CN113952368A - 一种同时提取黄蜀葵花多糖及黄酮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药组分提取领域，具体涉及一种同时提取黄蜀葵花多糖及黄酮的方法。采用乙醇/水体系加热回流提取黄蜀葵花，醇沉分离沉淀得粗多糖，上清液浓缩真空干燥得到粗黄酮，分离到的多糖及黄酮分别采用吸附大孔树脂洗脱分离，并采用脱色树脂对二者脱色除杂，分别制备得到高纯度的黄蜀葵花多糖及黄酮。本方法具有操作简单、除杂脱色效果快速，制备的黄蜀葵花多糖、黄酮纯度高的优点。

Description

一种同时提取黄蜀葵花多糖及黄酮的方法
技术领域
本发明属于中药组分提取领域，具体涉及一种同时提取黄蜀葵花多糖及黄酮的方法。
背景技术
黄蜀葵为锦葵科秋葵属，是一种一年或多年生植物，别名黄秋葵、棉花葵、野芙蓉、鸡爪莲，广泛分布于印度、尼泊尔和中国，在我国主要分布于产云南、贵州、四川、湖北、广东、广西及台湾等省区；黄蜀葵花冠是一种传统中药材，通常被用作草药、茶饮以及保健等许多不同目的，其具有很高的医疗保健价值，如美容养颜，增加食欲，辅助治疗肾病，治疗炎症等。
黄蜀葵花含有丰富的黄酮类化合物和多糖类物质。黄蜀葵总黄酮具有镇痛抑菌、抗炎消肿的作用，能治疗胆汁淤积性肝损伤、口腔溃疡，对疼痛也有缓解作用；多糖是黄蜀葵花中主要的药理活性物质，其具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节，降血脂等多种生物功能。
由于多糖成分易溶于水，黄酮类成分易溶于乙醇、甲醇等有机试剂，黄蜀葵花多糖、黄酮的提取分离多采用两步加热提取的方法，使用纯水提取其中的多糖，乙醇、甲醇等有机试剂提取其中的黄酮成分，或者只是提取其中的一种成分；黄蜀葵花多糖与黄酮提取中色素成分会溶解于提取溶剂，影响多糖与黄酮的外观品质，对多糖及黄酮的分离纯化增加难度。专利CN105362311 A的发明专利“一种提取分离黄蜀葵花挥发油、黄酮及多糖的方法”，公开了黄蜀葵花中挥发油、黄酮及多糖的提取分离制备方法，使用低沸点有机试剂提取挥发油，热水提取多糖，醇沉分离多糖，上清液蒸馏旋蒸后得到总黄酮。
专利CN 112694541 A的发明专利“一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法”，公开了黄蜀葵花多糖提取、分离及脱色方法，黄蜀葵花水提后，透析法除蛋白，然后采用乙二胺四乙酸二钠与吸附树脂、交换树脂联用，洗脱多糖颜色，此专利操作步骤繁琐，工艺较复杂。
专利CN 109432148 B的发明专利“一种提取黄蜀葵花浸出物的方法”公开了黄蜀葵花采用甲醇回流提取，减压浓缩后，使用D101大孔树脂梯度洗脱，浓缩喷雾得到黄蜀葵花浸出物，黄酮含量达70％-90％，此专利只分离出了黄酮，未对多糖成分进行分离。
上述各方法，可以分离得到黄蜀葵花多糖及黄酮，但操作繁琐操作工时长，或是对其中一种成分分离制备，且有机试剂使用量大，分离到的多糖及黄酮纯度不够高，难以满足市场需求，进而需要一种易于操作、快速分离制备的方法。
发明内容
为解决现有技术问题，提供了一种同时提取黄蜀葵花多糖及黄酮的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种同时提取黄蜀葵花多糖及黄酮的方法，采用乙醇/水体系加热回流提取黄蜀葵花，醇沉分离沉淀得粗多糖，上清液浓缩真空干燥得到粗黄酮，分离到的多糖及黄酮分别采用吸附大孔树脂洗脱分离，并采用脱色树脂对二者脱色除杂，分别制备得到高纯度的黄蜀葵花多糖及黄酮。
