CN114014935A - 抗磺胺类药物纳米抗体与大豆过氧化物酶的融合蛋白及应用 - Google Patents

抗磺胺类药物纳米抗体与大豆过氧化物酶的融合蛋白及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗磺胺类药物纳米抗体与大豆过氧化物酶的融合蛋白及应用。本发明将通过噬菌体展示技术获得的抗磺胺类药物纳米抗体基因与大豆过氧化物酶基因优化后连接，并利用昆虫细胞杆状病毒表达系统对其进行融合表达。产生的融合蛋白具有与磺胺类药物的结合活性和过氧化氢酶的催化活性，该融合蛋白用于以免疫标记技术为基础的酶联免疫分析检测，其IC50值为1.21ng/mL，线性检测范围为0.27‑5.34ng/mL。该融合蛋白具有耐高温、耐有机溶剂、易生产等特性，基于该融合蛋白的检测方法具有快速、灵敏、稳定的优势。本发明对于磺胺类药物的低成本、大批量样品的残留现场检测具有重要意义。

Description

抗磺胺类药物纳米抗体与大豆过氧化物酶的融合蛋白及应用
技术领域
本发明属于基因工程和免疫学领域，具体地说，涉及抗磺胺类药物纳米抗体与大豆过氧化物酶的融合蛋白及应用。
背景技术
免疫分析法由于简单快速、价格低廉、无需专业技术人员、适用于现场大量样品的快速筛选等优点，在有害化合物快速检测领域广泛应用。免疫分析法中，作为核心试剂的抗体和信号报告分子(如酶等)，决定着分析方法的灵敏度、特异性和稳定性。常规的IgG抗体由两条重链和两条轻链组成，具有结构复杂、稳定性差、生产成本高、不易进行体外改造等缺点，极大地限制了其在实际样本检测中的应用。在骆驼科动物体内存在天然缺失轻链的重链抗体(heavy chain antibody，HCAb)。通过基因工程技术可以获得保留抗原结合活性的HCAb的重链可变区(variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHH)，称为单域抗体(single domain antibody，sdAb)。由于sdAb的尺寸处于纳米级别，故又称之为纳米抗体(nanobody，Nb)。纳米抗体耐受性强、结构简单、易于改造进化、生产成本低等特性弥补了传统抗体的不足，在免疫学检测方法中有重要的实用价值。然而，由于纳米抗体不含常规抗体的恒定区，且CDR区含有较多赖氨酸，因此，采用化学偶联标记极易将酶分子标记在CDR区，影响纳米抗体与抗原的结合，最终影响检测结果的准确性。
大豆过氧化物酶(soybean peroxidase，SBP)是从大豆加工副产物豆壳中提取得到的一类以血红素为辅基的高活性酸性同功酶，其与目前常用的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)同属于植物过氧化物酶超家族的Ⅲ类酶(EC 1.11.1.7)，二者氨基酸序列具有约57％的同源性，在结构、功能及作用机理上有很多相似之处。大豆过氧化物酶含有大约分子量18％的糖基，4个二硫键，等电点为3.9，在高温、有机溶剂及pH2-11的环境中仍具有催化活性。与辣根过氧化物酶相比，大豆过氧化物酶在耐热性能、酸碱适应性、有机溶剂耐受性、底物作用范围、信号稳定性等多项指标上具有明显优势。因此，大豆过氧化物酶很可能会成为辣根过氧化物酶最有竞争力的替代品，具有广阔的应用前景。然而，大豆过氧化物酶的主要来源是大豆种皮，其提纯工艺复杂，且不同来源或不同品种的大豆均会影响酶的活性及质量，较难实现统一质控，极大地限制了大豆过氧化物酶的推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供抗磺胺类药物纳米抗体与大豆过氧化物酶的融合蛋白及应用。
本发明的另一目的是提供一种新型的抗磺胺类药物纳米抗体。
为了实现本发明目的，利用基因工程技术将纳米抗体与大豆过氧化物酶进行融合表达并建立灵敏高效的免疫分析法。既实现了纳米抗体的无损定点标记，又实现了大豆过氧化物酶的体外高效表达，同时，由于纳米抗体和大豆过氧化物酶都具有优良的稳定性，二者融合表达后，可有效提升免疫分析检测性能。
第一方面，本发明提供一种抗磺胺类药物纳米抗体，所述抗体包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。
大豆过氧化物酶包含如下的氨基酸序列或由其组成：
I)如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
II)在I)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
III)I)或II)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。
第二方面，本发明提供所述抗体的以下任一应用：
1)用于磺胺类药物检测；
2)用于制备磺胺类药物检测试剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供一种融合蛋白(抗磺胺类药物纳米抗体与大豆过氧化物酶的融合蛋白)，所述融合蛋白由所述抗体与大豆过氧化物酶串联而成。
优选地，所述抗体位于融合蛋白的氨基端，所述大豆过氧化物酶位于融合蛋白的羧基端；
优选地，所述抗体与所述大豆过氧化物酶按摩尔比1:1融合；
优选地，所述抗体与大豆过氧化物酶由柔性连接肽连接；更优选地，连接肽为(G4S)n，其中，n为≥1的整数；最优选n＝3；
优选地，所述融合蛋白在氨基端和羧基端分别带有一个6×组氨酸标签。
第四方面，本发明提供编码所述融合蛋白的核酸分子。优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
第五方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第六方面，本发明提供所述融合蛋白的制备方法，利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达所述融合蛋白。
所述方法包括以下步骤：
(1)对编码所述融合蛋白的基因进行密码子优化；
(2)将优化后的基因构建到表达载体pVL1393上，将重组载体与杆状病毒DNA共转染至sf9细胞中，制备重组病毒；
(3)获得的重组病毒感染Hi5细胞，表达并纯化目标融合蛋白。
第七方面，本发明提供磺胺类药物检测试剂或试剂盒，有效成分为所述抗体或所述融合蛋白。
