TW202114641A - 用於穩定液體蛋白質調配物之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含多肽及表面活性劑之液體調配物。特定言之，其揭示一種包含多肽及表面活性劑之液體調配物，其中至少約70% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯。本發明亦提供製造此種液體調配物之方法、包含此種液體調配物之製品以及用此種液體調配物治療患者之方法。

Description

用於穩定液體蛋白質調配物之組合物及方法
本發明大體上係關於包含多肽及表面活性劑之穩定液體醫藥調配物及其製造方法。
聚山梨醇酯(PS)為生物藥用蛋白質調配物中之常用表面活性劑，已對多個降解途徑顯示敏感性，包括：化學水解、氧化及酶促水解。PS降解會導致產生多種過氧化物，該等過氧化物隨後在長期儲存過程中使蛋白質中之胺基酸殘基(例如甲硫胺酸)氧化。Levine等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1996) 93, 15036-15040。此等胺基酸殘基之氧化可能對蛋白質之生物活性具有負面影響，從而限制PS在蛋白質調配物中之保護作用。另外，由於聚山梨醇酯為異質混合物，故降解模式在不同的途徑之間可能顯著不同。因此，在藥用蛋白質調配物之開發中仍然需要更有效之賦形劑用於表面活性劑。
本發明提供一種包含多肽及表面活性劑之液體調配物，其中至少約70% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯包含約5至30個POE單元。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯包含約20個POE單元。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯包含選自由視情況經取代之C4-28 烷基及視情況經取代之C4-28 烯基組成之群的脂肪酸鏈。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯為單酯、二酯或前述各物之混合物。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯係選自由異山梨醇POE單月桂酸酯、異山梨醇POE單肉荳蔻酸酯、異山梨醇POE單棕櫚酸酯、異山梨醇POE單硬脂酸酯及異山梨醇POE單油酸酯組成之群。
在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯為式(I)化合物：
Figure 02_image001
(I)； 其中： a及b獨立地為2至28之整數，條件為a與b之和為5至30之整數； R1 及R2 係獨立地選自由氫及-C(O)R"組成之群，其中R"為視情況經取代之C3-27 烷基或視情況經取代之C3-27 烯基；且 R3 及R4 獨立地為氫。
在一些實施例中，a與b之和為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些實施例中，a與b之和為9。在一些實施例中，a與b之和為20。在一些實施例中，R1 為H且R2 為-C(O)R"。在一些實施例中，R2 為H且R1 為-C(O)R"。在一些實施例中，R1 及R2 二者皆為-C(O)R"。在一些實施例中，R"為未經取代之C3-27 烷基。在一些實施例中，R"為未經取代之C11 烷基。在一些實施例中，R"為未經取代之C3-27 烯基。在一些實施例中，R"為未經取代之C17 烯基。
在一些實施例中，該表面活性劑進一步包含POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少約80% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少約85%、至少約90%或至少約95% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少約90% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該POE脂肪酸酯包含選自由視情況經取代之C4-28 烷基及視情況經取代之C4-28 烯基組成之群的脂肪酸鏈。在一些實施例中，該POE脂肪酸酯係選自由POE單月桂酸酯、POE單肉荳蔻酸酯、POE單棕櫚酸酯、POE單硬脂酸酯及POE單油酸酯組成之群。在一些實施例中，少於約20%之該表面活性劑為POE脂肪酸酯。在一些實施例中，少於約10%之該表面活性劑為POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑佔該液體調配物之約0.0005%至0.2% (w:v)。在一些實施例中，該表面活性劑包含之異山梨醇POE脂肪酸酯之量大於POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑進一步包含去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，少於約10%、少於約8%、少於約5%、少於約3%或少於約1%之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。
在一些實施例中，該多肽為蛋白質。在一些實施例中，該蛋白質為選自由多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體及抗體片段組成之群的抗體。在一些實施例中，該抗體片段係選自由Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段組成之群。在一些實施例中，該抗體濃度為約0.001 mg/mL至約300 mg/mL。在一些實施例中，該液體調配物為復原之凍乾調配物。在一些實施例中，該液體調配物用輸注溶液進一步稀釋至約0.001 mg/mL至約100 mg/mL之濃度。在一些實施例中，該液體調配物實質上不含聚集物。在一些實施例中，該液體調配物包含較少游離脂肪酸粒子形成。
本文中亦提供一種製品，其包括封裝本文中所描述之任何液體調配物的容器。在一些實施例中，該容器為IV袋。在一些實施例中，該IV袋包括注射裝置。在一些實施例中，該IV袋包括輸注溶液。本文中亦提供一種包含多肽及表面活性劑之凍乾調配物，其中至少約70% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該凍乾調配物係藉由將本文中所揭示之任何液體調配物凍乾來製備。
本文中亦提供一種製造液體調配物之方法，其包括將多肽及表面活性劑添加至水溶液中，其中至少70% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯包含約5至30個POE單元。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯包含約20個POE單元。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯包含選自由視情況經取代之C4-28 烷基及視情況經取代之C4-28 烯基組成之群的脂肪酸鏈。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯為單酯、二酯或前述各物之混合物。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯係選自由異山梨醇POE單月桂酸酯、異山梨醇POE單肉荳蔻酸酯、異山梨醇POE單棕櫚酸酯、異山梨醇POE單硬脂酸酯及異山梨醇POE單油酸酯組成之群。
在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯為式(I)化合物：
Figure 02_image003
(I)； 其中： a及b獨立地為2至28之整數，條件為a與b之和為5至30之整數； R1 及R2 係獨立地選自由氫及-C(O)R"組成之群，其中R"為視情況經取代之C3-27 烷基或視情況經取代之C3-27 烯基；且 R3 及R4 獨立地為氫。
在一些實施例中，a與b之和為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些實施例中，a與b之和為9。在一些實施例中，a與b之和為20。在一些實施例中，R1 為H且R2 為-C(O)R"。在一些實施例中，R2 為H且R1 為-C(O)R"。在一些實施例中，R1 及R2 二者皆為-C(O)R"。在一些實施例中，R"為未經取代之C3-27 烷基。在一些實施例中，R"為未經取代之C11 烷基。在一些實施例中，R"為未經取代之C3-27 烯基。在一些實施例中，R"為未經取代之C17 烯基。
在一些實施例中，該表面活性劑進一步包含POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少約80% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少約85%、至少約90%或至少約95% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該方法進一步包括添加POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該POE脂肪酸酯包含選自由視情況經取代之C4-28 烷基及視情況經取代之C4-28 烯基組成之群的脂肪酸鏈。在一些實施例中，該POE脂肪酸酯係選自由POE單月桂酸酯、POE單肉荳蔻酸酯、POE單棕櫚酸酯、POE單硬脂酸酯及POE單油酸酯組成之群。在一些實施例中，少於約20%之該表面活性劑為POE脂肪酸酯。在一些實施例中，少於約10%之該表面活性劑為POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑佔該液體調配物之約0.0005%至0.2% (w:v)。在一些實施例中，該表面活性劑包含之異山梨醇POE脂肪酸酯之量大於POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑進一步包含去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，少於約10%、少於約8%、少於約5%、少於約3%或少於約1%之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。
在一些實施例中，該多肽為蛋白質。在一些實施例中，該蛋白質為選自由多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體及抗體片段組成之群的抗體。在一些實施例中，該抗體片段係選自由Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段組成之群。在一些實施例中，該抗體濃度為約0.1 mg/mL至約300 mg/mL。在一些實施例中，該液體調配物為復原之凍乾調配物。在一些實施例中，該液體調配物用輸注溶液進一步稀釋至約0.1 mg/mL至約2 mg/mL之濃度。在一些實施例中，該液體調配物經進一步凍乾以製備凍乾調配物。在一些實施例中，該液體調配物實質上不含聚集物。在一些實施例中，該液體調配物包含較少游離脂肪酸粒子形成。
應理解，本文中所描述之各個實施例之一種、一些或所有特性可組合以形成本發明之其他實施例。本發明之此等及其他態樣對熟習此項技術者將顯而易知。藉由以下詳細描述進一步描述本發明之此等及其他實施例。
相關申請案之交互參照
本申請案主張2019年6月28日申請之美國臨時申請案第62/868,615號之優先權權益，該案係以引用之方式整體併入本文中。
本發明係基於發現聚山梨醇酯之特定級分在藥用蛋白質調配物中提供強保護作用。特定言之，其允許使用較少表面活性劑達成相同保護效果，從而將由聚山梨醇酯降解所致之對蛋白質生物活性之負面影響降至最小。在一個態樣中，本發明提供一種蛋白質調配物，其包含一或多種此種聚山梨醇酯級分。本文中所描述之蛋白質調配物已顯示增加之調配物中蛋白質穩定性。本說明書亦提供用於製造蛋白質調配物之套組及方法。I. 定義
除非另外定義，否則本文中使用之所有技術及科學術語皆具有與本發明所屬領域之普通熟習此項技術者通常所理解相同的含義。本文中引用之所有專利、申請案、公開申請案及其他出版物皆以引用之方式整體併入本文中。若此部分中所示之定義與以引用之方式併入本文中之專利、申請案或其他出版物中所示之定義相反或者不一致，則此部分中所示之定義優先於以引用之方式併入本文中之定義。
應理解，為清楚起見而描述於單獨實施例之內容中的某些本發明特徵亦可組合提供於單一實施例中。相反，為簡要起見而描述於單一實施例之內容中的各種本發明特徵亦可單獨或以任何適合之子組合形式提供。關於特定方法步骤、试剂或条件之实施例的所有组合明確涵蓋在本發明中且揭示於本文中，如同逐一地且明确地揭示各个及每个组合。
如本文中及所附申请专利范围中所使用，除非上下文另外清楚指出，否则单数形式「一 」及「该 」包括复数参考物。
本文中提及「約 」某一值或參數包括(並描述)針對該值或參數本身之變化。举例而言，提及「约 X 」之描述包括对「X 」之描述。
術語「醫藥調配物 」係指呈允許活性成分之生物活性有效且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受之毒性的其他組分的形式的制剂。在一些實施例中，該等調配物為無菌的。
「復原 」調配物為藉由將凍乾之蛋白質或抗體調配物溶解於稀釋劑中以使蛋白質分散在復原調配物中而製備之調配物。復原調配物適合於投與(例如，非經腸投與)至欲用相關蛋白質治療之患者，且在本發明之某些實施例中可為適合經皮下投與之調配物。
術語「蛋白質 」、「多肽 」及「肽 」在本文中用於指任何長度之胺基酸聚合物。聚合物可為線性或分支的，其可包含經修飾之胺基酸，且其可間雜非胺基酸。該等術語亦涵蓋天然或藉由乾預，例如二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙酰化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記組分結合而經修飾之胺基酸聚合物。通常，用於本文中之蛋白質將具有至少約5至20 kD、或者至少約15至20 kD、或至少約20 kD之分子量。該定義內亦包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知的其他修飾的蛋白質。本文中之定義內所涵蓋之蛋白質的實例包括哺乳動物蛋白質，諸如腎素；生長激素，包括人類生長激素及牛生長激素；生長激素釋放因子；副甲狀腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；前胰島素；濾泡刺激素；降血鈣素；黃體成長激素；升糖素；瘦素；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子及馮威里氏(von Willebrands)因子；抗凝血因子，諸如蛋白C；心房利尿鈉因子；肺表面活性劑；血漿蛋白原活化因子，諸如尿激酶或者人類尿液或組織型血漿蛋白原活化因子(t-PA)；鈴蟾素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子α及腫瘤壞死因子β；腫瘤壞死因子受體，諸如死亡受體5及CD120；TNF相關細胞雕亡誘導配體(TRAIL)；B細胞成熟抗原(BCMA)；B淋巴細胞刺激因子(BLyS)；增殖誘導配體(APRIL)；腦啡肽酶；RANTES (活化後調控正常T細胞表現及分泌因子)；人類巨噬細胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白；Muellerian氏管抑制物質；鬆弛素A鏈；鬆弛素B鏈；前鬆弛素；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白，諸如β內醯胺酶；DNA酶；IgE；細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA)，諸如CTLA-4；抑制素；活化素；血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-ECGF)；血管內皮生長因子家族蛋白(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGFD及PlGF)；血小板衍生生長因子(PDGF)家族蛋白(例如PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其二聚體)；纖維母細胞生長因子(FGF)家族，諸如aFGF、bFGF、FGF4及FGF9；表皮生長因子(EGF)；激素或生長因子受體，諸如VEGF受體(例如VEGFR1、VEGFR2及VEGFR3)、表皮生長因子(EGF)受體(例如ErbB1、ErbB2、ErbB3及ErbB4受體)、血小板衍生生長因子(PDGF)受體(例如PDGFR-α及PDGFR-β)及纖維母細胞生長因子受體；TIE配體(血管生成素、ANGPT1、ANGPT2)；血管生成素受體，諸如TIE1及TIE2；蛋白A或蛋白D；類風濕因子；神經營養因子，諸如骨衍生神經營養因子(BDNF)、神經滋養素3、神經滋養素4、神經滋養素5或神經滋養素6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經生長因子，諸如NGF-b；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子I及胰島素樣生長因子II (IGF-I及IGF-II)；des(1-3)-IGF-I (腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，諸如CD3、CD4、CDS、CD19及CD20；紅血球生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；趨化因子，諸如CXCL12及CXCR4；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSP及G-CSF；細胞介素，諸如介白素(IL)，例如IL-1至IL-10；中期因子；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，舉例而言，諸如AIDS外膜之一部分；轉運蛋白；歸巢受體；位址蛋白；調控蛋白；整合蛋白，諸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4及VCAM；蝶素(ephrin)；Bv8；δ樣配體4 (DLL4)；Del-1；BMP9；BMP10；濾泡抑素；肝細胞生長因子(HGF)/擴散因子(SF)；Alkl；Robo4；ESMl；串珠蛋白聚糖；EGF樣結構域7 (EGFL7)；CTGF及其家族成員；血小板反應蛋白，諸如血小板反應蛋白1及血小板反應蛋白2；膠原蛋白，諸如膠原蛋白IV及膠原蛋白XVIII；神經纖毛素，諸如NRP1及NRP2；多效生長因子(PTN)；前顆粒蛋白；增殖蛋白；Notch蛋白，諸如Notch1及Notch4；腦信號蛋白，諸如Sema3A、Sema3C及Sema3F；腫瘤相關抗原，諸如CA125 (卵巢癌抗原)或者HER2、HER3或HER4受體；免疫黏附素；及以上所列出之蛋白質中任一種之片段及/或變异體，以及結合至一或多種蛋白質(包括例如以上所列出之蛋白質中任一種)之抗體，包括抗體片段。
