27-27.1分钟，100-5％B；27.1-30.0分钟，5％B。流速为40mL/min，总运行时间为30分钟。在整个运行过程中收集25mL级分。随后使用如后续部分中所述的逆相超高效液相层析方法与带电荷气溶胶检测(RP-UHPLC-CAD)分析这些级分。分析后，合并这些级分并使用旋转蒸发仪干燥。
聚山梨醇酯级分纯度分析
使用配备有Thermo Corona Ultra CAD检测器的Waters Acquity UPLC H-Class系统评估分级PS样品的合并及纯度。所使用的色谱柱为Waters Acquity BEH C8色谱柱(2.1×50mm，
Figure BDA0003440584380000471
2.5μm粒径)。梯度如下：0.0-0.5分钟，5％B；0.5-5.0分钟，5-100％B；5.0-6.0分钟，100％B；6.0-6.1分钟，100-5％B；6.1-8.0分钟，5％B。执行CAD，以10Hz收集数据并且雾化器温度为30℃。
结果
通过旋转蒸发仪纯化并干燥PS20和PS80级分。如通过RP-UHPLC-CAD测定的其相对纯度如表1所示。从各PS类型纯化并分析三种级分。对于PS20，这些级分是：POE-失水山梨糖醇单月桂酸酯(“级分1或F1a”)、POE-异山梨醇单月桂酸酯及POE单月桂酸酯(N～10)(“级分2或F2a”)及POE-失水山梨糖醇二月桂酸酯(“级分3或F3a”)。对于PS80，这些级分是：POE-失水山梨糖醇单油酸酯(“级分1或F1b”)、POE-异山梨醇单油酸酯及POE单油酸酯(N～10)(“级分2或F2b”)及POE-失水山梨糖醇二油酸酯(“级分3或F3b”)。通过LC-MS分析证实各级分的鉴定。反相UHPLC-CAD分析证实最具疏水性的聚山梨醇酯级分为F3，继而为F2，随后为疏水性最低的F1(图1A及图1B)。
表1
Figure BDA0003440584380000481
*NT：未测定
实例2临界胶束浓度(CMC)的测定
使用荧光染料N-苯基萘-1-胺(NPN)评估纯化的PS级分的临界胶束浓度(CMC)。通过2倍系列稀释成包含0.15M氯化钠、0.05M TRIS、5％ACN、5μM N-苯基-1-萘基胺及15ppmBrij35(pH 8.0)的稀释剂来进行此分析。立即在Molecular Devices Spectramax M5荧光读板仪中分析样品，在350nm激发且在420nm发射。
对于PS20，CMC增加顺序为F3a>F2a>F1a，与疏水性顺序一致。CMC相差较大，其中F1a为约0.1wt％，F2a为约0.015wt％，且F3a为约0.001wt％，对应于自基线变化约500个荧光单元(图2A)。相比之下，尽管PS80酯CMC具有类似排序，但值范围窄得多，仅跨越0.001至0.003wt％(图2B)。
实例3分级PS样品的表面活性
使用Krüss(Hamburg，Germany)K100力张力计，使用粗糙铂Wilhemy板测定经纯化的PS级分的表面活性。在室温(20-25℃)下在>70％相对湿度下量测样品以防止蒸发。测试前将经纯化的PS20级分各自溶解在0.2mg/mL的纯化水中。将三毫升样品置放在样品容器中，尤其注意不得引入气泡。量测各样品的表面张力变化直至60分钟时达到平衡，每秒量测一次。PS80分析遵循相同程序。
表面张力结果显示，平衡时，在相同浓度(0.02wt％)下，PS20 F3a及F2a级分在降低表面张力方面比较低疏水性F1a级分明显更有效(图3A)。对于PS80 F1b至F3b级分也有类似趋势(图3B)。令人感兴趣的是，PS20级分F3a的表面张力与F2a大致相同，而PS80级分F3b的表面张力同样与F2b类似。此外，含有所有酯级分的未分级PS20使表面张力降低的程度甚至超过F3a或F2a级分(图3A)。相比之下，未分级PS80显示介于其F1b与F3b级分之间的表面张力(图3B)。
实例4微胞大小的动态光散射
在Malvern(Westborough，MA)Zetasizer Nano仪器上进行动态光散射(DLS)。通过在水中将各级分样品稀释至最终浓度10mg/mL进行量测，以便各级分都高于CMC。
使用动态光散射(DLS)并使用1wt％级分浓度获得微胞半径或流体动力学半径(Rh)，其远高于所研究的所有酯级分的CMC。对于PS20，未分级PS20的Rh为约4nm，且F2a及F3a级分为约3.9nm。F1a单酯的Rh稍小，为约3.5nm(图4A)。对于PS80，未分级PS80样品的微胞大小(Rh约4.8nm)同样比Rh类似(约4.5nm)的F2b及F3b级分稍大。在PS80样品组中，如同F1a，F1b的Rh最小，但Rh(约4.3nm)相差不大(图4B)。
实例5搅拌保护研究
通过使用搅拌研究来测试经纯化的级分防止表面诱导性聚集的能力。在10mLPETG小瓶中，在含不同量的各PS20级分(F1a、F2a及F3a为0.0001％至0.01％，w:v)的0.9％生理盐水中将mAb A稀释至0.5mg/mL。在环境温度下在轨道振荡器上以180RPM将此等小瓶搅拌2小时。搅拌后，使用Bosch APK系统在10倍放大倍率及旋转下观察样品。