所述乙醇/水体系为55％-70％乙醇/水体系。
取黄蜀葵花粉碎后，以料液质量体积比比1:10-1:20的比例加入55％-70％的乙醇水溶液回流反复提取2-3次，每次2h，过滤合并上清液；上清液减压蒸馏浓缩至原体积的10％-20％，加入95％的乙醇，使溶液中乙醇的体积分数为75％-80％，置4℃冰箱中24h收集沉淀为粗多糖，上清液减压蒸馏至稠状为粗黄酮。
所述粗多糖经水溶解，按多糖水溶液体积的1/4加入Sevage试剂混合，充分振荡后静置，离心收集滤液，浓缩，真空干燥得到粗多糖；干燥后多糖使用10％-20％的乙醇水溶液溶解，溶解后经S-8大孔树脂柱层析吸附，以纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，浓缩至溶解液体积的60％-80％，浓缩液再使用乙醇调节溶液中乙醇浓度至2％-8％，继续使用LXS869大孔树脂柱层析吸附，纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，减压蒸馏旋干溶剂后即得到纯度为95％以上的黄蜀葵花多糖。
所述粗黄酮样品使用20％-25％的乙醇水溶液溶解后，通过AB-8大孔树脂吸附，采用体积比为20:80-80：20的乙醇-水体系进行梯度洗脱，收集65％乙醇水溶液洗脱获得洗脱液，洗脱液减压蒸馏浓缩至溶解液体积的80％-90％，加入乙醇调节溶液中醇浓度至20％-25％，再使用LXS865大孔树脂吸附，采用58％的乙醇水溶液洗脱至无色，收集洗脱液减压蒸馏浓缩后，真空干燥即得纯度为74％以上的黄蜀葵花黄酮。
本发明的有益效果是：
本发明提供过程中采用55％-70％乙醇/水体系，一步加热回流方法提取黄蜀葵花多糖与黄酮，可以将多糖与黄酮分离，并分别采用特定的大孔树脂分离纯化，减压蒸馏干燥后可得到多糖与黄酮，其中黄蜀葵花多糖纯度达到95％以上，回收率达到79.96％以上；黄蜀葵花黄酮纯度达74％以上，黄酮回收率达85.94％以上。本方法具有操作简单、除杂脱色效果快速，制备的黄蜀葵花多糖、黄酮纯度高的优点。
附图说明：
图1为黄酮含量测定标准曲线。
图2为本发明实施例黄蜀葵花多糖过大孔树脂处理后样品。
图3为本发明实施例黄蜀葵花黄酮过大孔树脂处理后样品。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1
黄蜀葵花多糖的脱色大孔树脂的选择
取黄蜀葵花(产地：黑龙江)250g，以料液比1:10加入2.5L 55％的乙醇，加热回流提取2h，按照此方式提取2次，过滤合并滤液，滤液减压蒸馏至0.3L，加入95％的乙醇调节浓缩液中乙醇浓度至75％，4℃冰箱中放置24h，收集沉淀粗多糖，真空干燥箱干燥，得到粗多糖60.86g，采用硫酸-苯酚比色法测定多糖含量为70.69％。
取55g上述粗多糖以适量水溶解，按多糖水溶液体积1/4加入Sevage试剂(三氯甲烷/正丁醇4:1)混合，充分振荡后静置，离心(5000r/min，10min)除去蛋白层，如此反复操作，至无游离蛋白为止，浓缩，真空干燥得到粗多糖53.89g。取脱蛋白多糖样品，均分为5份，每份使用10％的乙醇100ml溶解后，S-8大孔树脂柱层析(柱体积180mL)吸附，以纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，每份分别减压蒸馏浓缩至100mL。
将上述5份浓缩液使用75％的乙醇调节溶液中乙醇浓度至5％，分别使用LXTS、LXS865、D941、D288、8SQ-338大孔树脂柱层析(柱体积200mL)吸附，纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，减压蒸馏旋干溶剂后即得到黄蜀葵花多糖，不同大孔树脂对黄蜀葵花多糖回收率的影响见下表。