術語「抗體 」在本文中以其最廣泛意義使用且特定言之，涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特异性抗體(例如雙特异性抗體)及抗體片段，只要其展現所要生物活性即可。
「分離 」之抗體爲自其天然環境組分中鑒定並分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染組分爲會干擾該抗體之研究、診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在一些實施例中，抗體純化至(1)如藉由例如羅氏方法(Lowry method)所測定達至超過95重量%抗體且在一些實施例中達至超過99重量%；(2)藉由使用例如旋杯式定序儀達至足以獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度；或(3)在還原或非還原條件下使用例如考馬斯藍(Coomassie blue)或銀染色藉由SDS-PAGE測定達至均質。分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體，此係因爲該抗體之天然環境中之至少一種組分將不存在。然而，分離之抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
「天然抗體 」通常爲包含兩個一致輕(L)鏈及兩個一致重(H)鏈之約150,000道爾頓之异四聚糖蛋白。各輕鏈藉由一個共價二硫鍵連接至重鏈，而二硫鍵數目因不同的免疫球蛋白同型之重鏈而各异。各重鏈及輕鏈亦具有規則間隔之鏈內二硫橋。各重鏈具有處於一端之可變域(VH )及繼其之後的衆多恒定域。各輕鏈具有處於一端之可變域(VL )及處於其另一端之恒定域；輕鏈之恒定域與重鏈之第一恒定域對準，且輕鏈可變域與重鏈之可變域對準。據信特定胺基酸殘基可在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。
術語「全長抗體 」、「完整抗體 」及「整抗體 」在本文中可互換用於指呈其基本上完整形式之抗體，而非如以下所定義之抗體片段。該等術語尤其係指具有含Fe區之重鏈的抗體。
「抗體片段 」包含完整抗體之一部分，視情況包含其抗原結合區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
如本文中所使用之術語「單株抗體 」係指獲自實質上均質之抗體群體的抗體，例如構成該群體之個別抗體除可能之突變，例如可能微量存在之天然存在突變外爲一致的。因而，修飾語「單株」指示抗體之特徵爲並非離散抗體之混合物。在某些實施例中，此種單株抗體通常包括包含結合標靶之多肽序列的抗體，其中該標靶結合多肽序列係藉由包括自複數個多肽序列中選擇單一靶結合多肽序列之方法來獲得。舉例而言，選擇過程可爲自複數個純系，諸如雜交瘤純系、噬菌體純系或重組DNA純系之庫中選擇獨特的純系。應理解，可進一步改變所選標靶結合序列，例如，以提高對標靶之親和力、使標靶結合序列人類化、提高其在細胞培養物中之產量、降低其在活體內之免疫原性、以產生多特异性抗體等，且包含經改變之標靶結合序列的抗體亦爲本發明之單株抗體。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之各單株抗體針對抗原上之單一決定子。除其特异性以外，單株抗體製劑之優勢亦在於其通常未受其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株 」指示獲自基本上均質之抗體群體的抗體的特徵，而不應被視為需要藉由任何特定方法來產生抗體。
本文中之單株抗體明確包括「嵌合 」抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或者屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或者屬於另一抗體類別或子類之抗體以及該等抗體之片段中的相應序列一致或同源，只要其展現所要生物活性即可(參見例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855 (1984))。嵌合抗體包括PRIMATTZED®抗體，其中該抗體之抗原結合區來源於藉由例如用相關抗原使獼猴免疫而產生之抗體。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化 」形式爲含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在一個實施例中，人類化抗體爲人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體HVR之殘基置換爲來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種之具有所要特异性、親和力及/或容量之HVR (供體抗體)的殘基。在一些情况下，人類免疫球蛋白之FR殘基置換为相應非人類殘基。此外，人類化抗體可包含受體抗體中或供體抗體中未發現之殘基。可進行此等修飾以進一步精化抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含實質上所有至少一個且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且所有或實質上所有FR皆爲人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體視情况亦將包含免疫球蛋白恒定區(Fe)，通常人類免疫球蛋白恒定區之至少一部分。關於進一步細節，參見例如Jones等人,Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329 (1988)；及Presta,Curr. Op. Struct. Biol .2:593-596 (1992)。亦參見例如Vaswani及Hamilton,Ann. Allergy, Asthma & Immunol . 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem.Soc. Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle及Gross,Curr. Op. Biotech. 5:428-433(1994)；以及美國專利第6,982,321號及第7,087,409號。
「人類抗體 」爲具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列及/或已使用如本文中所揭示之製造人類抗體之技術中之任一種製造的抗體。此人類抗體定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知的多種技術，包括噬菌體呈現庫來產生。Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol. , 227:381(1991)；Marks等人,J. Mol. Biol. , 222:581 (1991)。亦可用於製備人類單株抗體之方法描述於以下文獻中：Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss, 第77頁(1985)；Boerner等人,J. Immunol. , 147(1):86-95(1991)。亦參見van Dijk及van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol. , 5: 368-74 (2001)。人類抗體可藉由向經修飾以響應於抗原攻擊而產生該等抗體但內源基因座已失能之轉殖基因動物(例如免疫异種移植小鼠)投與抗原來製備(關於XENOMOUSE™技術，參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號)。關於經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體，亦參見例如Li等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 103:3557-3562 (2006)。
「穩定 」調配物爲其中之蛋白質在儲存後基本上保持其物理穩定性及/或化學穩定性及/或生物活性之調配物。在一些實施例中，該調配物在儲存後基本上保持其物理及化學穩定性以及其生物活性。一般基於調配物之預期儲架壽命來選擇儲存期。用於量測蛋白質穩定性之各種分析技術可用於此項技術中，且綜述於例如以下文獻中：Peptide and Protein Drug Delivery , 247-301, Vincent Lee編, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)；及Jones, A.Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)。可在所選曝光量及/或溫度下量測所選時段內之穩定性。可用多種不同的方式定性及/或定量評估穩定性，包括評估聚集物形成(例如使用粒徑排阻層析法、藉由量測濁度及/或藉由目視檢查)；評估ROS形成(例如藉由使用光應力分析法或2,2'-偶氮雙(2-甲脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)應力分析法)；使蛋白質之特定胺基酸殘基(例如單株抗體之Trp殘基及/或Met殘基)氧化；藉由使用陽離子交換層析、影像毛細管等電聚焦(icIEF)或毛細管區電泳來評定電荷异質性；胺基末端或羧基末端序列分析；質譜分析；用於比較還原抗體與完整抗體之SDS-PAGE分析；肽圖(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；評估蛋白質之生物活性或靶結合功能(例如抗體之抗原結合功能)等。不穩定性可包括以下任一或多項：聚集、脫醯胺化(例如Asn脫醯胺化)、氧化(例如Met氧化及/或Trp氧化)、异構化(例如Asp异構化)、截割/水解/片段化(例如鉸鏈區片段化)、琥珀醯亞胺形成、未配對半胱胺酸、N末端延伸、C末端處理、糖基化差异、賦形劑降解、粒子(例如游離脂肪酸粒子)形成等。
若蛋白質在目視檢查色彩及/或澄清度時或者在藉由紫外光散射或藉由粒徑排阻層析法進行量測時顯示無或極小聚集、沈澱及/或變性迹象，則其在醫藥調配物中「保持其物理穩定性 」。
若指定時間之化學穩定性使得蛋白質被視爲仍保持其生物活性，如以下所定義，則該蛋白質在醫藥調配物中「保持其化學穩定性 」。可藉由偵測並定量蛋白質之化學變化形式來評定化學穩定性。化學變化可包括蛋白質氧化，其可使用例如胰蛋白酶肽圖、逆相高效液相層析(HPLC)及液相層析-質譜(LC/MS)來評估。其他類型之化學變化包括蛋白質之電荷變化，此可藉由例如離子交換層析法或icIEF來評估。
若蛋白質在指定時間之生物活性在製備醫藥調配物時所展現之生物活性的約10%內(在分析誤差內)，如例如在單株抗體之抗原結合分析中所測定，則該蛋白質在醫藥調配物中「保持其生物活性 」。如本文中所使用，蛋白質之「生物活性 」係指蛋白質結合其標靶之能力，例如單株抗體結合至抗原之能力。其可進一步包括可在活體外或活體內量測之生物反應。此種活性可爲拮抗性或促效性。
如本文中所使用，術語「聚乙二醇 」、「PEG 」、「聚氧化乙烯 」、「PEO 」、「聚氧乙烯 」及「POE 」可互換使用，並且係指包含兩個或更多個氧化乙烯次單元之聚醚化合物。「聚乙二醇 」可包含氧化乙烯寡聚物(例如，具有二至九個氧化乙烯單體次單元)或氧化乙烯聚合物(例如，具有十個或更多個九個氧化乙烯單體次單元)。
「脂肪酸 」爲具有長鏈烴側基之羧酸。其包含藉由將甲基氧化至醇、醛、且隨後氧化至酸之等效方案而衍生自烴的有機一元酸。脂肪酸可為飽和或不飽和的。關於不飽和脂肪酸，其可具有順式(Z)或反式(E)構型，或二者之組合。
「烷基 」涵蓋具有所指示數目之碳原子，例如1至20個碳原子、或1至8個碳原子、或1至6個碳原子之直碳鏈及分支碳鏈。舉例而言，C1-6 烷基涵蓋1至6個碳原子之直鏈烷基及分支鏈烷基。當命名具有特定碳數目之烷基殘基時，意欲涵蓋具有該碳數目之所有分支鏈及直鏈型式；因而，舉例而言，「丙基」包括正丙基及异丙基；且「丁基」包括正丁基、二級丁基、异丁基及三級丁基。烷基之實例包括但不限於甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、二級丁基、三級丁基、戊基、2-戊基、3-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基及3-甲基戊基。當提供某一值之範圍(例如，C1-6 烷基)時，包括該範圍內之每一值以及所有中間範圍。舉例而言，「C1-6 烷基」包括C1 、C2 、C3 、C4 、C5 、C6 、C1-6 、C2-6 、C3-6 、C4-6 、C5-6 、C1-5 、C2-5 、C3-5 、C4-5 、C1-4 、C2-4 、C3-4 、C1-3 、C2-3 及C1-2 烷基。
「烯基 」係指具有所指示數目之碳原子(例如2至8或2至6個碳原子)及至少一個碳-碳雙鍵之不飽和分支鏈或直鏈烷基。該基團可關於雙鍵呈順式或反式構型(Z或E構型)。烯基包括但不限於乙烯基、丙烯基(例如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基)及丁烯基(例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基)。
術語「經取代 」意謂規定基團或部分帶有一或多個取代基，包括但不限於諸如烷氧基、醯基、醯氧基、烷氧基羰基、羰基烷氧基、醯基胺基、胺基、胺基醯基、胺基羰基胺基、胺基羰氧基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳基、芳氧基、氰基、叠氮基、鹵基、羥基、硝基、羧基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基、雜環基、芳烷基、胺基磺醯基、磺醯基胺基、磺醯基、側氧基及其類似基團之取代基。術語「未經取代」意謂規定基團不帶有取代基。在使用術語「經取代」來描述結構系統時，取代意欲發生在該系統上之任何原子價允許之位置。在基團或部分帶有超過一個取代基時，應理解，該等取代基可彼此相同或不同。在一些實施例中，經取代之基團或部分帶有一至五個取代基。在一些實施例中，經取代之基團或部分帶有一個取代基。在一些實施例中，經取代之基團或部分帶有兩個取代基。在一些實施例中，經取代之基團或部分帶有三個取代基。在一些實施例中，經取代之基團或部分帶有四個取代基。在一些實施例中，經取代之基團或部分帶有五個取代基。
「視情况 」或「視情况地 」意謂隨後描述之事件或情形可能發生或可能不發生，且該描述包括該事件或情形發生的情况及其不發生的情况。舉例而言，「視情况經取代之烷基」涵蓋如本文中所定義之「烷基」及「經取代之烷基」二者。熟習此項技術者應理解，關於含有一或多個取代基之任何基團，該等基團不意欲引入空間上不切實際、合成上不可行及/或固有地不穩定的任何取代或取代模式。亦應理解，在基團或部分視情况經取代時，本發明包括該基團或部分經取代之實施例及該基團或部分未經取代之實施例。
「無菌 」調配物爲無菌的或者不含或基本上不含所有活微生物及其孢子。II. 多肽調配物
本文中提供包含多肽及表面活性劑之調配物，其中該表面活性劑包含一或多種聚山梨醇酯組分。在一些實施例中，該調配物爲液體調配物。在一些實施例中，該調配物爲凍幹調配物。 表面活性劑
生物醫藥調配物通常與表面活性劑一起調配以保護活性醫藥成分免受界面應力影響。與界面(尤其空氣-水)之相互作用已顯示在攪拌或長期儲存期間引起治療蛋白質聚集。聚山梨醇酯爲用於防止生物醫藥之此等類型之相互作用的常用表面活性劑。一般針對其高表面活性、低臨界微胞濃度(CMC)及低毒性對其進行選擇。然而，此等表面活性劑爲相關化合物之非均質混合物，該等化合物組合起來賦予其生物醫藥調配物所需之獨特性質。
聚山梨醇酯(PS)爲一類乳化劑，其通常描述爲用脂肪酸進行酯化之乙氧基化去水山梨醇。PS爲具有多層异質性之相關化合物混合物。第一層爲脂肪酸酯尾長。USP及EP專論指出PS20之此等酯之分布應為40-60%月桂酸酯(C12 )酯、14-25%肉豆蔻酸酯(C14 )酯及7-15%棕櫚酸酯(C16 )酯與至多1%己酸酯(C6 )酯、10%辛酸酯(C8 )酯、10%癸酸酯(C10 )酯、7%硬脂酸酯(C18 )酯、11%單不飽和C18 酯及3%雙不飽和C18 酯。其他异質性來源於POE鏈之長度以及二酯及三酯之存在。此外，在由山梨醇合成去水山梨糖醇過程中亦形成異山梨醇，由此可產生其特有的具有兩個而非四個POE臂之PS20類化合物系列。亦參見以下表 1 。已發現不同的組分具有顯著不同的溶液及界面性質。特定言之，異山梨醇POE脂肪酸酯組分更大程度地保護多肽之性質。因此，使用高於聚山梨醇酯中(例如，如EP或USP專論中所描述)之異山梨醇POE脂肪酸酯濃度(例如至少70% (wt%))允許在爲液體調配物中之多肽提供更大程度之保護的同時使用較少量之表面活性劑。
本文中提供一種生物醫藥調配物，其包含表面活性劑與在保護調配物中之多肽方面有效的某些聚山梨醇酯組分。在一些實施例中，此等組分允許使用較少表面活性劑但提供較高穩定性。在一些實施例中，使用較少量之表面活性劑導致較少游離脂肪酸粒子形成。在一些實施例中，此等組分在更大程度上保護多肽免受游離脂肪酸粒子影響。
在一個態樣中，該表面活性劑包含異山梨醇POE脂肪酸酯。在另一態樣中，該表面活性劑包含異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。