在搅拌研究期间，观察到F2a需要最低浓度以防止搅拌时形成可见颗粒，而F1a需要最高浓度。F3a及所有月桂酸酯PS20产生类似的结果(图5)。尽管F2a相对于F3a及所有月桂酸酯PS20具有较高CMC及相当平衡表面张力影响，但其最能保护mAb免受搅拌应力及颗粒形成影响。
实例6 IV袋搅拌模型研究
通过使用搅拌研究来测试经纯化的级分防止表面诱导性聚集的能力。在5mL PETG小瓶中，在含不同量的各Ps20级分(F1a、F2a及F3a为0.0001％至0.01％，w/v)的0.9％生理盐水中用缓冲液将mAb B及mAb C稀释至0.5mg/mL。在环境温度下在轨道振荡器上以180RPM将样品搅拌2小时。搅拌后，使用Bosch APK系统在10倍放大倍率及旋转下观察样品。还对样品进行HIAC(高精确度流体颗粒计数)以便对制剂中的SVP(亚可见颗粒)进行定量，并且进行SEC-HPLC(粒径排阻高效液相层析法)以便对制剂中的HMWF(高分子量级分)及活性抗体浓度进行定量。在具有二元泵及二极体阵列检测器的Agilent 1260HPLC上进行SEC及IEC。在来自Royco的HIAC 9703+医药粒子计数器上进行亚可见颗粒测量。
观察结果表明所有测试级分都保护mAb B(图6A)和mAb C(图6B)。mAb B(图7A)和mAb C(图7B)的HIAC结果显示所有级分都能够减少亚可见颗粒的数目，指示较低聚集水平。F2a在降低聚集水平方面与HP或所有月桂酸酯PS20同样良好或更好。SEC-HPLC分析结果显示所有级分都降低HMWF％(图8A和图8B)且在搅拌期间更好地保留mAb B(图8A和图9A)及mAb C(图8B和图9B)两者的抗体制剂的可溶性级分(图9A和图9B)。F2a在较低表面活性剂浓度下尤其有效(图8A、图8B、图9A和图9B)。所有表面活性剂都成功缓解蛋白质降解。
实例7稳定性研究
测试含蛋白质mAb C及mAb D(各自为30mg/mL)的PS20及F2a制剂(各自为0.02％w/v)的制剂长期稳定性。将制剂储存在5℃、25℃及40℃下，并且在不同的间隔进行目视检查(APK)、HIAC和SEC-HPLC。并在5℃、25℃及40℃下对PS20和F2a制剂进行IEC。
储存在40℃下的制剂的目视检查指示在40℃下多达一个月时，两种表面活性剂在限制mAb C(图10A)和mAb D(图10B)两者的制剂中的颗粒形成方面都是有效的。
储存在40℃下的制剂的HIAC结果显示在40℃下，即使在储存多达一个月时，两种表面活性剂在限制mAb C(图11A)和mAb D(图11B)两者的制剂中的亚可见颗粒形成方面都是有效的。
储存在40℃下的制剂的SEC-HPLC结果显示两种表面活性剂在限制mAb C(图12A)和mAb D(图12B)两者的制剂中的聚集方面都是有效的。SEC结果也显示在40℃下多达一个月时，两种表面活性剂在维持mAb C(图13A)和mAb D(图13B)两者的制剂中的活性抗体浓度方面都是有效的。
储存在40℃下的制剂的IEC数据显示两种表面活性剂都限制mAb C降解，效果与在40℃下一个月时类似(图14)。
储存在25℃下的制剂的目视检查数据显示两种表面活性剂在限制mAb C(图15A)和mAb D(图15B)制剂中的聚集方面都是有效的，多达3个月。
储存在25℃下的制剂的HIAC结果显示在25℃下，即使在储存多达3个月时，两种表面活性剂在限制mAb C(图16A)和mAb D(图16B)两者的制剂中的亚可见颗粒形成方面都是有效的。
储存在25℃下的制剂的SEC-HPLC结果显示两种表面活性剂在限制mAb C(图17A)和mAb D(图17B)两者的制剂中的聚集方面都是有效的。SEC结果也显示在25℃下多达3个月时，两种表面活性剂在维持mAb C(图18A)和mAb D(图18B)两者的制剂中的活性抗体浓度方面都是有效的。
储存在25℃下的制剂的IEC数据显示两种表面活性剂都限制mAb C降解，效果与在25℃下3个月时类似(图19)。
储存在5℃下的制剂的目视检查数据显示两种表面活性剂在防止mAb C(图20A)和mAb D(图20B)制剂中的聚集方面都是有效的，多达3个月。
储存在5℃下的制剂的HIAC结果显示在5℃下，即使在储存多达3个月时，两种表面活性剂在限制mAb C(图21A)和mAb D(图21B)两者的制剂中的亚可见颗粒形成方面都是有效的。
储存在5℃下的制剂的SEC-HPLC结果显示两种表面活性剂在限制mAb C(图22A)和mAb D(图22B)两者的制剂中的聚集方面都是有效的。SEC结果也显示在5℃下多达3个月时，两种表面活性剂在维持mAb C(图23A)和mAb D(图23B)两者的制剂中的活性抗体浓度方面都是有效的。
储存在5℃下的制剂的IEC数据表现出两种表面活性剂都限制mAb C降解，效果与在5℃下3个月时类似(图24)。
实例8强制降解研究
通过2.5U/mL浓度的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶(PCL)对PS20和F2a(各自处于pH＝6.0制剂缓冲液中)进行强制降解。对所得混合物进行HIAC，以便对亚可见颗粒及完整表面活性剂百分比进行定量。结果显示尽管酶降解程度更大，但F2a产生较少SVP(图25)。
总结
已证明F2a与常用表面活性剂赋形剂PS20相比更能保护生物医药产物。此表面活性剂具有诸多有吸引力的特性，由此可使其成为传统聚山梨醇酯(如PS20和PS80)的良好替代物。