Figure BDA0003286820790000031
从表可知，黄蜀葵花粗多糖经不同的脱色大孔树脂处理后，多糖含量及回收率有一定的区别，LXS869处理效果最好，LXS865处理效果次之，试验中优选LXS869对黄蜀葵花粗多糖脱色处理。
实施例2
黄蜀葵花黄酮的脱色大孔树脂的选择
采用实施例1记载通过乙醇提取黄蜀葵花除去粗多糖，收集的滤液，减压蒸馏浓缩，真空干燥，即得到粗黄酮样品。重复上述步骤两次，共收集粗黄酮样品34.42g，黄酮含量为32.12％。
将上述粗黄酮样品均分为5等份，每份使用150mL 20％的乙醇溶解后，分5批次采用AB-8大孔树脂吸附(柱体积180mL)，先用纯水冲洗除杂，在使用65％的乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，每份分别减压蒸馏浓缩至100mL。
将上述5份浓缩液加入乙醇调节溶液中醇浓度至20％，分别使用LXTS、LXS865、D941、D288、SQ-338大孔树脂吸附(柱体积150mL)，58％的乙醇洗脱至无色，收集洗脱液减压蒸馏浓缩后，真空干燥，即得黄蜀葵花黄酮，不同大孔树脂对黄蜀葵花黄酮回收率的影响见下表。
Figure BDA0003286820790000041
从上表中可知，黄酮粗提物经大孔树脂LXS865吸附洗脱处理后，黄酮含量及回收率都高于其他4中大孔树脂，后续试验中优选LXS865大孔树脂对黄蜀葵花黄酮脱色除杂。
实施例3
(1)黄蜀葵花多糖的制备
取黄蜀葵花(产地：黑龙江)100g，以料液比1:10加入1L55％的乙醇，加热回流提取2h，按照此方式提取2次，过滤合并滤液，滤液减压蒸馏至0.1L，加入95％的乙醇调节体系中乙醇浓度至75％，4℃冰箱中放置24h，收集沉淀粗多糖，真空干燥箱干燥，得到粗多糖24.33g，采用硫酸-苯酚比色法测定多糖含量为71.53％。
取10g上述粗多糖以适量水溶解，按多糖水溶液体积1/4加入Sevage试剂(三氯甲烷/正丁醇4:1)混合，充分振荡后静置，离心(5000r/min，10min)除去蛋白层，如此反复操作，至无游离蛋白为止，浓缩，真空干燥得到粗多糖9.83g。
使用10％的乙醇100mL溶解后，S-8大孔树脂柱层析(柱体积180mL)吸附，以纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，浓缩至100mL，使用75％乙醇调节溶液中乙醇浓度至5％，继续使用LXS869大孔树脂柱层析(柱体积200mL)吸附，纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，减压蒸馏旋干溶剂后即得到黄蜀葵花多糖，真空干燥后称重为6.06g，采用硫酸-苯酚比色法测定多糖含量为95.56％。此实施例条件下黄蜀葵花多糖的回收率为80.96％。
(2)黄蜀葵花黄酮的制备
取上述步骤(1)中去除沉淀粗多糖的滤液，减压蒸馏浓缩，真空干燥，即得到粗黄酮样品6.52g，黄酮含量为30.86％
取上述粗黄酮样品，使用150mL 20％的乙醇溶解后，AB-8大孔树脂吸附(柱体积180mL)，先用纯水冲洗除杂，在使用65％的乙醇洗脱至无色，收集洗脱液减压蒸馏浓缩至100mL，加入乙醇调节溶液中醇浓度至20％，继续使用LXS865大孔树脂吸附(柱体积150mL)，58％的乙醇洗脱至无色，收集洗脱液减压蒸馏浓缩后，真空干燥即得黄蜀葵花黄酮2.32g，黄酮含量为74.96％，此实施例条件下黄蜀葵花黄酮回收率为86.43％。