在一些實施例中，各異山梨醇POE脂肪酸酯及各POE脂肪酸酯獨立地具有約5至10個POE單元、約10至15個單元、約15至20個POE單元、約20至25個POE單元、約25至30個POE單元、約15至30個POE單元。在一些實施例中，各異山梨醇POE脂肪酸酯及各POE脂肪酸酯獨立地具有5個POE單元、6個POE單元、7個POE單元、8個POE單元、9個POE單元、10個POE單元、11個POE單元、12個POE單元、13個POE單元、14個POE單元、15個POE單元、16個POE單元、17個POE單元、18個POE單元、19個POE單元、20個POE單元、21個POE單元、22個POE單元、23個POE單元、24個POE單元、25個POE單元、26個POE單元、27個POE單元、28個POE單元、29個POE單元、30個POE單元或其組合。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯具有約5至10個POE單元、約10至15個單元、約15至20個POE單元、約20至25個POE單元、約25至30個POE單元、約15至30個POE單元。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯具有5個POE單元、6個POE單元、7個POE單元、8個POE單元、9個POE單元、10個POE單元、11個POE單元、12個POE單元、13個POE單元、14個POE單元、15個POE單元、16個POE單元、17個POE單元、18個POE單元、19個POE單元、20個POE單元、21個POE單元、22個POE單元、23個POE單元、24個POE單元、25個POE單元、26個POE單元、27個POE單元、28個POE單元、29個POE單元、30個POE單元或其組合。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯具有約20個POE單元。在一些實施例中，異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯二者皆具有約5至30個POE單元。在一些實施例中，異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯二者皆具有約20個POE單元。
在一些實施例中，各異山梨醇POE脂肪酸酯及各POE脂肪酸酯獨立地具有獨立地選自由視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基及視情況經取代之炔基組成之群的脂肪酸鏈。在一些實施例中，該烷基為直鏈的。在一些實施例中，該脂肪酸鏈為未經取代之C4-28 烷基。在一些實施例中，該脂肪酸鏈爲經選自由以下組成之群的取代基取代的C4-28 烷基：醯基、羥基、環烷基、烷氧基、酰氧基、胺基、胺基醯基、硝基、鹵基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基或雜環基。在一些實施例中，該脂肪酸鏈為未經取代之C4-28 烯基。在一些實施例中，該烯基為直鏈或分支鏈的。在一些實施例中，該脂肪酸鏈具有一或多個雙鍵。在一些實施例中，各雙鍵具有順式構型。在一些實施例中，各雙鍵具有反式構型。在一些實施例中，該脂肪酸鏈為經選自由以下組成之群的取代基取代的C4-28 烯基：醯基、羥基、環烷基、烷氧基、酰氧基、胺基、胺基醯基、硝基、鹵基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基或雜環基。
在一些實施例中，各異山梨醇POE脂肪酸酯獨立地具有一、二、三或四個POE臂。在一些實施例中，各異山梨醇POE脂肪酸酯具有兩個POE臂。
在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯具有以下式(I)之結構：
Figure 02_image005
(I) ； 其中： a及b獨立地為2至28之整數，條件為a與b之和為5至30之整數； R1 及R2 係獨立地選自由氫及-C(O)R"組成之群，其中R"為視情況經取代之C3-27 烷基或視情況經取代之C3-27 烯基；且 R3 及R4 獨立地為氫。
在式(I)之一些實施例中，a與b之和為約5至10、約10至15、約15至20、約20至25、約25至30或約15至30。在式(I)之一些實施例中，a與b之和為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一些實施例中，a與b之和為9。在一些實施例中，a與b之和為20。在式(I)之一些實施例中，R1 及R2 中至少一個不為氫。在式(I)之一些實施例中，R1 及R2 二者皆為-C(O)R"。在式(I)之一些實施例中，R"為視情況經取代之C3-27 烷基。在式(I)之一些實施例中，R"為未經取代之C3-27 烷基。在式(I)之一些實施例中，該C3-27 烷基為直鏈的。在式(I)之一些實施例中，該C3-27 烷基為分支的。在式(I)之一些實施例中，R"為未經取代之C5 烷基、C7 烷基、C9 烷基、C11 烷基、C13 烷基、C15 烷基、C17 烷基、C19 烷基、C21 烷基或C23 烷基。在式(I)之一些實施例中，R"為未經取代之直鏈C11 烷基。在式(I)之一些實施例中，R"為視情況經取代之C3-27 烯基。在式(I)之一些實施例中，R"為未經取代之C3-27 烯基。在式(I)之一些實施例中，該C3-27 烯基為直鏈的。在式(I)之一些實施例中，R"為未經取代之C5 烯基、C7 烯基、C9 烯基、C11 烯基、C13 烯基、C15 烯基、C17 烯基、C19 烯基、C21 烯基或C23 烯基。在式(I)之一些實施例中，R"具有兩個或更多個雙鍵。在式(I)之一些實施例中，該兩個或更多個雙鍵具有順式構型。在式(I)之一些實施例中，該兩個或更多個雙鍵具有反式構型。在式(I)之一些實施例中，R"具有一個雙鍵，該雙鍵具有順式構型。在式(I)之一些實施例中，R"具有一個雙鍵，該雙鍵具有反式構型。在式(I)之一些實施例中，R"係選自由以下組成之群：-(CH2 )7 CH=CH(CH2 )3 CH3 、-(CH2 )7 CH=CH(CH2 )5 CH3 、-(CH2 )4 CH=CH(CH2 )8 CH3 、-(CH2 )7 CH=CH(CH2 )7 CH3 、-(CH2 )9 CH=CH(CH2 )5 CH3 、-(CH2 )7 CH=CHCH2 CH=CH(CH2 )4 CH3 、-(CH2 )7 CH=CHCH2 CH=CHCH2 CH=CHCH2 CH3 、-(CH2 )3 CH=CHCH2 CH=CHCH2 CH=CHCH2 CH=CH(CH2 )4 CH3 及-(CH2 )11 CH=CH(CH2 )7 CH3 。在式(I)之一些實施例中，R"為-(CH2 )7 CH=CH(CH2 )7 CH3 且該雙鍵具有順式構型。在式(I)之一些實施例中，R"為-(CH2 )7 CH=CHCH2 CH=CH(CH2 )4 CH3 且兩個雙鍵皆具有順式構型。在式(I)之一些實施例中，R"為-(CH2 )7 CH=CHCH2 CH=CH(CH2 )4 CH3 且兩個雙鍵皆具有反式構型。
在一些實施例中，至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少70% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少80% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少90% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少95% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。
在一些實施例中，異山梨醇POE脂肪酸酯係選自單酯、二酯、三酯、四酯及前述各物之組合。在一些實施例中，異山梨醇POE脂肪酸酯為單酯。在一些實施例中，異山梨醇POE脂肪酸單酯係選自由以下組成之群：異山梨醇POE單己酸酯、異山梨醇POE單辛酸酯、異山梨醇POE單癸酸酯、異山梨醇POE單月桂酸酯、異山梨醇POE單肉豆蔻酸酯、異山梨醇POE單棕櫚酸酯、異山梨醇POE單棕櫚油酸酯、異山梨醇POE單硬脂酸酯、異山梨醇POE單油酸酯、異山梨醇POE單亞麻油酸酯、異山梨醇POE單次亞麻油酸酯及前述各物之組合。在一些實施例中，異山梨醇POE脂肪酸酯為二酯。在一些實施例中，異山梨醇POE脂肪酸二酯係選自由以下組成之群：異山梨醇POE二己酸酯、異山梨醇POE二辛酸酯、異山梨醇POE二癸酸酯、異山梨醇POE二月桂酸酯、異山梨醇POE二肉豆蔻酸酯、異山梨醇POE二棕櫚酸酯、異山梨醇POE二棕櫚油酸酯、異山梨醇POE二硬脂酸酯、異山梨醇POE二油酸酯、異山梨醇POE二亞麻油酸酯、異山梨醇POE二次亞麻油酸酯及前述各物之組合。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯為式(I)化合物。
在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯具有相同的脂肪酸鏈。在一些實施例中，該異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯具有不同的脂肪酸鏈。在一些實施例中，該POE脂肪酸酯係選自由以下組成之群：POE單己酸酯、POE單辛酸酯、POE單癸酸酯、POE單月桂酸酯、POE單肉豆蔻酸酯、POE單棕櫚酸酯、POE單棕櫚油酸酯、POE單硬脂酸酯、POE單油酸酯、POE單亞麻油酸酯、POE單次亞麻油酸酯、POE二己酸酯、POE二辛酸酯、POE二癸酸酯、POE二月桂酸酯、POE二肉豆蔻酸酯、POE二棕櫚酸酯、POE二棕櫚油酸酯、POE二硬脂酸酯、POE二油酸酯、POE二亞麻油酸酯、POE二次亞麻油酸酯及前述各物之組合。在一些實施例中，該表面活性劑包含異山梨醇POE單月桂酸酯及POE單月桂酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑包含異山梨醇POE單棕櫚酸酯及POE單棕櫚酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑包含異山梨醇POE單肉豆蔻酸酯及POE單肉豆蔻酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑包含異山梨醇POE單油酸酯及POE單油酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑包含異山梨醇POE單亞麻油酸酯及POE單亞麻油酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑包含之異山梨醇POE脂肪酸酯之量大於POE脂肪酸酯。在一些實施例中，少於約40%、少於約35%、少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約7.5%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%、少於約1%、少於約0.75%、少於約0.5%或少於約0.1% (wt%)之該表面活性劑為POE脂肪酸酯。
在一些實施例中，該表面活性劑進一步包含去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，各去水山梨醇POE脂肪酸酯獨立地具有約5至10個POE單元、約10至15個單元、約15至20個POE單元、約20至25個POE單元、約25至30個POE單位、約15至30個POE單元。在一些實施例中，各去水山梨醇POE脂肪酸酯獨立地具有5個POE單元、6個POE單元、7個POE單元、8個POE單元、9個POE單元、10個POE單元、11個POE單元、12個POE單元、13個POE單元、14個POE單元、15個POE單元、16個POE單元、17個POE單元、18個POE單元、19個POE單元、20個POE單元、21個POE單元、22個POE單元、23個POE單元、24個POE單元、25個POE單元、26個POE單元、27個POE單元、28個POE單元、29個POE單元、30個POE單元或其組合。
在一些實施例中，各去水山梨醇POE脂肪酸酯獨立地具有獨立地選自由視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基及視情況經取代之炔基組成之群的脂肪酸鏈。在一些實施例中，該烷基為直鏈的。在一些實施例中，該脂肪酸鏈為未經取代之C4-28 烷基。在一些實施例中，該脂肪酸鏈爲經選自由以下組成之群的取代基取代的C4-28 烷基：醯基、羥基、環烷基、烷氧基、酰氧基、胺基、胺基醯基、硝基、鹵基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基或雜環基。在一些實施例中，該脂肪酸鏈為未經取代之C4-28 烯基。在一些實施例中，該烯基為直鏈或分支鏈的。在一些實施例中，該脂肪酸鏈具有一或多個雙鍵。在一些實施例中，各雙鍵具有順式構型。在一些實施例中，各雙鍵具有反式構型。在一些實施例中，該脂肪酸鏈為經選自由以下組成之群的取代基取代的C4-28 烯基：醯基、羥基、環烷基、烷氧基、酰氧基、胺基、胺基醯基、硝基、鹵基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基或雜環基。
在一些實施例中，各去水山梨醇POE脂肪酸酯獨立地具有二、三或四個POE臂。在一些實施例中，各去水山梨醇POE脂肪酸酯具有四個POE臂。
在一些實施例中，該去水山梨醇POE脂肪酸酯具有以下式(II)之結構：
Figure 02_image006
II ； 其中： w、z、y及x獨立地為2至24之整數，條件為w、z、y及x之和為15至30之整數； R5 、R6 、R7 及R8 係獨立地選自由氫及-C(O)R'組成之群，其中R'為視情況經取代之C3-27 烷基或視情況經取代之C3-27 烯基；且 R9 為氫。
在式(II)之一些實施例中，w、z、y及x之和為約15至20、約20至25、約25至30或約15至30。在式(II)之一些實施例中，w、z、y及x之和為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在式(II)之一些實施例中，R5 、R6 、R7 及R8 中至少一個不為氫。在式(II)之一些實施例中，R5 、R6 、R7 及R8 中至少兩個不為氫。在式(II)之一些實施例中，R5 、R6 、R7 及R8 中之每一者皆為-C(O)R'。在一些實施例中，R5 、R6 及R7 為H，且R8 為-C(O)R'。在一些實施例中，R5 及R6 為H，且R3 及R4 為-C(O)R'。在一些實施例中，R6 為H，且R5 、R7 及R8 為-C(O)R'。在式(II)之一些實施例中，R'為視情況經取代之C3-27 烷基。在式(II)之一些實施例中，R'為未經取代之C3-27 烷基。在式(II)之一些實施例中，該C3-27 烷基為直鏈的。在式(II)之一些實施例中，該C3-27 烷基為分支的。在式(II)之一些實施例中，R'為未經取代之C5 烷基、C7 烷基、C9 烷基、C11 烷基、C13 烷基、C15 烷基、C17 烷基、C19 烷基、C21 烷基或C23 烷基。在式(II)之一些實施例中，R'為未經取代之直鏈C11 烷基。在式(II)之一些實施例中，R'為視情況經取代之C3-27 烯基。在式(II)之一些實施例中，R'為未經取代之C3-27 烯基。在式(II)之一些實施例中，該C3-27 烯基為直鏈的。在式(II)之一些實施例中，R'為未經取代之C5 烯基、C7 烯基、C9 烯基、C11 烯基、C13 烯基、C15 烯基、C17 烯基、C19 烯基、C21 烯基或C23 烯基。在式(II)之一些實施例中，R'具有兩個或更多個雙鍵。在式(II)之一些實施例中，該兩個或更多個雙鍵具有順式構型。在式(II)之一些實施例中，該兩個或更多個雙鍵具有反式構型。在式(II)之一些實施例中，R'具有一個雙鍵，該雙鍵具有順式構型。在式(II)之一些實施例中，R'具有一個雙鍵，該雙鍵具有反式構型。在式(II)之一些實施例中，R'係選自由以下組成之群：-(CH2 )7 CH=CH(CH2 )3 CH3 、-(CH2 )7 CH=CH(CH2 )5 CH3 、-(CH2 )4 CH=CH(CH2 )8 CH3 、-(CH2 )7 CH=CH(CH2 )7 CH3 、-(CH2 )9 CH=CH(CH2 )5 CH3 、-(CH2 )7 CH=CHCH2 CH=CH(CH2 )4 CH3 、-(CH2 )7 CH=CHCH2 CH=CHCH2 CH=CHCH2 CH3 、-(CH2 )3 CH=CHCH2 CH=CHCH2 CH=CHCH2 CH=CH(CH2 )4 CH3 及-(CH2 )11 CH=CH(CH2 )7 CH3 。在式(II)之一些實施例中，R'為-(CH2 )7 CH=CH(CH2 )7 CH3 且該雙鍵具有順式構型。在式(II)之一些實施例中，R'為-(CH2 )7 CH=CHCH2 CH=CH(CH2 )4 CH3 且兩個雙鍵皆具有順式構型。在式(II)之一些實施例中，R'為-(CH2 )7 CH=CHCH2 CH=CH(CH2 )4 CH3 且兩個雙鍵皆具有反式構型。
在一些實施例中，少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或少於約1% (wt%)之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少1% (wt%)之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少5% (wt%)之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少10% (wt%)之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少15% (wt%)之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。
在一些實施例中，各去水山梨醇POE脂肪酸酯獨立地為單酯、二酯、三酯或四酯。在一些實施例中，各去水山梨醇POE脂肪酸酯獨立地選自由以下組成之群：去水山梨醇POE單己酸酯、去水山梨醇POE單辛酸酯、去水山梨醇POE單癸酸酯、去水山梨醇POE單月桂酸酯、去水山梨醇POE單肉荳蔻酸酯、去水山梨醇POE單棕櫚酸酯、去水山梨醇POE單棕櫚油酸酯、去水山梨醇POE單硬脂酸酯、去水山梨醇POE單油酸酯、去水山梨醇POE單亞麻油酸酯、去水山梨醇POE單次亞麻油酸酯、去水山梨醇POE二己酸酯、去水山梨醇POE二辛酸酯、去水山梨醇POE二癸酸酯、去水山梨醇POE二月桂酸酯、去水山梨醇POE二肉荳蔻酸酯、去水山梨醇POE二棕櫚酸酯、去水山梨醇POE二棕櫚油酸酯、去水山梨醇POE二硬脂酸酯、去水山梨醇POE二油酸酯、去水山梨醇POE二亞麻油酸酯、去水山梨醇POE二次亞麻油酸酯、去水山梨醇POE三己酸酯、去水山梨醇POE三辛酸酯、去水山梨醇POE三癸酸酯、去水山梨醇POE三月桂酸酯、去水山梨醇POE三肉荳蔻酸酯、去水山梨醇POE三棕櫚酸酯、去水山梨醇POE三棕櫚油酸酯、去水山梨醇POE三硬脂酸酯、去水山梨醇POE三油酸酯、去水山梨醇POE三亞麻油酸酯及去水山梨醇POE三次亞麻油酸酯。在一些實施例中，該去水山梨醇POE脂肪酸酯為式(II)化合物。