第八方面，本发明提供磺胺类药物ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及检测试剂；所述酶标板的每个孔包被有磺胺类药物人工抗原，所述试剂包括所述抗体或所述融合蛋白，以及磺胺类药物标准溶液、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液等中的至少一种。
第九方面，本发明提供所述融合蛋白的以下任一应用：
A、用于磺胺类药物检测；
B、用于制备磺胺类药物检测试剂或试剂盒；
C、用于磺胺类药物的富集和纯化；
D、用于制备磺胺类药物的富集和纯化试剂；
E、用于与大豆过氧化物酶相关的催化反应。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
利用本发明提供的融合蛋白能够准确灵敏地检测样品中的磺胺类药物残留，基于该融合蛋白的间接竞争ELISA的半数抑制浓度(IC50)为1.21ng/mL，线性检测范围为0.27-5.34ng/mL。该融合蛋白具有耐高温、耐有机溶剂、易生产等特性，基于该融合蛋白的检测方法具有快速、灵敏、稳定的优势。因此，本发明对于磺胺类药物的低成本、大批量样品的残留现场检测具有重要意义。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中pVL1393-VHH-SBP表达载体图谱。
图2为本发明较佳实施例中pVL1393空质粒以及插入融合蛋白基因后的质粒菌液PCR鉴定图。其中，M泳道为DNAMarker，1泳道为空载体，2泳道为阳性质粒。
图3为本发明较佳实施例中昆虫表达系统表达出的融合蛋白SDS-PAGE电泳图。其中，M泳道为蛋白Marker，1泳道为纯化后的融合蛋白。
图4为本发明较佳实施例中昆虫表达系统表达出的融合蛋白活性鉴定图。
图5为本发明较佳实施例中基于融合蛋白的间接竞争ELISA标准曲线图。
图6为本发明较佳实施例中融合蛋白对温度的耐受性评估图。
图7为本发明较佳实施例中融合蛋白对甲醇的耐受性评估图。
具体实施方式
本发明提供一种纳米抗体与大豆过氧化物酶的融合蛋白及其应用。
本发明采用基因重组表达的方式，表达抗体和标记酶的重组融合蛋白，获得酶标抗体，用于相关的免疫学检测。具体地，利用抗磺胺类药物的纳米抗体，制备检测磺胺类药物浓度的纳米抗体标记大豆过氧化物酶融合蛋白，并将其应用于实际的免疫检测中。
本发明的目的之一是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白由抗磺胺类药物纳米抗体与大豆过氧化物酶串联而成。所述融合蛋白是将编码纳米抗体和大豆过氧化物酶的基因重组后，在大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或其他表达系统中表达获得的。
纳米抗体和大豆过氧化物酶的融合方式，可以是在纳米抗体的氨基端或者羧基端融合一个或者几个大豆过氧化物酶，也可以在纳米抗体的氨基端和羧基端分别融合一个或几个大豆过氧化物酶，或者在大豆过氧化物酶的氨基端或者羧基端分别融合一个或者几个纳米抗体。在两端分别融合纳米抗体的融合蛋白中，所述融合蛋白中的纳米抗体可以是不同的纳米抗体，分别针对同一抗原的不同抗原决定簇或不同的抗原分子。
在纳米抗体和大豆过氧化物酶间可以添加间隔序列以消除空间位阻，使纳米抗体和大豆过氧化物酶能够各自折叠成正确的空间构象，进而保证二者具有相应的生物学活性，间隔序列可以是(G4S)n柔性多肽或其他间隔序列。
为了便于纯化融合蛋白，在融合蛋白的任意位置可以增加多聚组氨酸标签，表达后的重组融合蛋白可以采用镍离子金属螯合亲和层析的方法进行纯化。
优选地，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述大豆过氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述纳米抗体位于融合蛋白的氨基端，所述大豆过氧化物酶位于融合蛋白的羧基端，二者按摩尔比1:1融合。
优选地，所述纳米抗体与大豆过氧化物酶由连接肽(G4S)n连接，n＝3。
优选地，所述融合蛋白在氨基端和羧基端分别插入一个6×组氨酸标签。
本发明的目的之二是提供一种编码上述融合蛋白的氨基酸序列及核苷酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明的目的之三是提供一种含有上述核苷酸序列的载体，所述载体为pVL1393。
本发明的目的之四是两种含有上述载体的细胞，所述细胞为sf9细胞和Hi5细胞。
本发明的目的之五是提供一种制备上述融合蛋白的方法，所述方法包括：
(1)通过噬菌体展示技术获得抗磺胺类药物纳米抗体；
(2)对步骤(1)中获得的纳米抗体基因和大豆过氧化物酶基因进行密码子优化，其中所述纳米抗体优化后的核苷酸编码序列为SEQ ID NO:2，所述大豆过氧化物酶优化后的核苷酸编码序列为SEQ ID NO:5；
(3)在步骤(2)的基础上构建表达纳米抗体和大豆过氧化物酶融合蛋白的表达载体pVL1393-VHH-SBP；
(4)将步骤(3)获得的载体和杆状病毒DNA共转染至第一宿主细胞sf9中，制备高滴度重组病毒；
(5)用步骤(4)中获得的重组病毒感染第二宿主细胞Hi5，表达融合蛋白。
(6)收集步骤(5)中所获的融合蛋白并对其进行纯化。
本发明的目的之六是提供一种适用于磺胺类药物残留分析的酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及设在盒体内的试剂；所述酶标板的每个孔包被有磺胺类药物人工抗原，所述试剂包括上述融合蛋白，以及磺胺类药物标准溶液、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液等中的至少一种。
本发明的目的之七是提供基于所述融合蛋白与磺胺类药物特异性结合的能力以及酶催化底物所产生的信号放大效应，建立的一种磺胺类药物检测方法。优选地，所述方法包括ELISA、化学发光免疫分析法(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)、荧光免疫分析法(Fluoroimmunoassay，FIA)，免疫芯片法，亲和层析法和免疫层析法或与大豆过氧化物酶相关的催化反应等。
进一步地，可以将SEQ ID NO:1所示的纳米抗体或者SEQ ID NO:4所示的大豆过氧化物酶作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质更好的突变体，这些突变体均属于本发明保护范围。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 磺胺类药物纳米抗体的制备