在搅拌应力研究中，发现当使用APK进行测试时，F2a更能保护mAb A免受颗粒形成影响。在一单独研究中，基于通过APK进行的颗粒测试、通过HIAC获得的亚可见颗粒计、通过SEC-HPLC获得的HMWF％以及如通过SEC-HPLC测试的可溶性抗体浓度，F2a显示F2a与HPPS20之间对mAb B及mAb C的搅拌应力保护类似。
在稳定性研究中，观察到F2a与HP PS20在防止两种mAb(mAb C及mAb D)的颗粒形成(通过APK及HIAC)方面类似地有效。就在5℃、25℃和40℃下储存期间防止mAb C及mAb D两者的HMWF(通过SEC-HPLC)而言，F2a也具有与HP PS20类似的保护作用。
在强制降解研究中，研究表面在形成亚可见及可见脂肪酸颗粒之前，F2a的酶降解程度可能超过HP PS20。这为F2a作为表面活性剂提供了优势，F2a不太容易形成这种类型的脂肪酸相关颗粒。

Claims (82)

1.一种液体制剂，其包含多肽和表面活性剂，其中所述表面活性剂的至少约70％(wt％)为异山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯。
2.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯包含约5至30个POE单元。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的液体制剂，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯包含约20个POE单元。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的液体制剂，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯包含选自由任选地经取代的C4-28烷基和任选地经取代的C4-28烯基组成的组的脂肪酸链。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的液体制剂，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯为单酯。
6.根据权利要求5所述的液体制剂，其中所述单酯选自由异山梨醇POE单月桂酸酯、异山梨醇POE单肉豆蔻酸酯、异山梨醇POE单棕榈酸酯、异山梨醇POE单硬脂酸酯和异山梨醇POE单油酸酯组成的组。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的液体制剂，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯为单酯、二酯或前述各者的混合物。
8.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯为式(I)化合物：
Figure FDA0003440584370000011
其中：
a和b独立地为2至28的整数，前体是a与b的和为5至30的整数；R1和R2独立地选自由氢和-C(O)R"组成的组，其中R"为任选地经取代的C3-27烷基或任选地经取代的C3-27烯基；且
R3和R4独立地为氢。
9.根据权利要求8所述的液体制剂，其中a与b的和为9。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的液体制剂，其中R1为H且R2为-C(O)R"。
11.根据权利要求8或权利要求9所述的液体制剂，其中R1为-C(O)R"且R2为H。
12.根据权利要求8或权利要求9所述的液体制剂，其中R1和R2两者都为-C(O)R"。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的液体制剂，其中R"为未经取代的C3-27烷基。
14.根据权利要求13所述的液体制剂，其中R"为未经取代的C11烷基。
15.根据权利要求8至12中任一项所述的液体制剂，其中R"为未经取代的C3-27烯基。
16.根据权利要求15所述的液体制剂，其中R"为未经取代的C17烯基。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的液体制剂，其中所述表面活性剂的至少约80％(wt％)为异山梨醇POE脂肪酸酯。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的液体制剂，其中所述表面活性剂进一步包含POE脂肪酸酯。
19.根据权利要求18所述的液体制剂，其中所述表面活性剂包含的异山梨醇POE脂肪酸酯的量大于POE脂肪酸酯的量。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的液体制剂，其中所述POE脂肪酸酯包含选自由任选地经取代的C4-28烷基和任选地经取代的C4-28烯基组成的组的脂肪酸链。