在另一態樣中，本文中所揭示之表面活性劑之臨界微胞濃度(CMC)為大於約0.001%、約0.002%、約0.003%、約0.004%、約0.005%、約0.006%、約0.007%、約0.008%、約0.009%、約0.01%、約0.02%、約0.03%、約0.04%、約0.05%、約0.06%、約0.07%、約0.08%、約0.09%或約0.1% (w:v)。在另一態樣中，該表面活性劑之表面張力小於約20 mN/m、約25 mN/m、約30 mN/m、約35 mN/m、約40 mN/m、約45 mN/m、約50 mN/m、約55 mN/m或約60 mN/m。 多肽
本文中之揭示內容係關於包含多肽及表面活性劑之液體調配物。在一些實施例中，本文中所描述之液體調配物中之多肽為基本上純的。在一些實施例中，本文中所描述之液體調配物中之多肽為基本上均質的(亦即，不含污染蛋白質)。「基本純」之多肽意謂以組合物之總重量計包含至少約90重量%之多肽的組合物。在一些實施例中，該多肽以組合物之總重量計佔至少95重量%。「基本上均質」之多肽意謂以組合物之總重量計包含至少約99重量%之多肽的組合物。
在一些實施例中，該多肽為抗體。本文中之抗體針對相關「抗原」。在一些實施例中，該抗原為生物學上重要之蛋白質，且向罹患疾病或病症之哺乳動物投與該抗體可在該哺乳動物中產生治療益處。在一些實施例中，亦考慮針對非蛋白質抗原(諸如腫瘤相關醣脂抗原；參見例如美國專利5,091,178)之抗體。在抗原為蛋白質時，其可為跨膜分子(例如受體)或配體，諸如生長因子。例示性抗原包括本文中所描述之任何蛋白質。在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體的分子標靶包括CD多肽，諸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20及CD34；HER受體家族成員，諸如EGF受體(HER1)、HER2、HER3或HER4受體；介白素(IL)，例如IL-1至IL-10；細胞黏附分子，諸如LFA-1、Macl、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM及av/b3整合蛋白，包括其a或b次單元(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；生長因子，諸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；程式性死亡蛋白1 (PD-1)；程式性死亡配體1 (PD-L1)；多肽C等。視情況與其他分子結合之可溶性抗原或其片段可用作免疫原以產生抗體。對於跨膜分子，諸如受體，可使用此等之片段(例如，受體之細胞外域)作為免疫原。替代地，可使用表現跨膜分子之細胞作為免疫原。此種細胞可來源於天然來源(例如癌細胞株)，或可為藉由重組技術轉型以表現跨膜分子之細胞。
在一些實施例中，該抗體包括但不限於多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、嵌合抗體及異源結合抗體。在一些實施例中，該抗體包括抗體片段及完整抗體。在一些實施例中，該抗體片段係選自由Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段組成之群。
可使用此項技術中已知的方法來製備調配物中之多肽，諸如藉由培養經含有編碼該多肽之核酸的載體轉型或轉染的細胞，或藉由合成技術(例如重組技術及肽合成或此等技術之組合)來製備，或可自多肽之內源來源分離。A. 蛋白質製備
藉由重組手段製備蛋白質以便藉由本發明之方法進行調配可藉由用表現或選殖載體對適合之宿主細胞進行轉染或轉型並且在適當時經調節之習知營養培養基中培養以誘導啟動子、選擇轉型子或擴增編碼所要序列之基因來實現。培養條件，諸如培養基、溫度、pH及其類似培養條件，可由技術人員選擇而無需過度實驗。一般而言，使細胞培養物之生產力最大化的原理、方案及實用技術可見於以下文獻中：Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach , M. Butler編(IRL Press, 1991)；及Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual , New York: Cold Spring Harbor Press。轉染方法對普通技術人員為已知的，且包括例如CaPO4 及CaCl2 轉染、電穿孔、顯微注射等。適合之技術亦描述於Sambrook 等人 ,同上 中。其他轉染技術描述於以下文獻中：Shaw等人,Gene 23 : 315 (1983)；WO 89/05859；Graham等人,Virology 52 : 456-457 (1978)；及美國專利4,399,216。
可將編碼用於根據本發明方法調配之所要蛋白質的核酸插入至可複制載體中以進行選殖或表現。適合之載體爲公衆可獲得的，且可呈質體、黏質體、病毒粒子或噬菌體形式。可藉由多種程序將適當核酸序列插入至載體中。一般而言，使用此項技術中已知的技術將DNA插入適當限制內切核酸酶位點中。載體組分一般包括但不限於信號序列、複製起點、一或多個標記基因及增强子元件、啓動子及轉錄終止序列中之一或多個。含有此等組分中之一或多種之適合載體之構築採用熟練技術人員已知的標準連接技術。
可自培養基或自宿主細胞溶解物回收欲調配之蛋白質形式。若爲膜結合型，則可使用適合之清潔劑或經由酶裂解使其自膜釋放。亦可藉由各種物理或化學手段，諸如凍融循環、音波處理、機械破壞或細胞溶解劑來破壞用於表現之細胞。
欲調配之蛋白質之純化可藉由此項技術中已知的任何適合之技術來進行，舉例而言，諸如離子交換管柱上分級、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽或陽離子交換樹脂上層析(例如DEAE)、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沈澱、使用蛋白A瓊脂糖管柱(例如Sephadex® G-75)進行凝膠過濾以移除污染物(諸如IgG)及用以結合抗原決定基標記形式之金屬螯合管柱。B. 抗體製備
在本發明之某些實施例中，所選擇之蛋白質為抗體。用於產生抗體，包括多株抗體、單株抗體、人類化抗體、雙特異性抗體及異源結合抗體之技術如下。1. 多株抗體
一般藉由多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原及佐劑在動物中產生多株抗體。其可用於結合相關抗原與在欲免疫之物種中具免疫原性之蛋白質，例如鑰孔蟲戚血藍素、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。可採用之佐劑之實例包括弗氏完全佐劑及MPL-TDM佐劑(單磷醯基脂質A、合成海藻糖二白喉菌酸酯)。免疫方案可由熟習此項技術者選擇而無需過度實驗。
一個月後，利用含1/5至1/10原始量之肽或結合物的弗氏完全佐劑藉由在多個部位皮下注射對動物進行加强免疫。7至14天后，對動物進行取血並且分析血清之抗體效價。對動物進行加强免疫直至效價平臺期。在一些實施例中，用相同抗原但結合至不同蛋白質及/或不同交聯試劑之結合物對動物進行加强免疫。亦可在重組細胞培養物中製造呈蛋白質融合物形式之結合物。諸如明礬之聚集劑亦適用於增强免疫反應。2. 單株抗體。
單株抗體係獲自實質上均質之抗體群體，亦即，構成該群體之個別抗體除可能微量存在之可能天然存在之突變外爲一致的。因而，修飾語「單株」指示抗體之特徵爲並非離散抗體之混合物。
舉例而言，單株抗體可使用首先由Kohler等人,Nature ,256 :495 (1975)描述之雜交瘤方法製造，或可藉由重組DNA方法(美國專利第4,816,567號)來製造。
在雜交瘤方法中，如上文所描述使小鼠或其他適當宿主動物(諸如倉鼠)免疫以引發產生或能够產生將特异性結合至用於免疫之蛋白質的抗體的淋巴細胞。替代地，可在活體外使淋巴細胞免疫。隨後使用適合之融合劑，諸如聚乙二醇使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice , 第59-103頁(Academic Press, 1986))。
免疫劑通常將包括欲調配之蛋白質。一般而言，在需要人類來源之細胞時使用外周血淋巴細胞(「PBL」)，或者在需要非人類哺乳動物來源時使用脾臟細胞或淋巴結細胞。隨後使用適合之融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與不朽化細胞株融合，以形成雜交瘤細胞。Goding,Monoclonal antibodies: Principles and Practice , Academic Press (1986), 第59-103頁。
不朽化細胞株通常爲轉型哺乳動物細胞，尤其嚙齒動物、牛及人類來源之骨髓瘤細胞。通常，採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。接種如此製備之雜交瘤細胞並且在視情况含有一或多種抑制未融合親本骨髓瘤細胞生長或存活之物質的適合培養基中生長。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質防止HGPRT缺乏細胞之生長。
適合之不朽化骨髓瘤細胞爲有效融合、支持所選抗體產生細胞穩定高水準產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感的骨髓瘤細胞。在一些實施例中，骨髓瘤細胞株爲鼠類骨髓瘤細胞株，諸如來源於可得自索爾克研究所細胞分布中心(Salk Institute Cell Distribution Center) (San Diego，California USA)之MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤的細胞，以及可得自美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection) (Manassus，Virginia USA)之SP-2細胞(及其衍生物，例如X63-Ag8-653)。亦已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株(Kozbor,J. lmmunol. ,133 :3001 (1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , 第51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
分析雜交瘤細胞在其中生長之培養基中針對抗原之單株抗體之產生。在一些實施例中，藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析法，诸如放射免疫分析法(RIA)或酶聯免疫吸附分析法(ELISA)來測定由雜交瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性。
可分析在其中培養雜交瘤細胞之培養基中亦針對所要抗原之單株抗體之存在。在一些實施例中，藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析法，諸如放射免疫分析法(RIA)或酶聯分析法(ELISA)來測定單株抗體之結合親和力及特异性。此種技术及分析法在此項技術中為已知的。單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson等人,Anal. Biochem. ,107 :220 (1980)之Scatchard分析來測定。
在鑒定產生具有所要特异性、親和力及/或活性之抗體的雜交瘤細胞之後，可藉由限制稀釋程序對純系進行次選殖且藉由標準方法使其生長(Goding,同上 )。用於此目的之適合培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，可使雜交瘤細胞在動物中活體內生長爲腹水腫瘤。
藉由習知免疫球蛋白純化程序，舉例而言，諸如蛋白A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，自培養基、腹水或血清適當地分離由次純系分泌之單株抗體。
亦可藉由重組DNA方法，諸如美國專利第4,816,567號中所描述及如以上所描述之彼等方法來產生單株抗體。可使用習知程序(例如，藉由使用能够特异性結合至編碼鼠類抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離編碼單株抗體之DNA並進行定序。在一些實施例中，雜交瘤細胞充當此種DNA之來源。一旦分離，便可將DNA置於表現載體中，隨後轉染至宿主細胞，諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不以其他方式產生免疫球蛋白之骨髓瘤細胞中，以便在此種重組宿主細胞中合成單株抗體。關於在細菌中重組表現編碼抗體之DNA的綜述論文包括Skerra等人,Curr. Opinion in Immunol. 5 :256-262 (1993)及Pliickthun,Immunol. Revs. 130 : 151-188 (1992)。
在另一實施例中，可自使用McCafferty等人,Nature ,348 :552-554 (1990)所描述之技術產生的抗體噬菌體庫分離抗體。Clackson等人,Nature ,352 :624-628 (1991)及Marks等人,J. Mal. Biol. ,222 :581-597 (1991)分別描述使用噬菌體庫分離鼠類及人類抗體。後續出版物描述藉由鏈改組(Marks等人,Bio/I'echnology ,10 :779-783 (1992))，以及作爲構築極大噬菌體庫之策略的組合感染及活體內重組(Waterhouse等人,Nucl. Acids Res. ,21 :2265-2266 (1993))來產生高親和力(nM範圍)人類抗體之方法。因而，此等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體雜交瘤技術之可行替代方案。
亦可例如藉由用人類重鏈及輕鏈恒定域之編碼序列替代同源鼠類序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等人,Proc. Natl Acad. Sci. USA ,81 :6851 (1984))或藉由將非免疫球蛋白多肽之所有或部分編碼序列共價接合至免疫球蛋白編碼序列來修飾DNA。通常，此種非免疫球蛋白多肽取代抗體之恒定域，或者其取代抗體之一個抗原結合位點之可變域，以產生包含對一個抗原具有特异性之一個抗原結合位點及對不同抗原具有特异性之另一抗原結合位點的嵌合二價抗體。
本文中所描述之單株抗體可爲單價的，其製備在此項技術中爲衆所周知的。舉例而言，一種方法包括重組表現免疫球蛋白輕鏈及經修飾之重鏈。重鏈一般在Fc區中之任一點截短，以防止重鏈交聯。替代地，相關半胱胺酸殘基可經另一胺基酸殘基取代或者缺失以防止交聯。活體外方法亦適用於製備單價抗體。可使用此項技術中已知的常規技術來消化抗體以產生其片段，尤其Fab片段。
亦可使用合成蛋白質化學中之已知方法，包括涉及交聯劑之方法在活體外製備嵌合或雜合抗體。舉例而言，可使用二硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。用於此目的之適合試劑的實例包括亞胺基硫醇鹽及甲基-4-巰基丁醯亞胺酸鹽。3. 人類化抗體。
本發明之抗體可進一步包含人類化或人類抗體。非人類(例如鼠類)抗體之人類化形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如抗體之Fv、Fab、Fab'、F(ab')2 或其他抗原結合子序列)。人類化抗體包括人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體互補性決定區(CDR)之殘基置換爲來自諸如小鼠、大鼠或兔之非人類物種且具有所要特异性、親和力及容量之CDR (供體抗體)的殘基。在一些情况下，人類免疫球蛋白之Fv構架殘基置換爲相應非人類殘基。人類化抗體亦可包含既未見於受體抗體中又未見於輸入CDR或構架序列中之殘基。一般而言，人類化抗體將包含實質上所有至少一個且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區皆對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且所有或實質上所有FR區皆爲人類免疫球蛋白一致序列之FR區。人類化抗體最佳亦將包含免疫球蛋白恒定區(Fc)，通常人類免疫球蛋白恒定區之至少一部分。Jones等人,Nature 321 : 522-525 (1986)；Riechmann等人,Nature 332 : 323-329 (1988)；及Presta,Curr. Opin. Struct. Biol . 2:593-596 (1992)。
用於使非人類抗體人類化之方法在此項技術中為眾所周知的。一般而言，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入至其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱爲「輸入」殘基，其通常取自「輸入」可變域。人類化可基本上遵循Winter及同事, Jones等人,Nature 321 :522-525 (1986)；Riechmann等人,Nature 332 :323-327 (1988)；Verhoeyen等人,Science 239 :1534-1536 (1988)之方法，或藉由將囓齒動物CDR或CDR序列取代爲人類抗體之相應序列來進行。因此，此種「人類化」抗體爲嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上小於完整人類可變域已由來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體通常爲一些CDR殘基及可能一些FR殘基由來自嚙齒動物抗體中之類似位點之殘基取代的人類抗體。