黄酮测定方法：精密称取芦丁对照品10mg，置50mL量瓶中，用60％乙醇溶解，并定容至刻度，振荡摇匀，配制成200mg/L的对照溶液，备用。
吸取芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置10mL量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min，再加4％氢氧化钠溶液4mL，摇匀，用30％乙醇定容至刻度，放置15min后，在510nm处测定吸光度，以对照品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作标准曲线(参见图1)。
精密称取不同步骤的黄蜀葵黄酮浸膏0.2g，60％的乙醇溶解定容到50mL容量瓶，各取1.0mL按上述方法操作检测，即获得上述处理后的黄酮含量。
实施例4
(1)黄蜀葵花多糖的制备
取黄蜀葵花100g，以料液比1:20加入2L70％的乙醇，加热回流提取2h，提取2次，过滤合并滤液，滤液减压蒸馏至0.1L，加入95％的乙醇调节溶液中乙醇浓度至75％，4℃冰箱中放置24h，收集沉淀粗多糖，真空干燥箱干燥，得到粗多糖23.68g，采用硫酸-苯酚比色法测定多糖含量为69.51％。
取10g上述粗多糖以适量水溶解，按多糖水溶液体积1/4加入Sevage试剂(三氯甲烷/正丁醇4:1)混合，充分振荡后静置，离心(5000r/min，10min)除去蛋白层，如此反复操作，至无游离蛋白为止，浓缩，真空干燥得到粗多糖9.85g。
使用10％的乙醇100ml溶解后，S-8大孔树脂柱层析(柱体积180mL)吸附，以纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，浓缩至100mL，使用75％乙醇调节溶液中乙醇浓度至5％，继续使用LXS869大孔树脂柱层析(柱体积200mL)吸附，纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，减压蒸馏旋干溶剂后即得到黄蜀葵花多糖，真空干燥后称重为5.85g，采用硫酸-苯酚比色法测定多糖含量为95.01％，此实施例条件下黄蜀葵花多糖的回收率为79.96％。
(2)黄蜀葵花黄酮的制备
取上述步骤(1)中去除沉淀粗多糖的滤液，减压蒸馏浓缩，真空干燥，即得到粗黄酮样品6.93g，黄酮含量为32.21％
取上述粗黄酮样品，使用150mL 20％的乙醇溶解后，AB-8大孔树脂吸附(柱体积180mL)，先用纯水冲洗除杂，在使用65％的乙醇洗脱至无色，收集洗脱液减压蒸馏浓缩至100mL，加入乙醇调节溶液中醇浓度至20％，继续使用LXS865大孔树脂吸附(柱体积150mL)，58％的乙醇洗脱至无色，收集洗脱液减压蒸馏浓缩后，真空干燥即得黄蜀葵花黄酮2.45g，黄酮含量为78.63％，此实施例条件下黄蜀葵花黄酮回收率为86.31％。
实施例5
(1)取黄蜀葵花100g，以料液比1:15加入1.5L60％的乙醇，加热回流提取2h，提取2次，过滤合并滤液，滤液减压蒸馏至0.1L，加入95％的乙醇调节溶液中乙醇浓度至75％，4℃冰箱中放置24h，收集沉淀粗多糖，真空干燥箱干燥，得到粗多糖24.12g，采用硫酸-苯酚比色法测定多糖含量为70.55％。
取10g上述粗多糖以适量水溶解，按多糖水溶液体积1/4加入Sevage试剂(三氯甲烷/正丁醇4:1)混合，充分振荡后静置，离心(5000r/min，10min)除去蛋白层，如此反复操作，至无游离蛋白为止，浓缩，真空干燥得到粗多糖9.81g。