将磺胺类药物半抗原与牛血清白蛋白偶联后与弗氏佐剂混合免疫羊驼，通过ELISA监测血清效价、特异性及抑制率。采集羊驼外周血，经密度梯度离心法分离淋巴细胞后，采用Trizol法提取RNA并将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，通过PCR扩增重链可变区基因VHH，经酶切连接后构建噬菌粒pAK100-VHH。将噬菌粒通过电击转化的方法转入大肠杆菌XL1-Blue中，在对数期以20:1的感染复数加入辅助噬菌体M13KO7，过夜培养后采用PEG-NaCl法收集噬菌体，获得抗磺胺类药物噬菌体展示纳米抗体库。采用固相亲和淘选的方法从制备的抗体库中淘选抗磺胺类药物纳米抗体。经五轮淘选后，挑选48个克隆进行phage-ELISA鉴定，将阳性克隆测序，获得核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的编码SEQ ID NO:1所示的抗磺胺类药物纳米抗体。
实施例2 磺胺类药物纳米抗体及大豆过氧化物酶基因的密码子优化及合成
根据昆虫细胞偏爱密码子对如SEQ ID NO:3所示的纳米抗体及SEQ ID NO:6所示的大豆过氧化物酶基因进行密码子优化，选择宿主草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，根据宿主氨基酸密码子的偏好性进行优化，并确保序列中不含有XbaI、NcoI以及NotI，最终得到如SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:5所示的密码子优化后的纳米抗体基因和大豆过氧化物酶基因，分别编码如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的纳米抗体和大豆过氧化物酶。
实施例3 pVL1393-VHH-SBP表达载体的构建
1、以合成的SEQ ID NO:2所示的纳米抗体基因以及SEQ ID NO:5所示的大豆过氧化物酶为模板，利用下述引物(引物F1、R1、F2、R2)，通过重叠延伸PCR将纳米抗体基因与大豆过氧化物酶基因进行拼接，同时引入启动子、终止子、His标签、连接肽及酶切位点，将PCR产物通过1％琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的条带，得到拼接后的PCR产物。
其中，引物为：
引物F1:5′-ctagtctagaatgcatcatcatcatcatcatcaagtgcagctggtggagtccggtgg-3′，
引物R1:5′-ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccatgggcggaggacacagtcacttg-3′，
引物F2:5′-ggcggcggcggctccggtggtggtggttctatgggttccatgcgtctg-3′，
引物R2:5′-ctaggcggccgcttttcagtggtggtggtggtgatgcttggactgagcgaccagctt-3′。
共进行三轮PCR反应，第一轮PCR反应的DNA模板为纳米抗体(SEQ ID NO:2)，上下游引物分别为F1和R1；第二轮PCR反应的DNA模板为大豆过氧化物酶(SEQ ID NO:5)，上下游引物分别为F2和R2；第三轮PCR反应的DNA模板为第一轮和第二轮PCR的产物，上下游引物分别为F1和R2。
PCR反应体系为：
Figure BDA0003375773540000061
PCR反应条件为：
95℃变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min；30个循环；72℃延伸10min。
2、利用Xbal和NotI分别双酶切pVL1393载体质粒(购自Expression Systems，货号91-013)和上述第三轮PCR产物，酶切过程在37℃水浴中进行，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，回收得到质粒pVL1393 Xbal+NotI片段和纳米抗体-大豆过氧化物酶重组基因酶切产物(VHH-SBP酶切产物)。
具体酶切体系为：
Figure BDA0003375773540000071
3、利用T4DNA连接酶将质粒pVL1393 Xbal+NotI片段和VHH-SBP酶切产物连接，连接反应在金属浴16℃过夜进行，得到如图1所示的pVL1393-VHH-SBP表达载体。
具体反应体系为：
Figure BDA0003375773540000072
4、将连接产物转化至大肠杆菌TOP10中，具体操作步骤为：取一管冰冻TOP10(100μL)置于冰上，待菌液刚刚融化时，加入5μL上述连接产物，轻弹试管使其混匀后静置冰浴30min，42℃热激60s，立即放回冰上继续静置2min，之后加入900μL SOC培养基，37℃，200rpm培养1h，离心后弃去上清，剩余部分用移液枪混匀后均匀涂布于含氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板上，37℃倒置培养过夜。
从平板上挑选3个单菌落接种在含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养过夜，进行菌液PCR，获得PCR产物。
其中，引物为：
引物F3:5′-aaatgataaccatctcgc-3′，
引物R3:5′-gtccaagtttccctg-3′。
PCR反应体系为：
Figure BDA0003375773540000081
PCR反应条件为：
95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min；30个循环；72℃延伸10min。
以空载体为对照，将连接产物替换为pVL1393载体质粒，其它同上述步骤，得到PCR产物。
用PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，其中M泳道为DNA Marker，1泳道为空载体，2泳道为阳性质粒。阳性克隆扩增出了符合预期大小的目的条带(1793bp)，而空载体无相应的目的条带。