用於製造人類化抗體之人類可變域(輕鏈及重鏈二者)之選擇對降低抗原性非常重要。根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知人類可變域序列之整個庫篩檢嚙齒動物抗體之可變域序列。隨後接受最接近嚙齒動物序列之人類序列作爲人類化抗體之人類框架(FR)。Sims等人,J. Immunol. ,151 :2296 (1993)；Chothia等人,J. Mal. Biol. ,196 :901 (1987)。另一方法使用來源於特定輕鏈或重鏈子群之所有人類抗體之一致序列的特定構架。該相同框架可用於若干不同的人類化抗體。Carter等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,89 :4285 (1992)；Presta等人,J. Immnol. ,151 :2623 (1993)。
將抗體人類化並保留對抗原之高親和力及其他有利生物學特性更重要。爲了達成此目標，在一些實施例中，使用親本序列及人類化序列之三維模型，藉由分析親本序列及各種設想人類化產物之方法來製備人類化抗體。三維免疫球蛋白模型爲常用的且爲熟習此項技術者所熟知。可利用說明並顯示所選候選免疫球蛋白序列之大概三維構型結構的電腦程式。檢查此等顯示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中之可能作用，亦即，分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自受體及輸入序列中選擇FR殘基並組合，從而達成所要抗體特徵，諸如增加對靶抗原之親和力。一般而言，CDR殘基直接且最實質性地參與影響抗原結合。
設想人類化抗體之各種形式。舉例而言，人類化抗體可爲抗體片段，諸如Fab，其視情况與一或多種細胞毒性劑結合以產生免疫結合物。替代地，人類化抗體可爲完整抗體，諸如完整IgG1抗體。4. 人類抗體。
作為人類化之替代方案，可產生人類抗體。舉例而言，現有可能產生免疫後能够在不產生內源性免疫球蛋白之情况下產生人類抗體全譜系的轉殖基因動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈接合區(JH )基因之同型結合缺失完全抑制內源抗體產生。此種生殖系突變小鼠中之人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移將在抗原攻擊後產生人類抗體。參見例如Jakobovits等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,90 :2551 (1993)；Jakobovits等人,Nature ,362 :255-258 (1993)；Bruggermann等人,Year in Immuno. ,1 :33 (1993)；美國專利第5,591,669號及WO 97/17852。
替代地，噬菌體呈現技術可用於由來自未免疫供體之免疫球蛋白可變(V)域基因譜系在活體外產生人類抗體及抗體片段。McCafferty等人,Nature 348 :552-553 (1990)；Hoogenboom及Winter,J. Mal. Biol. 227 : 381 (1991)。根據此技術，將抗體V結構域基因框內選殖至絲狀噬菌體之主要或次要外殼蛋白基因(諸如M13或fd)中，並作爲功能抗體片段呈現在噬菌體粒子之表面上。因為絲狀粒子含有噬菌體基因組之單鏈DNA複本，故基於抗體之功能特性進行選擇亦選擇編碼展現彼等特性之抗體的基因。因而，噬菌體模擬B細胞之一些特性。噬菌體呈現可以多種形式進行，參見例如Johnson, Kevin S.及Chiswell, David J.,Curr. Opin Struct. Biol. 3 :564-571 (1993)。V基因片段之若干來源可用於噬菌體呈現。Clackson等人,Nature 352 :624-628 (1991)自來源於免疫小鼠脾臟之V基因之小型隨機組合庫分離多種不同的抗噁唑酮抗體。可構築來自未免疫人類供體之V基因譜系，且可遵循Marks等人,J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991)或Griffith等人,EMBO J. 12 :725-734 (1993)所描述之技術基本上分離針對多種不同的抗原(包括自身抗原)的抗體。亦參見美國專利第5,565,332號及第5,573,905號。
Cole等人 及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體(Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；及Boerner等人,J. Immunol. 147 (1): 86-95 (1991))。類似地，可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入至內源免疫球蛋白基因已部分或完全不活化之轉基因動物，例如小鼠中來製造人類抗體。攻擊後觀察到人類抗體產生，在所有方面皆與人類中所見相似，包括基因重排、組裝及抗體譜系。此方法描述於例如美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號中以及以下科學出版物中：Marks等人,Bio/I'echnology 10 :779-783 (1992)；Lenberg等人,Nature 368 : 856-859 (1994)；Morrison,Nature 368 : 812-13 (1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology 14 : 845-51 (1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14 : 826 (1996)；以及Lenberg及Huszar,Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93 (1995)。
最後，亦可由活化B細胞在活體外產生人類抗體(參見美國專利第5,567,610號及第5,229,275號)。5. 抗體片段
在某些情况下，使用抗體片段而非完整抗體存在諸多優勢。較小片段尺寸允許快速清除，且可改良對實體瘤之通路。
已開發用於產生抗體片段之多種技術。按傳統，此等片段係經由完整抗體之蛋白水解消化而獲得(參見例如Morimoto等人,J Biochem Biophys. Method. 24 :107-117 (1992)；及Brennan等人,Science 229 :81 (1985))。然而，現可由重組宿主細胞直接產生此等片段。Fab、Fv及scFv抗體片段皆可表現於大腸桿菌中且自其分泌，因而允許輕易產生大量此等片段。亦可自以上所論述之抗體噬菌體庫中分離抗體片段。替代地，可直接自大腸桿菌回收Fab'-SH片段並且化學偶聯以形成F(ab')2 片段(Carter等人,Bio/Technology 10 :163-167 (1992))。根據另一方法，可自重組宿主細胞培養物直接分離F(ab')2 片段。具有增加之活體內半衰期的Fab及F(ab')2 描述於美國專利第5,869,046號中。在其他實施例中，所選抗體爲單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利第5,571,894號及美國專利第5,587,458號。抗體片段亦可爲「線性抗體」，例如，如美國專利5,641,870中所描述。此種線性抗體片段可爲單特异性或雙特异性的。6. 雙特異性及多特異性抗體。
雙特異性抗體(BsAb)爲對至少兩個不同的抗原決定基，包括相同或另一蛋白質上之彼等抗原決定基具有結合特异性之抗體。替代地，一個臂可結合至靶抗原，而另一臂可與結合至白血球上之觸發分子，諸如T細胞受體分子(例如CD3)或IgG之Fc受體(FcγR)，諸如FcγR1 (CD64)、FcγRII (CD32)及FcγRIII (CD16)的臂組合，以便使細胞防禦機制聚焦並局部化至表現靶抗原之細胞。此種抗體可來源於全長抗體或抗體片段(例如，F(ab')2 雙特異性抗體)。
雙特异性抗體亦可用於將細胞毒劑局部化至表現靶抗原之細胞。此種抗體具有結合所要抗原之一個臂及結合細胞毒性劑(例如肥皂草素、抗幹擾素-a、長春花生物鹼、篦麻毒素A鏈、胺甲喋呤或放射性同位素半抗原)之另一臂。已知雙特异性抗體之實例包括抗ErbB2/抗FcgRIII (WO 96/16673)、抗ErbB2/抗FcgRI (美國專利5,837,234)、抗ErbB2/抗CD3 (美國專利5,821,337)。
用於製造雙特异性抗體之方法在此項技術中爲已知的。全長雙特異性抗體之傳統產生係基於共表現兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈配對，其中兩個鏈具有不同的特異性。Millstein等人,Nature ,305 :537-539 (1983)。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分類，此等雜交瘤(四源雜交瘤)可產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中仅一種具有正確雙特異性結構。通常通過親和層析步驟進行之正確分子純化相當麻煩，且產物產率低。類似程序揭示於WO 93/08829及Traunecker等人,EMBO J. ,10 :3655-3659 (1991)中。
根據不同的方法，使具有所要結合特異性之抗體可變域(抗體-抗原結合位點)與免疫球蛋白恆定域序列融合。在一些實施例中，與包含鉸鏈、CH2及CH3區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈恆定域融合。在一些實施例中，含有輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恒定區(CH1)存在於至少一個融合物中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及(需要時)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入至個別表現載體中，並共轉染至適合之宿主生物体中。此在構築中所使用之三個多肽鏈之不相等比率提供最佳產率時在調節實施例中之三個多肽片段之相互比例方面提供巨大靈活性。然而，當至少兩個多肽鏈以相等比率表現導致高產量時或當比率不特別重要時，有可能在一個表現載體中插入兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列。
在一些實施例中，雙特异性抗體由一個臂中之具有第一結合特异性之混雜免疫球蛋白重鏈及另一臂中之混雜免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特异性)構成。發現此不對稱結構有助於分離所要雙特異性化合物與不需要之免疫球蛋白鏈組合，因為僅一半雙特異性分子中存在免疫球蛋白輕鏈提供容易的分離途径。此方法揭示於WO 94/04690中。關於產生雙特異性抗體之更多細節，參見例如Suresh等人,Methods in Enzymology 121 :210 (1986)。
根據WO 96/27011或美國專利5,731,168中所描述之另一方法，可對成對抗體分子之間的界面進行工程化以使自重組細胞培養物回收之异二聚體的百分比最大化。在一些實施例中，该界面包含抗體恆定域之CH3區之至少一部分。在此方法中，來自第一抗體分子之界面之一或多個小胺基酸側鏈置換爲較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)。藉由將大胺基酸側鏈置換爲較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或酥胺酸)在第二抗體分子之界面上產生與大側鏈具有一致或類似大小之互補「凹穴」。此提供增高異二聚體产率超過其他不需要之最終產物(诸如同二聚體)的機制。
由抗體片段產生雙特異性抗體之技術已描述於文獻中。舉例而言，可使用化學連接來製備雙特異性抗體。Brennan等人,Science 229 :81 (1985)描述其中完整抗體經蛋白水解切割以產生F(ab')2 片段之程序。在二硫醇複合劑亞砷酸鈉存在下還原此等片段，以穩定鄰位二硫醇並防止分子間二硫键形成。隨後將所產生之Fab'片段轉化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。隨後將Fab'-TNB衍生物之一再轉化為Fab'-TNB衍生物以形成雙特異性抗體。所產生之雙特异性抗體可用作選擇性酶固定劑。
可直接自大腸桿菌回收Fab'片段並化學偶聯以形成雙特異性抗體。Shalaby等人,J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)描述完全人類化雙特異性抗體F(ab')2 分子之產生。各Fab'片段分別由大腸桿菌分泌，並且在活體外進行定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。因而形成之雙特異性抗體能夠結合至過度表現ErbB2受體之細胞及正常人類T細胞，以及觸發人類細胞毒性淋巴細胞對人類乳房腫瘤標靶之溶解活性。
亦已描述用於直接由重組細胞培養物製備並分離二價抗體片段的各種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生二價異二聚體。Kostelny等人,J. Immunol. ,148 (5):1547-1553 (1992)。藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽連接至兩個不同抗體之Fab'部分。將抗體同二聚體在鉸鏈區還原以形成單體，隨後再氧化以形成抗體異二聚體。Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,90 :6444-6448 (1993)所描述之「雙功能抗體」技術提供用于製造雙特异性/二價抗體片段之替代機制。該等片段包含藉由因過短而不允許同一鏈上之兩個結構域之間發生配對的連接子連接至輕鏈可變域(VL )之重鏈可變域(VH )。因此，促使一個片段之VH 及VL 結構域與另一片段之互補VL 及VH 結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。亦已報導藉由使用單鏈Fv (scFv)二聚體產生雙特異性/二價抗體片段的另一策略。參見Gruber等人,J. Immunol. ,152 :5368 (1994)。
涵蓋超過二價之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人,J. Immunol. 147 : 60 (1991)。
例示性雙特異性抗體可結合至指定分子上之兩個不同的抗原決定基。替代地，抗蛋白质臂可與結合至白血球上之觸發分子，諸如IgG之T細胞受體分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)或Fc受體(FcγR)，諸如FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)及FcγRIII (CD16)的臂組合，以便將細胞防禦機制聚焦至表現特定蛋白质之細胞。雙特异性抗體亦可用於將細胞毒劑局部化至表現特定蛋白質之細胞。此種抗體具有蛋白質結合臂及結合細胞毒性劑或放射性核種螯合劑，諸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。另一相關雙特異性抗體結合相關蛋白質，並進一步結合組織因子(TF)。 調配物
本文中提供包含多肽及表面活性劑之液體調配物。本文中所描述之任何表面活性劑皆可用於該液體調配物中。在一些實施例中，該液體調配物中之表面活性劑的濃度為該液體調配物之約0.0005%至0.2%、約0.0005%至0.001%、約0.001%至0.002%、約0.002%至0.003%、約0.003%至0.004%、約0.004%至0.005%、約0.005%至0.006%、約0.006%至0.007%、約0.007%至0.008%、約0.008%至0.009%、約0.009%至0.01%、約0.01%至0.015%、約0.015%至0.02%、約0.02%至0.025%、約0.025%至0.03%、約0.03%至0.035%、約0.035%至0.04%、約0.04%至0.045%、約0.045%至0.05%、約0.05%至0.055%、約0.055%至0.06%、約0.06%至0.065%、約0.065%至0.07%、約0.07%至0.075%、約0.075%至0.08%、約0.08%至0.085%、約0.085%至0.09%、約0.09%至0.095%、約0.095%至0.1%、約0.1%至0.11%、約0.11%至0.12%、約0.12%至0.13%、約0.13%至0.14%、約0.14%至0.15%、約0.15%至0.16%、約0.16%至0.17%、約0.17%至0.18%、約0.18%至0.19%、約0.19%至0.2%、約0.0005%至0.01%、約0.01%至0.02%、約0.02%至0.03%、約0.03%至0.04%、約0.04%至0.05%、約0.05%至0.06%、約0.06%至0.07%、約0.07%至0.08%、約0.08%至0.09%、約0.09%至0.1%、約0.1%至0.12%、約0.12%至0.14%、約0.14%至0.16%、約0.16%至0.18%、約0.18%至0.2%或約0.0005%至0.02%(w:v)。
在一些實施例中，該液體調配物中之異山梨醇POE脂肪酸酯的濃度為該液體調配物之約0.00035%至0.2%、約0.00035%至0.0005%、約0.0005%至0.001%、約0.001%至0.002%、約0.002%至0.003%、約0.003%至0.004%、約0.004%至0.005%、約0.005%至0.006%、約0.006%至0.007%、約0.007%至0.008%、約0.008%至0.009%、約0.009%至0.01%、約0.01%至0.015%、約0.015%至0.02%、約0.02%至0.025%、約0.025%至0.03%、約0.03%至0.035%、約0.035%至0.04%、約0.04%至0.045%、約0.045%至0.05%、約0.05%至0.055%、約0.055%至0.06%、約0.06%至0.065%、約0.065%至0.07%、約0.07%至0.075%、約0.075%至0.08%、約0.08%至0.085%、約0.085%至0.09%、約0.09%至0.095%、約0.095%至0.1%、約0.1%至0.11%、約0.11%至0.12%、約0.12%至0.13%、約0.13%至0.14%、約0.14%至0.15%、約0.15%至0.16%、約0.16%至0.17%、約0.17%至0.18%、約0.18%至0.19%、約0.19%至0.2%、約0.00035%至0.01%、約0.01%至0.02%、約0.02%至0.03%、約0.03%至0.04%、約0.04%至0.05%、約0.05%至0.06%、約0.06%至0.07%、約0.07%至0.08%、約0.08%至0.09%、約0.09%至0.1%、約0.1%至0.12%、約0.12%至0.14%、約0.14%至0.16%、約0.16%至0.18%、約0.18%至0.2%或約0.00035%至0.14%(w:v)。