使用10％的乙醇100ml溶解后，S-8大孔树脂柱层析(柱体积180mL)吸附，以纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，浓缩至100mL，使用75％乙醇调节溶液中乙醇浓度至5％，继续使用LXS869大孔树脂柱层析(柱体积200mL)吸附，纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，减压蒸馏旋干溶剂后即得到黄蜀葵花多糖，真空干燥后称重为5.98g，采用硫酸-苯酚比色法测定多糖含量为95.36％，此实施例条件下黄蜀葵花多糖的回收率为80.83％。
(2)黄蜀葵花黄酮的制备
取上述步骤(1)中去除沉淀粗多糖的滤液，减压蒸馏浓缩，真空干燥，即得到粗黄酮样品6.59g，黄酮含量为32.18％。
取上述粗黄酮样品，使用150mL 20％的乙醇溶解后，AB-8大孔树脂吸附(柱体积180mL)，先用纯水冲洗除杂，在使用65％的乙醇洗脱至无色，收集洗脱液减压蒸馏浓缩至100mL，加入乙醇调节溶液中醇浓度至20％，继续使用LXS865大孔树脂吸附(柱体积150mL)，58％的乙醇洗脱至无色，收集洗脱液减压蒸馏浓缩后，真空干燥即得黄蜀葵花总黄酮2.41g，黄酮含量为75.62％，此实施例条件下黄蜀葵花黄酮回收率为85.94％。
对比例1
(1)黄蜀葵花多糖的制备
取黄蜀葵花(产地：黑龙江)100g，以料液比1:20加入2L蒸馏水，加热回流提取2h，提取2次，由于提取后滤液太粘稠，过滤的方法不能将固液分离；采用离心机离心分离，转速8000r/min，离心15min，收集滤液，滤液减压蒸馏至0.1L，加入95％的乙醇调节溶液中乙醇浓度至75％，4℃冰箱中放置24h，收集沉淀粗多糖，真空干燥箱干燥，得到粗多糖25.63g，采用硫酸-苯酚比色法测定多糖含量为72.26％。
取10g上述粗多糖以适量水溶解，按多糖水溶液体积1/4加入Sevage试剂(三氯甲烷/正丁醇4:1)混合，充分振荡后静置，离心(5000r/min，10min)除去蛋白层，如此反复操作，至无游离蛋白为止，浓缩，真空干燥得到粗多糖9.83g。
使用10％的乙醇100ml溶解后，S-8大孔树脂柱层析(柱体积180mL)吸附，以纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，浓缩至100mL，使用75％乙醇调节溶液中乙醇浓度至5％，继续使用LXS869大孔树脂柱层析(柱体积200mL)吸附，纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，减压蒸馏旋干溶剂后即得到黄蜀葵花多糖，真空干燥后称重为6.29g，采用硫酸-苯酚比色法测定多糖含量为95.62％。此实施例条件下黄蜀葵花多糖的回收率为83.23％。
(2)黄蜀葵花黄酮的制备
取黄蜀葵花(产地：黑龙江)100g，以料液比1:20加入2L蒸馏水，加热回流提取2h，提取2次，由于提取后滤液太粘稠，过滤的方法不能将固液分离；采用离心机离心分离，转速8000r/min，离心15min，收集滤液，滤液减压蒸馏至0.1L，加入95％的乙醇调节溶液中乙醇浓度至75％，4℃冰箱中放置24h，除去粗多糖，收集滤液，减压蒸馏浓缩，真空干燥，即得到粗提物1.03g，测定黄酮含量为5.46％，黄酮含量太低，不能继续分离纯化。
对比例2
(1)黄蜀葵花多糖的制备