挑选目的条带大小正确的菌株，用质粒提取试剂盒提取质粒并进行测序，得到序列无误且无突变的pVL1393-VHH-SBP重组表达载体。
实施例4 在昆虫细胞sf9中进行pVL1393-VHH-SBP重组表达载体的包装
取六孔细胞培养板，选其中的两个孔，一个作为实验组(VHH-SBP-pVL1393)，一个作为对照组(pVL1393)，分别加入SF-II 900SFM培养基(购自Thermo Fisher Scientific，货号：10902088)，再加入1×106个sf9昆虫细胞(购自Expression Systems，货号：94-001S)，轻轻摇动板子，铺满底部，27℃孵育30min，使细胞贴壁。
取0.5μg杆状病毒DNA(购自Expression Systems，货号91-200)和2μg pVL1393-SBP(对照组pVL1393载体质粒同时进行)加入含有100μL转染培养基(购自ExpressionSystems，货号91-200)的试管A中，另外取6μL转染试剂(购自Expression Systems，货号91-200)加入到含100μL转染培养基的试管B中，分别混匀，静置5min后，将试管A和试管B中的溶液合并混匀，室温静置20min后加入800μL转染培养基，得到转染混合物。
弃去六孔板中培养基上清，立即加入转染混合物，27℃孵育5h，除去上清，立即加入新鲜的SF-II 900SFM培养基，27℃孵育96h后离心取上清，得到病毒液P0。
在细胞培养瓶中接种5×106个sf9昆虫细胞，按MOI＝0.05-0.1加入病毒液P0，27℃培养96h，收集病毒液P1，之后再重复感染一次sf9昆虫细胞，收集对照组和实验组的病毒液P2。
实施例5 融合蛋白在Hi5细胞中的表达、纯化及活性鉴定
将实施例3得到的实验组的病毒液P2感染对数期的Hi5昆虫细胞(购自ExpressionSystems，货号94-002S)，27℃培养72h后3000rpm离心10min，弃上清，收集细胞，用PBS重悬细胞后再次离心(条件同上)，弃上清，向沉淀中加入真核细胞裂解液及蛋白酶抑制剂，冰上搅拌30min后，4℃，12000rpm离心20min，取上清，用0.45μm孔径滤膜过滤，进行亲和层析纯化并进行SDS-PAGE检测。融合蛋白纯化结果如图3所示，其中M泳道为蛋白Marker，1泳道为纯化后的融合蛋白。该融合蛋白理论大小为54.3kDa，与泳道1中位于50kDa及65kDa之间的条带大小相符。经计算，纳米抗体与大豆过氧化物酶融合蛋白在昆虫细胞表达系统中的蛋白表达量可达130mg/L。
通过间接ELISA法对融合蛋白的活性进行鉴定，具体操作步骤为：将磺胺类药物包被原分别稀释至8.1、2.7、0.9、0.3、0.1、0.03、0.01μg/mL，按顺序加入酶标板中，每孔100μL，同时设置包被原浓度为0的对照孔。经包被、洗涤、封闭后，按顺序加入100μL纯化后的融合蛋白及对照细胞粗提液(无融合蛋白)，其中融合蛋白的浓度分别为10μg/mL、1μg/mL以及0.1μg/mL，对照组细胞粗提液浓度为10000μg/mL。室温反应30min后，每孔加入100μL TMB底物液，室温反应5min后每孔加入50μL 2M H2SO4，放入酶标仪，测定450nm处的吸光值(OD)。结果如图4所示：随着包被原浓度的降低，OD值逐渐降低，随着融合蛋白浓度降低，OD值也逐渐降低，而无包被原对照组及无融合蛋白对照组的OD值都接近0，说明融合蛋白具有与包被原特异性结合的能力，且具有催化底物产生信号的能力。当包被原浓度为0.3μg/mL，融合蛋白浓度为1μg/mL时，OD值仍能达到接近1.5的水平，该结果表明利用昆虫细胞杆状病毒系统表达出的VHH-SBP具有良好的结合及催化活性。
实施例6 融合蛋白用于磺胺类药物的检测
最佳抗原抗体浓度的选择：采用棋盘法，用非竞争间接ELISA模式进行测定。将包被原倍比稀释成不同浓度，按顺序加入酶标板中，每孔100μL。经包被、洗涤、封闭后，每孔加入50μL PBS，再加入50μL不同浓度的融合蛋白，37℃孵育30min后洗涤并加入TMB显色液，反应10min后加入终止液，在酶标仪上读取OD450nm值，选取OD值接近1.5且上下左右数值差异较大的孔所对应的抗原抗体浓度为包被原和抗体的最适工作浓度。
间接竞争ELISA标准曲线的建立：用包被液将包被原稀释至0.35μg/mL，100μL/孔包被于酶标板，4℃过夜；PBST洗板5次，拍干；加入3％脱脂牛奶(w/v)，200μL/孔，37℃封闭2h。PBST洗板3次后，拍干，每孔加入50μL梯度稀释的磺胺类药物标准品溶液(以磺胺二甲基嘧啶为代表)，同时加入50μL稀释至0.75μg/mL的融合蛋白，轻轻混匀，37℃孵育30min。PBST洗板5次，拍干，加入100μL/孔TMB显色液，37℃避光显色10min；加入50μL/孔终止液(2MH2SO4)，酶标仪读450nm处吸光值。以磺胺类药物各浓度的对数为横坐标，以各浓度对应的OD值为纵坐标，使用Origin 8.5软件，按照四参数对数拟合绘制标准曲线。结果如图5所示，IC50值为1.21ng/mL，线性检测范围为0.27-5.34ng/mL。
实施例7 融合蛋白的特异性、温度稳定性及有机溶剂稳定性测定
选用交叉反应率评价融合蛋白对磺胺类药物的特异性，其操作步骤与间接竞争ELISA类似，不同之处在于竞争反应时，分别加入不同种类的待测标准品溶液。最后分别计算出待测标准品的IC50值，利用公式，交叉反应率＝[IC50(磺胺二甲基嘧啶)/IC50(待测标准品)]×100％，可计算出交叉反应率。实验结果表明，该融合蛋白与磺胺氯哒嗪、磺胺噻唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基异恶唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺硝苯、磺胺甲二唑、磺胺乙氧哒嗪的交叉反应率介于10-432％之间；与氯霉素、氧氟沙星、金刚烷胺、硝基呋喃的交叉反应率均小于0.1％，说明该抗体对磺胺类药物具有良好的特异性，可用于磺胺类药物的多残留检测。
融合蛋白的温度及有机溶剂稳定性测定操作步骤与间接ELISA相似，不同之处是先将抗体在不同温度下分别处理10min(25℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)，或将抗体分别与不同浓度的甲醇混合后(0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％)，再加入微孔板进行反应，结果分别如图6和图7所示，该融合蛋白在70℃处理10min后以及在70％甲醇中OD值仍能保持在1.0以上，说明其对高温及有机溶剂的耐受性较强。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 抗磺胺类药物纳米抗体与大豆过氧化物酶的融合蛋白及应用