該液體調配物中之多肽的濃度可基於儲存配置及所要投與途徑(例如皮下、肌肉內或玻璃體內投與、靜脈內注射或輸注等)而變化。在一些實施例中，該液體調配物中之多肽的濃度為約0.1 mg/mL至300 mg/mL、約0.1 mg/mL至0.5 mg/mL、約0.5 mg/mL至1 mg/mL、約1 mg/mL至1.5 mg/mL、約1.5 mg/mL至2 mg/mL、約2 mg/mL至2.5 mg/mL、約2.5 mg/mL至3 mg/mL、約3 mg/mL至3.5 mg/mL、約3.5 mg/mL至4 mg/mL、約4 mg/mL至4.5 mg/mL、約4.5 mg/mL至5 mg/mL、約0.1 mg/mL至1 mg/mL、約1 mg/mL至2 mg/mL、約2 mg/mL至3 mg/mL、約3 mg/mL至4 mg/mL、約4 mg/mL至5 mg/mL、約5 mg/mL至10 mg/mL、約10 mg/mL至15 mg/mL、約15 mg/mL至20 mg/mL、約20 mg/mL至30 mg/mL、約30 mg/mL至40 mg/mL、約40 mg/mL至50 mg/mL、約50 mg/mL至100 mg/mL、約100 mg/mL至150 mg/mL、約150 mg/mL至200 mg/mL、約200 mg/mL至250 mg/mL、約250 mg/mL至300 mg/mL、約0.1 mg/mL至2 mg/mL、約0.5 mg/mL至2 mg/mL、約50 mg/mL至150 mg/mL、約150 mg/mL至200 mg/mL或200 mg/mL至300 mg/mL。在一些實施例中，該液體調配物中之多肽的濃度為約0.5 mg/mL。在一些實施例中，該液體調配物中之多肽的濃度大於約50 mg/mL、大於約150 mg/mL、大於約200 mg/mL、大於約250 mg/mL或大於約300 mg/mL。在一些實施例中，可稀釋該液體調配物以使多肽濃度降低約1-5倍、約5-10倍、約10-15倍、約15-20倍、約20-30倍、約30-40倍、約40-50倍、約50-100倍、約100-150倍、約150-200倍、約200-300倍、約300-400倍、約400-500倍、約500-600倍、約600-700倍、約700-800倍、約800-900倍、約900-1000倍、約1000-1500倍、約1500-2000倍、約2000-2500倍、約2500-3000倍或約3000-5000倍。
在一些實施例中，用輸注溶液稀釋該液體調配物。在一些實施例中，該輸注溶液包括但不限于含葡萄糖之溶液、乳酸化林格氏溶液(Ringer’s solution)、生理鹽水、半生理鹽水或緩衝生理鹽水。在一些實施例中，該生理鹽水為標稱生理鹽水(約0.9% (w:v))。在一些實施例中，該生理鹽水為等滲生理鹽水。在一些實施例中，該生理鹽水為緩衝生理鹽水，包括但不限於磷酸鹽緩衝生理鹽水或克雷伯氏-林格氏溶液(Krebs-Ringer’s solution)。在一些實施例中，該生理鹽水與來自個體之血液之滲透壓等滲或近似等滲。該生理鹽水包括鹽，諸如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂或氯化鈣。在一些實施例中，該生理鹽水包括一或多種緩沖液，諸如磷酸鹽緩沖液(諸如磷酸鈉或磷酸鉀)、碳酸鈉或HEPES。當使用緩衝生理鹽水時，pH保持在使該多肽之治療效果最佳化的範圍內，尤其在其穩定性具pH依賴性時。A. 凍乾調配物
在一些實施例中，本文中所描述之液體調配物亦可製備為復原之凍乾調配物。可將本文中所描述之多肽凍乾，隨後復原以產生該液體調配物。在一些實施例中，在如以上所描述製備相關蛋白質之後，產生「預凍乾調配物」。在一些實施例中，該復原調配物中之多肽濃度高於該預凍乾調配物中之多肽濃度。在一些實施例中，該復原調配物中之多肽濃度低於該預凍乾調配物中之多肽濃度。考慮所要劑量體積、投與模式等來確定該預凍乾液體調配物及該復原液體調配物中存在之多肽濃度。1. 凍乾調配物之製備。
當製備凍乾調配物時，欲調配之蛋白質一般存在於溶液中。舉例而言，在本發明之升高離子強度降低黏度調配物中，蛋白質可存在於pH爲約4-8且較佳爲約5-7之pH緩衝溶液中。緩衝液濃度可為約1 mM至約20 mM，或者約3 mM至約15 mM，視例如緩衝液及調配物(例如復原調配物)之所要張力而定。例示性緩衝液及/或鹽為醫藥學上可接受者，且可由適合之酸、鹼及其鹽產生，諸如「醫藥學上可接受之」酸、鹼或緩衝液下所定義者。
在一些實施例中，向該預凍幹調配物中添加凍幹保護劑。該預凍幹調配物中之凍幹保護劑之量一般使得復原後所得調配物將爲等滲的。然而，高滲復原調配物亦可爲適合的。另外，凍乾保護劑之量不能過低而使得凍乾後出現不可接受之量的蛋白質降解/聚集。然而，該預凍乾調配物中之例示性凍乾保護劑濃度為約10 mM至約400 mM，或者約30 mM至約300 mM，或者約50 mM至約100 mM。例示性凍乾保護劑包括糖及糖醇，諸如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇及甘露醇。然而，在特定情況下，某些凍乾保護劑亦可能有助於增加調配物之黏度。因而，應謹慎選擇最小化或中和此作用之特定凍乾保護劑。上文在「凍乾保護劑」之定義下描述之其他凍乾保護劑在本文中亦稱為「醫藥學上可接受之糖」。
蛋白質與凍乾保護劑之比率可針對各特定蛋白質或抗體及凍乾保護劑組合而變化。在以抗體作為所選蛋白質且以糖(例如蔗糖或海藻糖)作為凍乾保護劑以產生具有高蛋白質濃度之等滲復原調配物的情況下，凍乾保護劑與抗體之莫耳比可為約100至約1500莫耳凍乾保護劑對1莫耳抗體，或約200至約1000莫耳凍乾保護劑對1莫耳抗體，例如約200至約600莫耳凍乾保護劑對1莫耳抗體。
本文中之調配物亦可在所治療之特定適應症必需時含有超過一種蛋白質，諸如具有不會不利地影響其他蛋白質之互補活性的蛋白質。舉例而言，可能需要在單一調配物中提供兩種或更多種結合至所要標靶(例如受體或抗原)的抗體。此種蛋白質以對預定目的有效之量適當地存在於組合中。
用於活體內投與之調配物必須為無菌的。此可在凍乾及復原前後藉由經無菌過濾膜過濾容易地實現。替代地，整個混合物之無菌性可藉由例如在約120℃下將除蛋白質以外的成分高壓釜處理約30分鐘來實現。
在蛋白質、可選凍乾保護劑及其他可選組分混合在一起之後，將調配物凍乾。許多不同的冷凍乾燥機可用於此目的，諸如Hull50™ (Hull，USA)或GT20™ (Leybold-Heraeus，Germany)冷凍乾燥機。冷凍乾燥係藉由將調配物冷凍且隨後在適合初步乾燥之溫度下使冰自冷凍成分昇華來實現。在此條件下，產物溫度低於調配物之共熔點或塌陷溫度。在通常在約50至250毫托之範圍內的適合壓力下，初步乾燥之貨架溫度通常將在約-30至25℃之範圍內(條件為產物在初步乾燥期間保持冷凍)。調配物、容納樣品之容器(例如玻璃小瓶)之大小及類型以及液體之體積將主要指示乾燥所需之時間，該時間可在數小時至數天(例如40-60小時)之範圍內。視情況，亦可根據產物中之所要殘餘水分水准進行二次乾燥階段。進行二次乾燥之溫度在約0-40℃之範圍內，主要視容器之類型及大小以及所採用之蛋白質的類型而定。舉例而言，貫穿凍乾之整個水移除階段之貨架溫度可為約15-30℃ (例如約20℃)。二次乾燥所需之時間及壓力將為視例如溫度及其他參數而產生適合凍乾餅之時間及壓力。二次乾燥時間由產物中之所要殘餘水分水准決定，且通常需要至少約5小時(例如10-15小時)。壓力可與初步乾燥步驟中所採用之壓力相同。冷凍乾燥條件可視調配物及小瓶大小而變化。2. 凍乾調配物之製備。
在投與患者之前，將凍乾調配物用醫藥學上可接受之稀釋劑復原，使得復原調配物中之蛋白質濃度為至少約50 mg/mL，例如約50 mg/mL至約400 mg/mL、或者約80 mg/mL至約300 mg/mL、或者約90 mg/mL至約150 mg/mL。在意欲皮下遞送復原調配物時，復原調配物中之此種高蛋白質濃度被視為特別有用。然而，對於其他投與途徑，諸如靜脈內投與，可能需要復原調配物中之較低蛋白質濃度(例如復原調配物中之約0.1-2 mg/mL、約2-10 mg/mL、或約10-50 mg/mL蛋白質)。在某些實施例中，復原調配物中之蛋白質濃度顯著高於預凍乾調配物中之蛋白質濃度。在某些實施例中，復原調配物中之蛋白質濃度顯著低於預凍乾調配物中之蛋白質濃度。
復原一般在約25℃之溫度下進行以確保完全水合，但需要時可採用其他溫度。復原所需之時間將視例如稀釋劑之類型、賦形劑之量及蛋白質而定。例示性稀釋劑包括無菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝生理鹽水)、無菌生理鹽水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。稀釋劑視情況含有防腐劑。以上已描述例示性防腐劑，其中芳族醇，諸如苯甲醇或酚醇為較佳防腐劑。藉由評定不同的防腐劑濃度與蛋白質之相容性及防腐效力測試來確定防腐劑之用量。舉例而言，若防腐劑为芳族醇(例如苯甲醇)，則其可以約0.1-2.0%、或約0.5-1.5%、或約1.0-1.2%之量存在。
在一些實施例中，該液體調配物(包括但不限於復原液體調配物)實質上不含聚集物。在一些實施例中，該液體調配物(包括但不限於復原液體調配物)包含較低游離脂肪酸粒子形成。III. 製造液體調配物之方法
本文中亦提供用於製造液體調配物之方法，該等方法包括將多肽及表面活性劑添加至水溶液中，其中該表面活性劑包含一或多種聚山梨醇酯組分。
在一些實施例中，該表面活性劑包含異山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑進一步包含POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該等異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯獨立地具有約5至30個POE單元。在一些實施例中，該等異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯獨立地具有獨立地選自由視情況經取代之C4-28 烷基及視情況經取代之C4-28 烯基組成之群的脂肪酸鏈。在一些實施例中，該等異山梨醇POE脂肪酸酯為式(I)化合物。在一些實施例中，至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99% (wt%)之該表面活性劑为異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該等異山梨醇POE脂肪酸酯係選自由以下組成之群：異山梨醇POE單己酸酯、異山梨醇POE單辛酸酯、異山梨醇POE單癸酸酯、異山梨醇POE單月桂酸酯、異山梨醇POE單肉豆蔻酸酯、異山梨醇POE單棕櫚酸酯、異山梨醇POE單棕櫚油酸酯、異山梨醇POE單硬脂酸酯、異山梨醇POE單油酸酯、異山梨醇POE單亞麻油酸酯、異山梨醇POE單次亞麻油酸酯及前述各物之組合。在一些實施例中，該等POE脂肪酸酯係選自由以下組成之群：POE單己酸酯、POE單辛酸酯、POE單癸酸酯、POE單月桂酸酯、POE單肉豆蔻酸酯、POE單棕櫚酸酯、POE單棕櫚油酸酯、POE單硬脂酸酯、POE單油酸酯、POE單亞麻油酸酯、POE單次亞麻油酸酯及前述各物之組合。在一些實施例中，該表面活性劑包含異山梨醇POE單月桂酸酯及POE單月桂酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑包含異山梨醇POE單棕櫚酸酯及POE單棕櫚酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑包含異山梨醇POE單肉豆蔻酸酯及POE單肉豆蔻酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑包含異山梨醇POE單油酸酯及POE單油酸酯。在一些實施例中，該表面活性劑包含異山梨醇POE單亞麻油酸酯及POE單亞麻油酸酯。
在一些實施例中，該表面活性劑進一步包含去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，該等去水山梨醇POE脂肪酸酯獨立地具有獨立地選自由視情況經取代之C4-28 烷基及視情況經取代之C4-28 烯基組成之群的脂肪酸鏈。在一些實施例中，該等去水山梨醇POE脂肪酸酯為式(II)化合物。在一些實施例中，少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或少於約1% (wt%)之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少1% (wt%)之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少5% (wt%)之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少10% (wt%)之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。在一些實施例中，至少15% (wt%)之該表面活性劑為去水山梨醇POE脂肪酸酯。
在一些實施例中，各去水山梨醇POE脂肪酸酯獨立地選自由以下組成之群：去水山梨醇POE單己酸酯、去水山梨醇POE單辛酸酯、去水山梨醇POE單癸酸酯、去水山梨醇POE單月桂酸酯、去水山梨醇POE單肉荳蔻酸酯、去水山梨醇POE單棕櫚酸酯、去水山梨醇POE單棕櫚油酸酯、去水山梨醇POE單硬脂酸酯、去水山梨醇POE單油酸酯、去水山梨醇POE單亞麻油酸酯、去水山梨醇POE單次亞麻油酸酯、去水山梨醇POE二己酸酯、去水山梨醇POE二辛酸酯、去水山梨醇POE二癸酸酯、去水山梨醇POE二月桂酸酯、去水山梨醇POE二肉荳蔻酸酯、去水山梨醇POE二棕櫚酸酯、去水山梨醇POE二棕櫚油酸酯、去水山梨醇POE二硬脂酸酯、去水山梨醇POE二油酸酯、去水山梨醇POE二亞麻油酸酯、去水山梨醇POE二次亞麻油酸酯、去水山梨醇POE三己酸酯、去水山梨醇POE三辛酸酯、去水山梨醇POE三癸酸酯、去水山梨醇POE三月桂酸酯、去水山梨醇POE三肉荳蔻酸酯、去水山梨醇POE三棕櫚酸酯、去水山梨醇POE三棕櫚油酸酯、去水山梨醇POE三硬脂酸酯、去水山梨醇POE三油酸酯、去水山梨醇POE三亞麻油酸酯及去水山梨醇POE三次亞麻油酸酯。
本文中所描述之任何表面活性劑皆可用於製造液體調配物之方法中。
在一些實施例中，該液體調配物中之表面活性劑的濃度為該液體調配物之約0.0005%至0.2%、約0.0005%至0.001%、約0.001%至0.002%、約0.002%至0.003%、約0.003%至0.004%、約0.004%至0.005%、約0.005%至0.006%、約0.006%至0.007%、約0.007%至0.008%、約0.008%至0.009%、約0.009%至0.01%、約0.01%至0.015%、約0.015%至0.02%、約0.02%至0.025%、約0.025%至0.03%、約0.03%至0.035%、約0.035%至0.04%、約0.04%至0.045%、約0.045%至0.05%、約0.05%至0.055%、約0.055%至0.06%、約0.06%至0.065%、約0.065%至0.07%、約0.07%至0.075%、約0.075%至0.08%、約0.08%至0.085%、約0.085%至0.09%、約0.09%至0.095%、約0.095%至0.1%、約0.1%至0.11%、約0.11%至0.12%、約0.12%至0.13%、約0.13%至0.14%、約0.14%至0.15%、約0.15%至0.16%、約0.16%至0.17%、約0.17%至0.18%、約0.18%至0.19%、約0.19%至0.2%、約0.0005%至0.01%、約0.01%至0.02%、約0.02%至0.03%、約0.03%至0.04%、約0.04%至0.05%、約0.05%至0.06%、約0.06%至0.07%、約0.07%至0.08%、約0.08%至0.09%、約0.09%至0.1%、約0.1%至0.12%、約0.12%至0.14%、約0.14%至0.16%、約0.16%至0.18%、約0.18%至0.2%或約0.0005%至0.02%(w:v)。
該液體調配物中之多肽的濃度可基於儲存配置及所要投與途徑(例如皮下、肌肉內或玻璃體內投與、靜脈內注射或輸注等)而變化。在一些實施例中，該液體調配物中之多肽的濃度為約0.1 mg/mL至300 mg/mL、約0.1 mg/mL至0.5 mg/mL、約0.5 mg/mL至1 mg/mL、約1 mg/mL至1.5 mg/mL、約1.5 mg/mL至2 mg/mL、約2 mg/mL至2.5 mg/mL、約2.5 mg/mL至3 mg/mL、約3 mg/mL至3.5 mg/mL、約3.5 mg/mL至4 mg/mL、約4 mg/mL至4.5 mg/mL、約4.5 mg/mL至5 mg/mL、約0.1 mg/mL至1 mg/mL、約1 mg/mL至2 mg/mL、約2 mg/mL至3 mg/mL、約3 mg/mL至4 mg/mL、約4 mg/mL至5 mg/mL、約5 mg/mL至10 mg/mL、約10 mg/mL至15 mg/mL、約15 mg/mL至20 mg/mL、約20 mg/mL至30 mg/mL、約30 mg/mL至40 mg/mL、約40 mg/mL至50 mg/mL、約50 mg/mL至100 mg/mL、約100 mg/mL至150 mg/mL、約150 mg/mL至200 mg/mL、約200 mg/mL至250 mg/mL、約250 mg/mL至300 mg/mL、約0.1 mg/mL至2 mg/mL、約0.5 mg/mL至2 mg/mL、約50 mg/mL至150 mg、約150 mg/mL至200 mg/mL或200 mg/mL至300 mg/mL。在一些實施例中，該液體調配物中之多肽的濃度為約0.5 mg/mL。在一些實施例中，該液體調配物中之多肽的濃度大於約50 mg/mL、大於約150 mg/mL、大於約200 mg/mL、大於約250 mg/mL或大於約300 mg/mL。