取黄蜀葵花(产地：黑龙江)100g，以料液比1:20加入2L 95％的乙醇蒸馏水，加热回流提取2h，提取2次，收集合并滤液，滤液减压蒸馏至0.1L，加入95％的乙醇调节溶液中乙醇浓度至75％，4℃冰箱中放置24h，收集沉淀粗多糖，真空干燥箱干燥，得到粗多糖3.12g，采用硫酸-苯酚比色法测定多糖含量为42.37％。粗多糖量较少，未继续分离纯化。
(2)黄蜀葵花黄酮的制备
取黄蜀葵花100g，以料液比1:20加入2L 95％的乙醇，加热回流提取2h，提取2次，过滤合并滤液，滤液减压蒸馏至0.1L，加入95％的乙醇调节溶液中乙醇浓度至75％，4℃冰箱中放置24h，除去粗多糖，收集滤液，减压蒸馏浓缩，真空干燥，即得到粗黄酮样品7.15g，黄酮含量为32.53％。
取上述粗黄酮样品，使用150mL 20％的乙醇溶解后，AB-8大孔树脂吸附(柱体积180mL)，先用纯水冲洗除杂，在使用65％的乙醇洗脱至无色，收集洗脱液减压蒸馏浓缩至100mL，加入乙醇调节溶液中醇浓度至20％，继续使用LXS865大孔树脂吸附(柱体积150mL)，58％的乙醇洗脱至无色，收集洗脱液减压蒸馏浓缩后，真空干燥即得黄蜀葵花总黄酮2.66g，黄酮含量为75.58％，此实施例条件下黄蜀葵花黄酮回收率为86.44％。

Claims (5)

1.一种同时提取黄蜀葵花多糖及黄酮的方法，其特征在于：采用乙醇/水体系加热回流提取黄蜀葵花，醇沉分离沉淀得粗多糖，上清液浓缩真空干燥得到粗黄酮，分离到的多糖及黄酮分别采用吸附大孔树脂洗脱分离，并采用脱色树脂对二者脱色除杂，分别制备得到高纯度的黄蜀葵花多糖及黄酮。
2.按权利要求1所述的同时提取黄蜀葵花多糖及黄酮的方法，其特征在于：所述乙醇/水体系为55％-70％乙醇/水体系。
3.按权利要求2所述的同时提取黄蜀葵花多糖及黄酮的方法，其特征在于：取黄蜀葵花粉碎后，以料液质量体积比比1:10-1:20的比例加入55％-70％的乙醇水溶液回流反复提取2-3次，每次2h，过滤合并上清液；上清液减压蒸馏浓缩至原体积的10％-20％，加入95％的乙醇，使溶液中乙醇的体积分数为75％-80％，置4℃冰箱中24h收集沉淀为粗多糖，上清液减压蒸馏至稠状为粗黄酮。
4.按权利要求1所述的同时提取黄蜀葵花多糖及黄酮的方法，其特征在于：所述粗多糖经水溶解，按多糖水溶液体积的1/4加入Sevage试剂混合，充分振荡后静置，离心收集滤液，浓缩，真空干燥得到粗多糖；干燥后多糖使用10％-20％的乙醇水溶液溶解，溶解后经S-8大孔树脂柱层析吸附，以纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，浓缩至溶解液体积的60％-80％，浓缩液再使用乙醇调节溶液中乙醇浓度至2％-8％，继续使用LXS869大孔树脂柱层析吸附，纯水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，减压蒸馏旋干溶剂后即得到纯度为95％以上的黄蜀葵花多糖。
5.按权利要求1所述的同时提取黄蜀葵花多糖及黄酮的方法，其特征在于：所述粗黄酮样品使用20-25％的乙醇水溶液溶解后，通过AB-8大孔树脂吸附，采用体积比为20:80-80：20的乙醇-水体系进行梯度洗脱，收集65％乙醇水溶液洗脱获得洗脱液，洗脱液减压蒸馏浓缩至溶解液体积的80％-90％，加入乙醇调节溶液中醇浓度至20％-25％，再使用LXS865大孔树脂吸附，采用58％的乙醇水溶液洗脱至无色，收集洗脱液减压蒸馏浓缩后，真空干燥即得纯度为74％以上的黄蜀葵花黄酮。
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