<130> KHP211124499.3
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Cys Ile Asn Ser Arg Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Asp Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Lys Gly Ala Val Cys Arg Tyr Glu Ala Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caagtgcagc tggtggagtc cggtggaggt ctggtgcagc ctggtggttc cctgagactg 60
tcctgcgtgg cttccggttt ctccttcgac gactacgcta tcggttggtt cagacaagct 120
cctggtaagg agagagaggg tgtggcttgc atcaactccc gcgacggtag aacttactac 180
gctaactccg tgaagggtag attcactatc tcccgcgaca acgctaagga cactgtgtac 240
ctgcagatga actccctgaa gcctgaggac actgacgtgt actactgcgc taagcagaag 300
ggtgctgtgt gcagatacga ggctgactac tggggtcaag gtactcaagt gactgtgtcc 360
tcc 363
<210> 3
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggtgcagc tcgtggagtc cggtggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggatt cagttttgat gattatgcca taggctggtt ccgccaggcc 120
ccagggaagg agcgtgaggg ggtcgcatgt attaatagta gggatggccg cacatactat 180
gcaaactccg tgaagggccg attcaccata tccagagaca acgccaagga cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acagacgttt attactgtgc taagcagaag 300
ggagccgttt gtcgctatga ggccgactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 4
<211> 352
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 4
Met Gly Ser Met Arg Leu Leu Val Val Ala Leu Leu Cys Ala Phe Ala
1 5 10 15
Met His Ala Gly Phe Ser Val Ser Tyr Ala Gln Leu Thr Pro Thr Phe
20 25 30
Tyr Arg Glu Thr Cys Pro Asn Leu Phe Pro Ile Val Phe Gly Val Ile
35 40 45
Phe Asp Ala Ser Phe Thr Asp Pro Arg Ile Gly Ala Ser Leu Met Arg
50 55 60
Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Gln Gly Cys Asp Gly Ser Val Leu
65 70 75 80
Leu Asn Asn Thr Asp Thr Ile Glu Ser Glu Gln Asp Ala Leu Pro Asn
85 90 95
Ile Asn Ser Ile Arg Gly Leu Asp Val Val Asn Asp Ile Lys Thr Ala
100 105 110
Val Glu Asn Ser Cys Pro Asp Thr Val Ser Cys Ala Asp Ile Leu Ala
115 120 125
Ile Ala Ala Glu Ile Ala Ser Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Trp Pro
130 135 140
Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Thr Ala Asn Arg Thr Leu Ala
145 150 155 160
Asn Gln Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Asn Leu Thr Gln Leu Lys Ala
165 170 175
Ser Phe Ala Val Gln Gly Leu Asn Thr Leu Asp Leu Val Thr Leu Ser
180 185 190
Gly Gly His Thr Phe Gly Arg Ala Arg Cys Ser Thr Phe Ile Asn Arg
195 200 205
Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Asn Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr
210 215 220
Thr Tyr Leu Glu Val Leu Arg Ala Arg Cys Pro Gln Asn Ala Thr Gly
225 230 235 240
Asp Asn Leu Thr Asn Leu Asp Leu Ser Thr Pro Asp Gln Phe Asp Asn
245 250 255
Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Leu Gln Leu Asn Gly Leu Leu Gln Ser Asp
260 265 270
Gln Glu Leu Phe Ser Thr Pro Gly Ala Asp Thr Ile Pro Ile Val Asn
275 280 285
Ser Phe Ser Ser Asn Gln Asn Thr Phe Phe Ser Asn Phe Arg Val Ser
290 295 300
Met Ile Lys Met Gly Asn Ile Gly Val Leu Thr Gly Asp Glu Gly Glu
305 310 315 320
Ile Arg Leu Gln Cys Asn Phe Val Asn Gly Asp Ser Phe Gly Leu Ala
325 330 335
Ser Val Ala Ser Lys Asp Ala Lys Gln Lys Leu Val Ala Gln Ser Lys
340 345 350
<210> 5
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgggttcca tgcgtctgct ggtggtggct ctgttgtgcg ctttcgctat gcacgctggt 60
ttctccgtgt cctacgctca gctgacccct accttctacc gcgagacttg ccccaacttg 120
ttccccatcg tgttcggcgt gatcttcgac gcttccttca ctgaccctcg tatcggtgct 180
tccctgatgc gcttgcactt ccacgactgc ttcgtgcagg gttgcgacgg ttctgtgctg 240
ctgaacaaca ccgacaccat cgagtccgag caggacgctc tgcccaacat caactccatc 300
cgtggactgg acgtggtcaa cgacatcaag accgctgtcg agaactcttg ccccgacacc 360
gtgtcttgcg ctgacatctt ggctatcgct gctgagatcg cttccgtgct tggtggtggt 420
cctggatggc ctgttccttt gggtcgtcgt gactccctga ccgctaacag gactctggct 480
aaccagaacc tgcctgctcc attcttcaac ctgactcagc tgaaggctag cttcgctgtg 540
caaggcctga acaccctgga cctggtcact ctgtctggtg gtcacacctt cggtcgtgct 600
cgttgctcca ccttcatcaa ccgtctgtac aacttctcca acactggcaa ccccgatcct 660
actctgaaca ccacctacct ggaagtgctg cgtgctcgct gccctcaaaa cgctactggc 720
gacaacctga ccaacctcga cctgtctacc cctgaccagt tcgacaaccg ttactactcc 780
aacctgctgc agctcaacgg actgctgcag tctgaccaag agctgttctc cactcctggt 840
gctgacacta tccctatcgt gaactccttc agctccaacc agaacacctt cttctctaac 900
ttccgcgtgt ccatgatcaa gatgggcaac atcggtgtcc tgaccggcga cgaaggcgaa 960
atccgtctgc agtgcaactt cgtgaacggc gactccttcg gactggcttc cgtggcttct 1020
aaggacgcta agcagaagct ggtcgctcag tccaag 1056
<210> 6
<211> 1056
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 6
atgggttcca tgcgtctatt agtagtggca ttgttgtgtg catttgctat gcatgcaggt 60
ttttcagtct cttatgctca gcttactcct acgttctaca gagaaacatg tccaaatctg 120
ttccctattg tgtttggagt aatcttcgat gcttctttca ccgatccccg aatcggggcc 180
agtctcatga ggcttcattt tcatgattgc tttgttcaag gttgtgatgg atcagttttg 240
ctgaacaaca ctgatacaat agaaagcgag caagatgcac ttccaaatat caactcaata 300
agaggattgg acgttgtcaa tgacatcaag acagcggtgg aaaatagttg tccagacaca 360
gtttcttgtg ctgatattct tgctattgca gctgaaatag cttctgttct gggaggaggt 420
ccaggatggc cagttccatt aggaagaagg gacagcttaa cagcaaaccg aacccttgca 480
aatcaaaacc ttccagcacc tttcttcaac ctcactcaac ttaaagcttc ctttgctgtt 540
caaggtctca acacccttga tttagttaca ctctcaggtg gtcatacgtt tggaagagct 600
cggtgcagta cattcataaa ccgattatac aacttcagca acactggaaa ccctgatcca 660
actctgaaca caacatactt agaagtattg cgtgcaagat gcccccagaa tgcaactggg 720
gataacctca ccaatttgga cctgagcaca cctgatcaat ttgacaacag atactactcc 780
aatcttctgc agctcaatgg cttacttcag agtgaccaag aacttttctc cactcctggt 840