21.根据权利要求20所述的液体制剂，其中所述POE脂肪酸酯选自由POE单月桂酸酯、POE单肉豆蔻酸酯、POE单棕榈酸酯、POE单硬脂酸酯和POE单油酸酯组成的组。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的液体制剂，其中所述表面活性剂的少于约20％(wt％)为POE脂肪酸酯。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的液体制剂，其中所述表面活性剂占所述液体制剂的约0.0005％至0.2％(w:v)。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的液体制剂，其中所述表面活性剂进一步包含失水山梨醇POE脂肪酸酯。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的液体制剂，其中所述多肽为蛋白质。
26.根据权利要求25所述的液体制剂，其中所述蛋白质为抗体。
27.根据权利要求26所述的液体制剂，其中所述抗体选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体和抗体片段组成的组。
28.根据权利要求27所述的液体制剂，其中所述抗体片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段组成的组。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的液体制剂，其中所述抗体浓度为约0.1mg/mL至约300mg/mL。
30.根据权利要求29所述的液体制剂，其中所述抗体浓度为约100mg/mL至约300mg/mL。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的液体制剂，其中所述液体制剂为重构的冻干制剂。
32.根据权利要求29或权利要求30所述的液体制剂，其中所述液体制剂用输注溶液进一步稀释至约0.001mg/mL至约0.5mg/mL的多肽浓度。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的液体制剂，其中所述液体制剂基本上不含聚集体。
34.根据权利要求1至32中任一项所述的液体制剂，其中所述液体制剂包含较少的游离脂肪酸颗粒形成物。
35.根据权利要求18至34中任一项所述的液体制剂，其中所述表面活性剂的至少约80％(wt％)为异山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯和POE脂肪酸酯。
36.根据权利要求18至35中任一项所述的液体制剂，其中所述表面活性剂的至少约90％(wt％)为异山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯和POE脂肪酸酯。
37.一种冻干制剂，其包含多肽和表面活性剂，其中所述表面活性剂的至少约70％(wt％)为异山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯和POE脂肪酸酯；且其中所述冻干制剂为通过冻干根据权利要求18至36中任一项所述的液体制剂而制备的。
38.一种制品，其包括封装根据权利要求1至36中任一项所述的液体制剂的容器。
39.根据权利要求38所述的制品，其中所述容器为IV袋。
40.根据权利要求39所述的制品，其中所述IV袋包括注射装置。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的制品，其中所述IV袋包括输注溶液。
42.根据权利要求38所述的制品，其中所述容器为小瓶或预填充注射器
43.根据权利要求38所述的制品，其进一步包括封装稀释剂的第二容器。
44.一种制品，其包括封装根据权利要求37所述的冻干制剂的容器。
45.根据权利要求44所述的制品，其进一步包括封装稀释剂的第二容器。
46.一种制备液体制剂的方法，其包括将多肽和表面活性剂添加至水溶液，其中所述表面活性剂的至少70％(wt％)为异山梨醇POE脂肪酸酯。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯包含约5至30个POE单元。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯包含约20个POE单元。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯包含选自由任选地经取代的C4-28烷基和任选地经取代的C4-28烯基组成的组的脂肪酸链。
50.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯为单酯。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述单酯选自由异山梨醇POE单月桂酸酯、异山梨醇POE单肉豆蔻酸酯、异山梨醇POE单棕榈酸酯、异山梨醇POE单硬脂酸酯和异山梨醇POE单油酸酯组成的组。
52.根据权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯为单酯、二酯或前述各者的混合物。
53.根据权利要求46所述的方法，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯为式(I)化合物：