在一些實施例中，該方法進一步包括稀釋該液體調配物以使多肽濃度降低約1-5倍、約5-10倍、約10-15倍、約15-20倍、約20-30倍、約30-40倍、約40-50倍、約50-100倍、約100-150倍、約150-200倍、約200-300倍、約300-400倍、約400-500倍、約500-600倍、約600-700倍、約700-800倍、約800-900倍、約900-1000倍、約1000-1500倍、約1500-2000倍、約2000-2500倍、約2500-3000倍或約3000-5000倍。在一些實施例中，該方法進一步包括用輸注溶液稀釋該液體調配物。在一些實施例中，該輸注溶液包括但不限于含葡萄糖之溶液、乳酸化林格氏溶液、生理鹽水、或緩衝生理鹽水。在一些實施例中，該生理鹽水為標稱生理鹽水(約0.9% (w:v))。在一些實施例中，該生理鹽水為等滲生理鹽水。在一些實施例中，該生理鹽水為緩衝生理鹽水，包括但不限於磷酸鹽緩衝生理鹽水或克雷伯氏-林格氏溶液。在一些實施例中，該生理鹽水與來自個體之血液之滲透壓等滲或近似等滲。該生理鹽水包括鹽，諸如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂或氯化鈣。在一些實施例中，該生理鹽水包括一或多種緩沖液，諸如磷酸鹽緩沖液(諸如磷酸鈉或磷酸鉀)、碳酸鈉或HEPES。當使用緩衝生理鹽水時，pH保持在使多肽之治療效果最優化的範圍內，尤其在其穩定性具pH依賴性時。在一些實施例中，在投與個體之前稀釋該液體調配物。
當藉由复原冻干调配物來製備該液體調配物時，復原一般在約25℃之溫度下進行以確保完全水合，但需要時可採用其他溫度。復原所需之時間將視例如稀釋劑之類型、賦形劑之量及多肽而定。例示性稀釋劑包括無菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝生理鹽水)、無菌生理鹽水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。稀釋劑視情況含有防腐劑。
在一些實施例中，該方法中所使用之多肽為抗體。在一些實施例中，該抗體為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、嵌合抗體或異源結合抗體。在一些實施例中，該抗體包括抗體片段及完整抗體。在一些實施例中，該抗體片段係選自由Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段組成之群。
在另一態樣中，該等方法可用於製備本文中所描述之任何液體調配物。IV. 製品
本文中提供包括封裝液體調配物之容器的製品，其中該液體調配物包含多肽及表面活性劑，其中該表面活性劑包含一或多種聚山梨醇酯組分。
該製品包括容器。適合之容器包括但不限於瓶、小瓶(例如雙室小瓶)、注射器(例如單室或雙室注射器)、試管及靜脈內治療(IV)袋。在一些實施例中，該IV袋包括輸注溶液。在一些實施例中，該輸注溶液包括但不限于含葡萄糖之溶液、乳酸林格氏溶液、生理鹽水、或緩衝生理鹽水。該容器可由多種材料形成，諸如玻璃、金屬合金(例如不銹鋼)或塑膠。處於該容納液體調配物之容器上或與之相關聯的標籤可指示復原及/或使用指南。在一些實施例中，該標籤可進一步指示調配物可用於或意欲用於皮下投與。在一些實施例中，該標籤可進一步指示調配物可用於或意欲用於靜脈內投與(例如作為藥團或藉由在一段時間內連續輸注、藉由肌肉內、腹膜內、脑脊液內、皮下、關節內、滑膜內、或鞘內投與)。在一些實施例中，該標籤可進一步指示該調配物可用於或意欲用於玻璃體內投與。該容納調配物之容器可為多次使用小瓶，其允許重複投與(例如2-6次投與)液體調配物。在一些實施例中，該製品包含濃度為約0.1 mg/mL至約300 mg/mL之多肽。該製品可進一步包括第二容器，該第二容器包含適合之稀釋劑(例如水、調配緩衝液、表面活性劑溶液及輸注溶液，諸如含葡萄糖之溶液、生理鹽水、乳酸林格氏溶液及BWFI)。在將該稀釋劑與該液體調配物混合後，經稀釋之調配物中之最終蛋白質濃度一般將為至少0.001 mg/mL。在一些實施例中，將該稀釋劑與凍乾調配物混合以形成復原液體調配物。在一些實施例中，該液體調配物(包括該復原液體調配物)中之最終蛋白質濃度為約0.5 mg/mL至約2 mg/mL。該製品可進一步包括自商業及使用者觀點看來合乎需要之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器及帶有使用說明書之包裝插頁。在一些實施例中，該製品含有用於靜脈內投與之注射器或設備，及/或用於製備凍乾組合物以供投與之無菌緩衝溶液。
在另一態樣中，該製品可含有本文中所描述之任何液體調配物。在另一態樣中，該製品可含有根據本文中所描述之任何製造方法製備之液體調配物。V. 使用液體調配物之藥物及治療方法
本文中亦提供用於治療個體之疾病或病症的方法，該等方法包括向有需要之個體投與有效量之本文中所描述之液體調配物。本文中亦提供本文中所描述之液體調配物在製備用於治療需要用液體調配物中之多肽治療之患者的藥物中的用途。亦提供如本文中所描述之液體調配物以用於治療需要用該液體調配物中之多肽治療之個體的疾病或病症。亦提供如本文中所描述之液體調配物以用於治療患者，包括向该患者投與有效量之該液體調配物。
在調配物中之抗體結合至HER2時，可使用懸浮液調配物治療癌症。該癌症一般將包含表現HER2之細胞，使得本文中之HER2抗體能夠結合至癌細胞。因而，本發明在此實施例中係關於一種用於治療個體之表現HER2之癌症的方法，該方法包括以對治療癌症有效的量向該個體投與HER2抗體醫藥調配物。本文中欲用HER2抗體(例如曲妥珠單抗(trastuzumab)或帕妥珠單抗(pertuzumab))治療之例示性癌症為HER2陽性乳癌或胃癌。
在調配物中之抗體結合至B細胞表面標記物(諸如CD20)時，該調配物可用於治療B細胞惡性腫瘤，諸如NHL或CLL，或者自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎或血管炎)。
在調配物中之抗體結合VEGF (例如貝伐珠單抗(bevacizumab))時，該調配物可用於抑制血管生成、治療癌症(諸如結腸直腸癌、非小細胞肺癌(NSCL)、膠質母細胞瘤、乳癌及腎細胞癌)，或治療年齡相關性黃斑變性(AMD)或黃斑水腫。
在適應症為癌症時，可用懸浮液調配物與化學治療劑之組合治療患者。組合投與包括使用單獨調配物或單一醫藥調配物共同投與或同時投與，以及以任一順序連續投與，其中有兩種(或所有)活性劑同時發揮其生物活性的時間段。因而，化學治療劑可在投與組合物之前或之後投與。在此實施例中，至少一次投與化學治療劑與至少一次投與調配物之間的時間為約1個月或更短，或者約2週或更短。替代地，將化學治療劑及調配物于單一調配物或單獨調配物中同時投與患者。
用懸浮液調配物治療將改良疾病或病症之病征或症狀。此外，用化學治療劑及抗體調配物之組合治療可對患者產生協同或超過加和治療益處。
在一些實施例中，經靜脈內投與本文中所描述之液體調配物。在一些實施例中，本文中所描述之液體調配物係藉由靜脈內注射以受控投與速率投與，使得投與發生至少約30分鐘或更久。給藥方案及實際投與劑量可視諸如感染性質及嚴重程度、患者之年齡、體重及總體健康狀況以及欲治療之疾病或病症之因素而變化，並且將可由健康專業人員確定。一次性或在一系列治療中將液體調配物適當地投與個體。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1 μg/kg至50 mg/kg (例如0.1-20 mg/kg)抗體為投與患者之初始候選劑量，無論是例如藉由一次或是多次單獨投與。抗體之劑量一般將為約0.05 mg/kg至約10 mg/kg。若投與化學治療劑，則其通常以已知劑量投與，或者由於藥物之組合作用或可歸因於化學治療劑之負面副作用而視情況降低。 實例
提供以下實例以說明而非限製本發明。熟習此項技術者應承認可使用普通熟習此項技術者已知的方法來修改以下程序。材料
單株抗體A至D係由Genentech公司(South San Francisco，CA，USA)制造。含有約99%月桂酸酯之聚山梨醇酯20係由BASF SE (Ludwigshafen，Germany)合成。聚山梨醇酯80 HX2超純級(含有約98%油酸酯)係由NOF America公司(Irvine，CA)合成。所有聚山梨醇酯樣品在不使用時皆在氮气覆盖下儲存在2-8℃下。乙腈及甲醇(HPLC級)係購自Avantor Performance Materials公司(Phillipsburg，NJ)。實例 1 聚山梨醇酯分級及分析 聚山梨醇酯分級
使用Gilson PLC-2050製備型HPLC系統進行聚山梨醇酯(PS)分級。對於所有PS樣品，將2公克聚山梨醇酯20 (PS20)或聚山梨醇酯80 (PS80)溶解于8 mL ＞18 MΩ·cm水中，並注入Waters X-Bridge BEH C4管柱(30×100 mm)上。隨後使用＞18 MΩ· cm水(移動相A)及乙腈(移動相B)之梯度對樣品進行分级。梯度條件為：0.0-3.0分鐘，5% B；3.0-20.0分鐘，5-100% B；20.0-27.0分鐘，100% B；27-27.1分鐘，100-5% B；27.1-30.0分鐘，5% B。流速為40 mL/min，總運作時間為30分鐘。在整個運作中收集25 mL級分。隨後使用如後續部分中所描述之逆相超高效液相層析方法与帶電氣溶膠偵測(RP-UHPLC-CAD)分析此等級分。分析後，匯集該等級分並使用旋轉蒸發儀乾燥。 聚山梨醇酯級分純度分析
使用配備有Thermo Corona Ultra CAD偵測器之Waters Acquity UPLC H-Class系統評定分級PS樣品之匯集及純度。所使用之管柱為Waters Acquity BEH C8管柱(2.1×50 mm，120 Å，2.5 μm粒徑)。梯度如下：0.0-0.5分鐘，5% B；0.5-5.0分鐘，5-100% B；5.0-6.0分鐘，100% B；6.0-6.1分鐘，100-5% B；6.1-8.0分鐘，5% B。進行CAD，在10 Hz及30℃霧化器溫度下進行資料收集。 結果
藉由旋轉蒸發儀純化並乾燥PS20及PS80級分。如藉由RP-UHPLC-CAD測定之其相對純度示于以下表1中。自各PS類型純化並分析三種級分。對於PS20，此等級分為：POE-去水山梨醇單月桂酸酯(「級分1或F1a」)、POE-異山梨醇單月桂酸酯及POE單月桂酸酯(N~10) (「級分2或F2a」)及POE-去水山梨醇二月桂酸酯(「級分3或F3a」)。對於PS80，該等級分為：POE-去水山梨醇單油酸酯(「級分1或F1b」)、POE-異山梨醇單油酸酯及POE單油酸酯(N~10) (「級分2或F2b」)及POE-去水山梨醇二油酸酯(「級分3或F3b」)。藉由LC-MS分析證實各級分之鑑定。逆相UHPLC-CAD分析證實最具疏水性之聚山梨醇酯級分為F3，繼而為F2，隨後為疏水性最低之F1 (圖 1A 及圖 1B )。表 1
酸 PS20 PS80
   USP/EP 說明 所有月桂酸酯PS20(定製材料) USP/EP 說明 來自來源B之所有油酸酯PS80
己酸(C6) 1.0 NT - -
辛酸(C8) ≤10.0% NT - -
癸酸(C10) ≤10.0% NT - -
月桂酸(C12) 40.0-60.0% ＞99% - -
肉荳蔻酸(C14) 14.0-25.0% NT 5.0 NT
棕櫚酸(C16) 7.0-15.0% NT ≤16.0% NT
棕櫚油酸(C16:1) - NT ≤8.0% NT
硬脂酸(C18) ≤7.0% NT ≤6.0% NT
油酸(C18:1) ≤11.0% NT ≥58.0% 98.9%
亞麻油酸(C18:2) ≤3.0% NT ≤18.0% NT
次亞麻油酸(C18:3) - - 4.0 NT
*NT：未測定實例 2 臨界微胞濃度 (CMC) 測定
使用螢光染料N-苯基萘-1-胺(NPN)評定經純化之PS級分的臨界微胞濃度(CMC)。藉由2倍連續稀釋至包含0.15 M氯化鈉、0.05 M TRIS、5% ACN、5 μM N-苯基-1-萘基胺及15 ppm Brij35 (pH 8.0)之稀釋劑中來進行此分析。立即在Molecular Devices Spectramax M5螢光讀板儀中分析樣品，激發為350 nm且發射為420 nm。
對於PS20，CMC增加順序為F3a＞F2a＞F1a，與疏水性順序一致。CMC相差較大，其中F1a為約0.1 wt%，F2a為約0.015 wt%，且F3a為約0.001 wt%，對應於自基線變化約500個螢光單位(圖 2A )。相比之下，儘管PS80酯CMC具有类似排序，但值範圍窄得多，僅跨越0.001至0.003 wt% (圖 2B )。實例 3 分級 PS 樣品之表面活性
使用Krüss (Hamburg，Germany) K100力張力計，使用粗糙鉑Wilhemy板測定經純化之PS級分的表面活性。在室溫(20-25℃)下在＞70%相對濕度下量測样品以防止蒸發。測試前將經純化之PS20級分各自溶解于純化水中達至0.2 mg/mL。將三毫升樣品置放在样品容器中，尤其注意不得引入氣泡。量測各樣品之表面張力變化直至60分鐘時達到平衡，每秒量測一次。PS80分析遵循相同程序。
表面張力結果顯示，平衡時，在相同濃度(0.02 wt%)下，PS20 F3a及F2a級分在降低表面張力方面比較低疏水性F1a級分明顯更有效(圖 3A )。對於PS80 F1b至F3b級分可見類似趨勢(圖 3B )。令人感興趣的是，PS20級分F3a之表面張力與F2a大致相同，而PS80級分F3b之表面張力同樣與F2b類似。此外，含有所有酯級分之未分級PS20使表面張力降低之程度甚至超過F3a或F2a級分(圖 3A )。相比之下，未分級PS80顯示介於其F1b與F3b級分之間的表面張力(圖 3B )。實例 4 微胞大小之動態光散射
在Malvern (Westborough，MA) Zetasizer Nano儀器上進行動態光散射(DLS)。藉由在水中將各級分樣品稀釋至最終濃度10 mg/mL進行量測，以便各級分皆高於CMC。
使用動態光散射(DLS)並使用1 wt%級分濃度獲得微胞半徑或流體動力學半徑(Rh )，其遠高於所研究之所有酯級分的CMC。對於PS20，未分級PS20之Rh 為約4 nm，且F2a及F3a級分為約3.9 nm。F1a單酯之Rh 稍小，為約3.5 nm (圖 4A )。對於PS80，未分級PS80樣品之微胞大小(Rh 約4.8 nm)同樣比Rh 類似(約4.5 nm)之F2b及F3b級分稍大。在PS80樣品組中，如同F1a，F1b之Rh 最小，但Rh (約4.3 nm)相差不大(圖 4B )。實例 5 攪拌保護研究
藉由使用攪拌研究來測試經純化之級分防止表面誘導性聚集之能力。在10 mL PETG小瓶中，在含不同量之各PS20級分(F1a、F2a及F3a為0.0001%至0.01%，w:v)的0.9%生理鹽水中將mAb A稀釋至0.5 mg/mL。在環境溫度下在軌道振盪器上以180 RPM將此等小瓶攪拌2小時。攪拌後，使用Bosch APK系統在10倍放大倍率及旋轉下觀察樣品。
在攪拌研究期間，觀察到F2a需要最低濃度以防止攪拌時形成可見粒子，而F1a需要最高濃度。F3a及所有月桂酸酯PS20產生类似之結果(圖 5 )。儘管F2a相對於F3a及所有月桂酸酯PS20具有較高CMC及相當平衡表面張力影響，但其最能保護mAb免受攪拌應力及粒子形成影響。實例 6  IV 袋攪拌模型研究
藉由使用攪拌研究來測試經純化之級分防止表面誘導性聚集之能力。在5 mL PETG小瓶中，在含不同量之各PS20級分(F1a、F2a及F3a為0.0001%至0.01%，w/v)的0.9%生理鹽水中用緩衝液將mAb B及mAb C稀釋至0.5 mg/mL。在環境溫度下在軌道振盪器上以180 RPM將樣品攪拌2小時。攪拌後，使用Bosch APK系統在10倍放大倍率及旋轉下觀察樣品。亦對樣品進行HIAC (高精確度流體粒子計數)以便對調配物中之SVP (亞可見粒子)進行定量，並且進行SEC-HPLC (粒徑排阻高效液相層析法)以便對調配物中之HMWF (高分子量級分)及活性抗體濃度進行定量。在具有二元泵及二極體陣列偵測器之Agilent 1260 HPLC上進行SEC及IEC。在來自Royco之HIAC 9703+醫藥粒子計數器上進行亞可見粒子量測。
觀察結果表明所有測試級分皆保護mAb B (圖 6A )及mAb C (圖 6B )。mAb B (圖 7A )及mAb C (圖 7B )之HIAC結果顯示所有級分皆能夠減少亞可見粒子之數目，指示較低聚集水準。F2a在降低聚集水準方面與HP或所有月桂酸酯PS20同樣良好或更佳。SEC-HPLC分析結果顯示所有級分皆降低HMWF% (圖 8A 及圖 8B )且在攪拌期間更佳地保留mAb B (圖 8A 及圖 9A )及mAb C (圖 8B 及圖 9B )二者之抗體調配物之可溶性級分(圖 9A 及圖 9B )。F2a在較低表面活性劑濃度下尤其有效(圖 8A 、圖 8B 、圖 9A 及圖 9B )。所有表面活性劑皆成功緩解蛋白質降解。實例 7 穩定性研究
測試含蛋白質mAb C及mAb D (各自為30 mg/mL)之PS20及F2a調配物(各自為0.02% w/v)的調配物長期穩定性。將調配物儲存在5℃、25℃及40℃下，並且在不同的間隔進行目視檢查(APK)、HIAC及SEC-HPLC。亦在5℃、25℃及40℃下對PS20及F2a調配物進行IEC。
儲存在40℃下之調配物的目視檢查指示在40℃下多達一個月時，兩種表面活性劑在限制mAb C (圖 10A )及mAb D (圖 10B )二者之調配物中之粒子形成方面皆為有效的。
儲存在40℃下之調配物的HIAC結果显示在40℃下，即使在儲存多達一個月時，兩種表面活性劑在限制mAb C (圖 11A )及mAb D (圖 11B )二者之調配物中之亞可見粒子形成方面皆為有效的。
儲存在40℃下之調配物的SEC-HPLC結果指示兩種表面活性劑在限制mAb C (圖 12A )及mAb D (圖 12B )二者之調配物中之聚集方面皆為有效的。SEC結果亦顯示在40℃下多達一個月時，兩種表面活性劑在維持mAb C (圖 13A )及mAb D (圖 13B )二者之調配物中之活性抗體濃度方面皆為有效的。
儲存在40℃下之調配物的IEC資料显示兩種表面活性劑皆限制mAb C降解，效果与在40℃下一個月時類似(圖 14 )。
儲存在25℃下之調配物的目视检查资料指示兩種表面活性劑在限制mAb C (圖 15A )及mAb D (圖 15B )調配物中之聚集方面皆爲有效的，多達3個月。
儲存在25℃下之調配物的HIAC結果显示在25℃下，即使在儲存多達3個月時，兩種表面活性劑在限制mAb C (圖 16A )及mAb D (圖 16B )二者之調配物中之亞可見粒子形成方面皆為有效的。
儲存在25℃下之調配物的SEC-HPLC結果指示兩種表面活性劑在限制mAb C (圖 17A )及mAb D (圖 17B )二者之調配物中之聚集方面皆為有效的。SEC結果亦顯示在25℃下多達3個月時，兩種表面活性劑在維持mAb C (圖 18A )及mAb D (圖 18B )二者之調配物中之活性抗體濃度方面皆為有效的。
儲存在25℃下之調配物的IEC資料显示兩種表面活性劑皆限制mAb C降解，效果与在25℃下3個月時類似(圖 19 )。