gctgatacca ttcccattgt caatagcttc agcagtaacc agaatacttt cttttccaac 900
tttagagttt caatgataaa aatgggtaat attggagtgc tgactgggga tgaaggagaa 960
attcgcttgc aatgtaattt tgtgaatgga gactcgtttg gattagctag tgtggcgtcc 1020
aaagatgcta aacaaaagct tgttgctcaa tctaaa 1056
<210> 7
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met His His His His His His Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25 30
Gly Phe Ser Phe Asp Asp Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
35 40 45
Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Cys Ile Asn Ser Arg Asp Gly Arg
50 55 60
Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
65 70 75 80
Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
85 90 95
Asp Thr Asp Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gln Lys Gly Ala Val Cys Arg
100 105 110
Tyr Glu Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Ala His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Met Gly Ser Met Arg Leu Leu Val Val Ala Leu Leu Cys Ala Phe
145 150 155 160
Ala Met His Ala Gly Phe Ser Val Ser Tyr Ala Gln Leu Thr Pro Thr
165 170 175
Phe Tyr Arg Glu Thr Cys Pro Asn Leu Phe Pro Ile Val Phe Gly Val
180 185 190
Ile Phe Asp Ala Ser Phe Thr Asp Pro Arg Ile Gly Ala Ser Leu Met
195 200 205
Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Gln Gly Cys Asp Gly Ser Val
210 215 220
Leu Leu Asn Asn Thr Asp Thr Ile Glu Ser Glu Gln Asp Ala Leu Pro
225 230 235 240
Asn Ile Asn Ser Ile Arg Gly Leu Asp Val Val Asn Asp Ile Lys Thr
245 250 255
Ala Val Glu Asn Ser Cys Pro Asp Thr Val Ser Cys Ala Asp Ile Leu
260 265 270
Ala Ile Ala Ala Glu Ile Ala Ser Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Trp
275 280 285
Pro Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Thr Ala Asn Arg Thr Leu
290 295 300
Ala Asn Gln Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Asn Leu Thr Gln Leu Lys
305 310 315 320
Ala Ser Phe Ala Val Gln Gly Leu Asn Thr Leu Asp Leu Val Thr Leu
325 330 335
Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Arg Ala Arg Cys Ser Thr Phe Ile Asn
340 345 350
Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Asn Pro Asp Pro Thr Leu Asn
355 360 365
Thr Thr Tyr Leu Glu Val Leu Arg Ala Arg Cys Pro Gln Asn Ala Thr
370 375 380
Gly Asp Asn Leu Thr Asn Leu Asp Leu Ser Thr Pro Asp Gln Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Leu Gln Leu Asn Gly Leu Leu Gln Ser
405 410 415
Asp Gln Glu Leu Phe Ser Thr Pro Gly Ala Asp Thr Ile Pro Ile Val
420 425 430
Asn Ser Phe Ser Ser Asn Gln Asn Thr Phe Phe Ser Asn Phe Arg Val
435 440 445
Ser Met Ile Lys Met Gly Asn Ile Gly Val Leu Thr Gly Asp Glu Gly
450 455 460
Glu Ile Arg Leu Gln Cys Asn Phe Val Asn Gly Asp Ser Phe Gly Leu
465 470 475 480
Ala Ser Val Ala Ser Lys Asp Ala Lys Gln Lys Leu Val Ala Gln Ser
485 490 495
Lys His His His His His His