Figure FDA0003440584370000051
其中：
a和b独立地为2至28的整数，前体是a与b的和为5至30的整数；
R1和R2独立地选自由氢和-C(O)R"组成的组，其中R"为任选地经取代的C3-27烷基或任选地经取代的C3-27烯基；且
R3和R4独立地为氢。
54.根据权利要求53所述的方法，其中a与b的和为9。
55.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中R1为H且R2为-C(O)R"。
56.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中R2为-C(O)R"且R1为H。
57.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中R1和R2两者都为-C(O)R"。
58.根据权利要求53至57中任一项所述的方法，其中R"为未经取代的C3-27烷基。
59.根据权利要求56所述的方法，其中R"为未经取代的C11烷基。
60.根据权利要求53至57中任一项所述的方法，其中R"为未经取代的C3-27烯基。
61.根据权利要求60所述的方法，其中R"为未经取代的C17烯基。
62.根据权利要求46至61中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂进一步包含POE脂肪酸酯。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述表面活性剂的至少约80％(wt％)为异山梨醇POE脂肪酸酯和POE脂肪酸酯。
64.根据权利要求62或权利要求63所述的方法，其中所述表面活性剂的至少约90％(wt％)为异山梨醇POE脂肪酸酯和POE脂肪酸酯。
65.根据权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂包含的异山梨醇POE脂肪酸酯的量大于POE脂肪酸酯的量。
66.根据权利要求62至65中任一项所述的方法，其中所述POE脂肪酸酯包含选自由任选地经取代的C4-28烷基和任选地经取代的C4-28烯基组成的组的脂肪酸链。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述POE脂肪酸酯选自由POE单月桂酸酯、POE单肉豆蔻酸酯、POE单棕榈酸酯、POE单硬脂酸酯和POE单油酸酯组成的组。
68.根据权利要求62至67中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂的少于约20％(wt％)为POE脂肪酸酯。
69.根据权利要求46至68中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂进一步包含失水山梨醇POE脂肪酸酯。
70.根据权利要求46至69中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂占所述液体制剂的约0.0005％至0.2％(w:v)。
71.根据权利要求46至70中任一项所述的方法，其中所述多肽为蛋白质。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述蛋白质为抗体。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述抗体选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体和抗体片段组成的组。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述抗体片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段组成的组。
75.根据权利要求72至74中任一项所述的方法，其中所述抗体浓度为约0.1mg/mL至约300mg/mL。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述抗体浓度为约100mg/mL至约300mg/mL。
77.根据权利要求75或权利要求76所述的方法，其中所述液体制剂用输注溶液进一步稀释至约0.1mg/mL至约2mg/mL的浓度。
78.根据权利要求46至77中任一项所述的方法，其进一步包括将所述液体制剂冻干以制备冻干制剂。
79.根据权利要求46至78中任一项所述的方法，其中所述液体制剂基本上不含聚集体。
80.根据权利要求46至78中任一项所述的方法，其中所述液体制剂包含较少的游离脂肪酸颗粒形成物。
81.根据权利要求1至4中任一项所述的液体制剂，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯为异山梨醇POE单月桂酸酯。
82.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述异山梨醇POE脂肪酸酯为异山梨醇POE单月桂酸酯。
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