儲存在5℃下之調配物的目视检查资料指示兩種表面活性劑在防止mAb C (圖 20A )及mAb D (圖 20B )調配物中之聚集方面皆為有效的，多達3個月。
儲存在5℃下之調配物的HIAC結果显示在5℃下，即使在儲存多達3個月時，兩種表面活性劑在限制mAb C (圖 21A )及mAb D (圖 21B )二者之調配物中之亞可見粒子形成方面皆為有效的。
儲存在5℃下之調配物的SEC-HPLC結果指示兩種表面活性劑在限制mAb C (圖 22A )及mAb D (圖 22B )二者之調配物中之聚集方面皆為有效的。SEC結果亦顯示在5℃下多達3個月時，兩種表面活性劑在維持mAb C (圖 23A )及mAb D (圖 23B )二者之調配物中之活性抗體濃度方面皆為有效的。
儲存在5℃下之調配物的IEC資料显示兩種表面活性劑皆限制mAb C降解，效果与在5℃下3個月時類似(圖 24 )。實例 8 強制降解研究
藉由2.5 U/mL浓度之洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia )脂肪酶(PCL)對PS20及F2a (各自處於pH=6.0調配物緩衝液中)進行強制降解。對所得混合物進行HIAC，以便對亞可見粒子及完整表面活性劑百分比進行定量。結果指示儘管酶降解程度更大，但F2a產生較少SVP (圖 25 )。總結
已證明F2a與常用表面活性劑賦形劑PS20相比更能保護生物醫藥產物。此表面活性劑具有諸多有吸引力之特性，由此可使其成為傳統聚山梨醇酯(如PS20及PS80)之良好替代物。
在攪拌應力研究中，發現當使用APK進行測試時，F2a更能保護mAb A免受粒子形成影響。在一單獨研究中，基於藉由APK進行之粒子測試、藉由HIAC獲得之亞可見粒子計數、藉由SEC-HPLC獲得之HMWF%以及如藉由SEC-HPLC測試之可溶性抗體濃度，F2a显示F2a與HP PS20之間對mAb B及mAb C之攪拌應力保護类似。
在穩定性研究中，觀察到F2a與HP PS20在防止兩種mAb (mAb C及mAb D)之粒子形成(藉由APK及HIAC)方面类似地有效。就在5℃、25℃及40℃下储存期間防止mAb C及mAb D二者之HMWF (藉由SEC-HPLC)而言，F2a亦具有与HP PS20类似之保护作用。
在強制降解研究中，證明在形成亞可見及可見脂肪酸粒子之前，F2a之酶降解程度可能超過HP PS20。此提供F2a作為表面活性劑之優勢，亦即，不太傾向於此種類型之脂肪酸相關粒子形成。
圖 1A 及圖 1B 顯示聚山梨醇酯20級分(圖 1A )及聚山梨醇酯80級分(圖 1B )之純度及鑑定的UPLC分析。圖 2A 及圖 2B 顯示使用螢光染料N-苯基萘-1-胺(NPN)時聚山梨醇酯20級分(圖 2A )及聚山梨醇酯80級分(圖 2B )之臨界微胞濃度(CMC)。圖 3A 及圖 3B 顯示聚山梨醇酯20級分(圖 3A )及聚山梨醇酯80級分(圖 3B )之表面張力隨時間變化。圖 4A 及圖 4B 顯示聚山梨醇酯20級分(圖 4A )及聚山梨醇酯80級分(圖 4B )之微胞大小，其中各級分之濃度為1 wt%。圖 5 顯示含不同種濃度之聚山梨醇酯20級分之抗體調配物的影像。圖 6A 及圖 6B 顯示含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之抗體調配物的影像。圖 7A 及圖 7B 顯示含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之mAb B及mAB C抗體調配物的HIAC結果。圖 8A 、圖 8B 、圖 9A 及圖 9B 顯示含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之mAB B及mAb C抗體調配物的HIAC結果。圖 10A 及圖 10B 顯示在40℃下儲存不同時長之含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之抗體調配物的影像。圖 11A 及圖 11B 顯示在40℃下儲存之含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之mAB B及mAb C抗體調配物的HIAC結果。圖 12A 、圖 12B 、圖 13A 及圖 13B 顯示在40℃下儲存之含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之mAb B及mAb C抗體調配物的SEC-HPLC結果。圖 14 顯示在40℃下儲存之含聚山梨醇酯20級分之mAb B抗體調配物的IEC結果。圖 15A 及圖 15B 顯示在25℃下儲存不同時長之含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之抗體調配物的影像。圖 16A 及圖 16B 顯示在25℃下儲存之含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之mAb B及mAb C抗體調配物的HIAC結果。圖 17A 、圖 17B 、圖 18A 及圖 18B 顯示在25℃下儲存之含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之mAb B及mAb C抗體調配物的SEC-HPLC結果。圖 19 顯示在25℃下儲存之含聚山梨醇酯20級分之mAb B抗體調配物的IEC結果。圖 20A 及圖 20B 顯示在5℃下儲存不同時長之含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之抗體調配物的影像。圖 21A 及圖 21B 顯示在5℃下儲存之含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之mAb B及mAb C抗體調配物的HIAC結果。圖 22A 、圖 22B 、圖 23A 及圖 23B 顯示在5℃下儲存之含不同濃度之聚山梨醇酯20級分之mAb B及mAb C抗體調配物的SEC-HPLC結果。圖 24 顯示在5℃下儲存之含聚山梨醇酯20級分之mAb B抗體調配物的IEC結果。圖 25 顯示藉由2.5 U/mL洋蔥假單胞菌(Pseudomonas Ceoacia)脂肪酶(PCL)對PS20及F2a (各自處於pH=6.0調配物緩衝液中)進行強制降解之HIAC結果。

Claims (82)

  1. 一種液體調配物，其包含多肽及表面活性劑，其中至少約70% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯。
  2. 如請求項1之液體調配物，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯包含約5至30個POE單元。
  3. 如請求項1或請求項2之液體調配物，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯包含約20個POE單元。
  4. 如請求項1至3中任一項之液體調配物，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯包含選自由視情況經取代之C4-28 烷基及視情況經取代之C4-28 烯基組成之群的脂肪酸鏈。
  5. 如請求項1至4中任一項之液體調配物，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯為單酯。
  6. 如請求項5之液體調配物，其中該等單酯係選自由異山梨醇POE單月桂酸酯、異山梨醇POE單肉荳蔻酸酯、異山梨醇POE單棕櫚酸酯、異山梨醇POE單硬脂酸酯及異山梨醇POE單油酸酯組成之群。
  7. 如請求項1至4中任一項之液體調配物，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯為單酯、二酯或前述各物之混合物。
  8. 如請求項1之液體調配物，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯為式(I)化合物：
    Figure 03_image008
    (I)； 其中： a及b獨立地為2至28之整數，條件為a與b之和為5至30之整數； R1 及R2 係獨立地選自由氫及-C(O)R"組成之群，其中R"為視情況經取代之C3-27 烷基或視情況經取代之C3-27 烯基；且 R3 及R4 獨立地為氫。
  9. 如請求項8之液體調配物，其中a與b之和為9。
  10. 如請求項8或請求項9之液體調配物，其中R1 為H且R2 為-C(O)R"。
  11. 如請求項8或請求項9之液體調配物，其中R1 為-C(O)R"且R2 為H。
  12. 如請求項8或請求項9之液體調配物，其中R1 及R2 皆為-C(O)R"。
  13. 如請求項8至12中任一項之液體調配物，其中R"為未經取代之C3-27 烷基。
  14. 如請求項13之液體調配物，其中R"為未經取代之C11 烷基。
  15. 如請求項8至12中任一項之液體調配物，其中R"為未經取代之C3-27 烯基。
  16. 如請求項15之液體調配物，其中R"為未經取代之C17 烯基。
  17. 如請求項1至16中任一項之液體調配物，其中至少約80% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯。
  18. 如請求項1至17中任一項之液體調配物，其中該表面活性劑進一步包含POE脂肪酸酯。
  19. 如請求項18之液體調配物，其中該表面活性劑包含之異山梨醇POE脂肪酸酯之量大於POE脂肪酸酯。
  20. 如請求項18或請求項19之液體調配物，其中該POE脂肪酸酯包含選自由視情況經取代之C4-28 烷基及視情況經取代之C4-28 烯基組成之群的脂肪酸鏈。
  21. 如請求項20之液體調配物，其中該POE脂肪酸酯係選自由POE單月桂酸酯、POE單肉荳蔻酸酯、POE單棕櫚酸酯、POE單硬脂酸酯及POE單油酸酯組成之群。
  22. 如請求項18至21中任一項之液體調配物，其中少於約20% (wt%)之該表面活性劑為POE脂肪酸酯。
  23. 如請求項1至22中任一項之液體調配物，其中該表面活性劑佔該液體調配物之約0.0005%至0.2% (w:v)。
  24. 如請求項1至23中任一項之液體調配物，其中該表面活性劑進一步包含去水山梨醇POE脂肪酸酯。
  25. 如請求項1至24中任一項之液體調配物，其中該多肽為蛋白質。
  26. 如請求項25之液體調配物，其中該蛋白質為抗體。
  27. 如請求項26之液體調配物，其中該抗體係選自由多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體及抗體片段組成之群。
  28. 如請求項27之液體調配物，其中該抗體片段係選自由Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段組成之群。
  29. 如請求項26至28中任一項之液體調配物，其中該抗體濃度為約0.1 mg/mL至約300 mg/mL。
  30. 如請求項29之液體調配物，其中該抗體濃度為約100 mg/mL至約300 mg/mL。
  31. 如請求項1至30中任一項之液體調配物，其中該液體調配物為復原凍乾調配物。
  32. 如請求項29或請求項30之液體調配物，其中該液體調配物用輸注溶液進一步稀釋至約0.001 mg/mL至約0.5 mg/mL之多肽濃度。
  33. 如請求項1至32中任一項之液體調配物，其中該液體調配物實質上不含聚集物。
  34. 如請求項1至32中任一項之液體調配物，其中該液體調配物包含較少游離脂肪酸粒子形成。
  35. 如請求項18至34中任一項之液體調配物，其中至少約80% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。
  36. 如請求項18至35中任一項之液體調配物，其中至少約90% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。
  37. 一種凍乾調配物，其包含多肽及表面活性劑，其中至少約70% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇聚氧乙烯(POE)脂肪酸酯及POE脂肪酸酯；且其中該凍乾調配物係藉由將根據請求項18至36中任一項之液體調配物凍乾來製備。
  38. 一種製品，其包括封裝如請求項1至36中任一項之液體調配物的容器。
  39. 如請求項38之製品，其中該容器為IV袋。
  40. 如請求項39之製品，其中該IV袋包括注射裝置。
  41. 如請求項39或請求項40之製品，其中該IV袋包括輸注溶液。
  42. 如請求項38之製品，其中該容器為小瓶或預填充注射器。
  43. 如請求項38之製品，其進一步包括封裝稀釋劑之第二容器。
  44. 一種製品，其包括封裝如請求項37之凍乾調配物的容器。
  45. 如請求項44之製品，其進一步包括封裝稀釋劑之第二容器。
  46. 一種製造液體調配物之方法，其包括將多肽及表面活性劑添加至水溶液中，其中至少70% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯。
  47. 如請求項46之方法，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯包含約5至30個POE單元。
  48. 如請求項47之方法，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯包含約20個POE單元。
  49. 如請求項46至48中任一項之方法，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯包含選自由視情況經取代之C4-28 烷基及視情況經取代之C4-28 烯基組成之群的脂肪酸鏈。
  50. 如請求項46至48中任一項之方法，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯為單酯。
  51. 如請求項50之方法，其中該等單酯係選自由異山梨醇POE單月桂酸酯、異山梨醇POE單肉荳蔻酸酯、異山梨醇POE單棕櫚酸酯、異山梨醇POE單硬脂酸酯及異山梨醇POE單油酸酯組成之群。
  52. 如請求項46至49中任一項之方法，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯為單酯、二酯或前述各物之混合物。
  53. 如請求項46之方法，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯為式(I)化合物：
    Figure 03_image009
    (I)； 其中： a及b獨立地為2至28之整數，條件為a與b之和為5至30之整數； R1 及R2 係獨立地選自由氫及-C(O)R"組成之群，其中R"為視情況經取代之C3-27 烷基或視情況經取代之C3-27 烯基；且 R3 及R4 獨立地為氫。
  54. 如請求項53之方法，其中a與b之和為9。
  55. 如請求項53或請求項54之方法，其中R1 為H且R2 為-C(O)R"。
  56. 如請求項53或請求項54之方法，其中R2 為-C(O)R"且R1 為H。
  57. 如請求項53或請求項54之方法，其中R1 及R2 皆為-C(O)R"。
  58. 如請求項53至57中任一項之方法，其中R"為未經取代之C3-27 烷基。
  59. 如請求項56之方法，其中R"為未經取代之C11 烷基。
  60. 如請求項53至57中任一項之方法，其中R"為未經取代之C3-27 烯基。
  61. 如請求項60之方法，其中R"為未經取代之C17 烯基。
  62. 如請求項46至61中任一項之方法，其中該表面活性劑進一步包含POE脂肪酸酯。
  63. 如請求項62之方法，其中至少約80% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。
  64. 如請求項62或請求項63之方法，其中至少約90% (wt%)之該表面活性劑為異山梨醇POE脂肪酸酯及POE脂肪酸酯。
  65. 如請求項62至64中任一項之方法，其中該表面活性劑包含之異山梨醇POE脂肪酸酯之量大於POE脂肪酸酯。
  66. 如請求項62至65中任一項之方法，其中該POE脂肪酸酯包含選自由視情況經取代之C4-28 烷基及視情況經取代之C4-28 烯基組成之群的脂肪酸鏈。
  67. 如請求項66之方法，其中該POE脂肪酸酯係選自由POE單月桂酸酯、POE單肉荳蔻酸酯、POE單棕櫚酸酯、POE單硬脂酸酯及POE單油酸酯組成之群。
  68. 如請求項62至67中任一項之方法，其中少於約20% (wt%)之該表面活性劑為POE脂肪酸酯。
  69. 如請求項46至68中任一項之方法，其中該表面活性劑進一步包含去水山梨醇POE脂肪酸酯。
  70. 如請求項46至69中任一項之方法，其中該表面活性劑佔該液體調配物之約0.0005%至0.2% (w:v)。
  71. 如請求項46至70中任一項之方法，其中該多肽為蛋白質。
  72. 如請求項71之方法，其中該蛋白質為抗體。
  73. 如請求項72之方法，其中該抗體係選自由多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體及抗體片段組成之群。
  74. 如請求項73之方法，其中該抗體片段係選自由Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段組成之群。
  75. 如請求項72至74中任一項之方法，其中該抗體濃度為約0.1 mg/mL至約300 mg/mL。
  76. 如請求項75之方法，其中該抗體濃度為約100 mg/mL至約300 mg/mL。
  77. 如請求項75或請求項76之方法，其中該液體調配物用輸注溶液進一步稀釋至約0.1 mg/mL至約2 mg/mL之濃度。
  78. 如請求項46至77中任一項之方法，其進一步包括將該液體調配物凍乾以製造凍乾調配物。
  79. 如請求項46至78中任一項之方法，其中該液體調配物實質上不含聚集物。
  80. 如請求項46至78中任一項之方法，其中該液體調配物包含較少游離脂肪酸粒子形成。
  81. 如請求項1至4中任一項之液體調配物，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯為異山梨醇POE單月桂酸酯。
  82. 如請求項46至48中任一項之方法，其中該異山梨醇POE脂肪酸酯為異山梨醇POE單月桂酸酯。
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