500
<210> 8
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgcatcatc atcatcatca tcaagtgcag ctggtggagt ccggtggagg tctggtgcag 60
cctggtggtt ccctgagact gtcctgcgtg gcttccggtt tctccttcga cgactacgct 120
atcggttggt tcagacaagc tcctggtaag gagagagagg gtgtggcttg catcaactcc 180
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ggtactcaag tgactgtgtc ctccgcccat ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc 420
ggtggtggtg gttctatggg ttccatgcgt ctgctggtgg tggctctgtt gtgcgctttc 480
gctatgcacg ctggtttctc cgtgtcctac gctcagctga cccctacctt ctaccgcgag 540
acttgcccca acttgttccc catcgtgttc ggcgtgatct tcgacgcttc cttcactgac 600
cctcgtatcg gtgcttccct gatgcgcttg cacttccacg actgcttcgt gcagggttgc 660
gacggttctg tgctgctgaa caacaccgac accatcgagt ccgagcagga cgctctgccc 720
aacatcaact ccatccgtgg actggacgtg gtcaacgaca tcaagaccgc tgtcgagaac 780
tcttgccccg acaccgtgtc ttgcgctgac atcttggcta tcgctgctga gatcgcttcc 840
gtgcttggtg gtggtcctgg atggcctgtt cctttgggtc gtcgtgactc cctgaccgct 900
aacaggactc tggctaacca gaacctgcct gctccattct tcaacctgac tcagctgaag 960
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accttcggtc gtgctcgttg ctccaccttc atcaaccgtc tgtacaactt ctccaacact 1080
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accttcttct ctaacttccg cgtgtccatg atcaagatgg gcaacatcgg tgtcctgacc 1380
ggcgacgaag gcgaaatccg tctgcagtgc aacttcgtga acggcgactc cttcggactg 1440
gcttccgtgg cttctaagga cgctaagcag aagctggtcg ctcagtccaa gcatcaccac 1500
caccaccac 1509

Claims (10)

1.抗磺胺类药物纳米抗体，其特征在于，所述抗体包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。
2.权利要求1所述抗体的以下任一应用：
1)用于磺胺类药物检测；
2)用于制备磺胺类药物检测试剂或试剂盒。
3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由权利要求1所述抗体与大豆过氧化物酶串联而成；
优选地，所述抗体位于融合蛋白的氨基端，所述大豆过氧化物酶位于融合蛋白的羧基端；
优选地，所述抗体与所述大豆过氧化物酶按摩尔比1:1融合；
优选地，所述抗体与大豆过氧化物酶由柔性连接肽连接；更优选地，连接肽为(G4S)n，其中，n为≥1的整数；最优选n＝3；
优选地，所述融合蛋白在氨基端和羧基端分别带有一个6×组氨酸标签。
4.编码权利要求3所述融合蛋白的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
5.含有权利要求4所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
6.权利要求3所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达所述融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对编码所述融合蛋白的基因进行密码子优化；
(2)将优化后的基因构建到表达载体pVL1393上，将重组载体与杆状病毒DNA共转染至sf9细胞中，制备重组病毒；
(3)获得的重组病毒感染Hi5细胞，表达并纯化目标融合蛋白。
8.磺胺类药物检测试剂或试剂盒，其特征在于，有效成分为权利要求1所述抗体或权利要求3所述融合蛋白。
9.磺胺类药物ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及检测试剂；所述酶标板的每个孔包被有磺胺类药物人工抗原，所述试剂包括权利要求1所述抗体或权利要求3所述融合蛋白，以及磺胺类药物标准溶液、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液中的至少一种。
10.权利要求3所述融合蛋白的以下任一应用：
A、用于磺胺类药物检测；
B、用于制备磺胺类药物检测试剂或试剂盒；
C、用于磺胺类药物的富集和纯化；
D、用于制备磺胺类药物的富集和纯化试剂；
E、用于与大豆过氧化物酶相关的催化反应。
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CN112076315A (zh) * 2020-08-25 2020-12-15 中国农业科学院生物技术研究所 新冠病毒s蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用

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