CN113943379A - 烟草废弃物水提液中多糖的提取方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了烟草废弃物水提液中多糖的提取方法及其在抑制肿瘤细胞中的应用，提取方法包括制备粗多糖、脱色、层析纯化，前述多糖可应用于抑制人非小细胞肺癌细胞A549。本发明能够很好地提取、分离、纯化烟草废弃物水提液中的多糖，并能对A549取得良好的抑制效果。

Description

烟草废弃物水提液中多糖的提取方法及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，特别涉及到烟草废弃物水提液中多糖的提取、分离纯化方法及活性探究。
背景技术
在造纸法再造烟叶的工艺流程中，使用水浸提烟草废弃物，经过固液分离、薄膜浓缩获得了高浓度烟草废弃物水提液(Tobacco waste extract，TWE)，是造纸法再造烟叶一种十分重要的中间产物。TWE这种高浓度的水提取液，含有大量的烟草内源水溶性化合物，密度为1.3g/cm3，pH值为4，还原糖含量为163.8g/L，尼古丁含量为19.5g/L(根据具体的工艺及烟草原料，其具体数值会有些变化)，可知TWE中的糖含量极高。
作为一种植物多糖，可能像大多数由醛糖或酮糖缩合而成的天然高分子聚合物一样，具有降血糖降血脂、抗氧化、增强免疫、抗肿瘤、抗疲劳、抑菌等功能活性，从而在药品、食品、保健品、护肤品等方面获得应用。然而，迄今对于烟草多糖的研究主要致力于提高卷烟的感官质量，而对其活性尤其是抗肿瘤方面的研究应用较少。
发明内容
本发明的目的是从TWE原液中提取得到多糖，并研究其在抑制肿瘤中的应用。
为此，本发明采用的技术方案是这样的：
烟草废弃物水提液中多糖的提取方法，包括下述步骤：
1)粗多糖制备
1.1)量取烟草废弃物水提液，加入等比例的蒸馏水，8000rpm离心20min；
1.2)将上清液边搅拌边倒入4倍体积的无水乙醇中，保鲜膜封口，室温醇沉过夜；
1.3)倒掉上清，保留沉淀，加入蒸馏水复溶，得到粗多糖溶液。
进一步地，还包括下述步骤：
2)将粗多糖溶液置于烧杯中，用氢氧化钠溶液调pH至9.0，逐滴加入30％H2O2并搅拌，30％H2O2用量为10％，60℃水浴搅拌3h，冷却静置，抽滤，保留滤液；
或者采用这样的步骤：
2)往粗多糖溶液中加入质量比50％的AB-8大孔吸附树脂，放入30℃、180rpm的摇床振荡4h，抽滤，保留滤液；
又或者采用这样的步骤：
2)往粗多糖溶液中加入质量比50％的AB-8大孔吸附树脂，放入30℃、180rpm的摇床振荡4h，抽滤，保留AB-8大孔吸附树脂，加入50％乙醇，放入30℃、180rpm的摇床中振荡4h，抽滤，保留滤液。
更进一步地，还包括下述步骤：
3)粗多糖层析纯化
3.1)将上步所得的粗多糖溶液透析冻干；
3.2)称取上步所得多糖，溶于两倍质量的蒸馏水中，1000rpm离心2min，取上清液均匀滴加到DEAE-Sepharose FF离子柱上表面，采用非梯度洗脱的方法分离纯化TWE多糖；
3.3)用苯酚-硫酸法检测流出液是否含糖并收集含糖组分，旋蒸浓缩，冷冻干燥，然后用蒸馏水或NaCl溶液洗脱。
本发明的另一个技术方案是这样的：
前述多糖应用于抑制肿瘤细胞。
具体地，前述多糖应用于抑制人非小细胞肺癌细胞A549。
本发明能够很好地提取、分离、纯化烟草废弃物水提液中的多糖，并能对A549取得良好的抑制效果。
附图说明
图1是实施例的制备流程图。
图2是不同浓度的TWE粗多糖对A549细胞的抑制效果。
图3是不同浓度的TWE多糖分离组分对A549细胞的抑制效果。
具体实施方式
本实施例的过程如下：
1、粗多糖制备
1)用量筒量取500mL烟末浸提液(TWE)，加入500mL蒸馏水1∶1稀释，均分成两份装入500mL离心管中，8000rpm离心20min；
2)将上清液边搅拌边倒入4倍体积的无水乙醇中，保鲜膜封口，室温醇沉过夜；
3)倒掉上清，保留沉淀，加入800mL蒸馏水复溶，得到TWE粗多糖溶液；
2、粗多糖脱色
分别用3种不同的方法除色素：
对照(A组)：不脱色，3500Da透析袋透析，冻干，将样品标记为TWE-U；
H2O2脱色(B组)：将TWE粗多糖溶液置于烧杯中，用氢氧化钠溶液调pH至9.0，逐滴加入30％H2O2并搅拌，30％H2O2用量为10％，60℃水浴搅拌3h，冷却静置，抽滤，保留滤液，3500Da透析袋透析，冻干，将样品标记为TWE-P；
大孔树脂脱色(C组)：往TWE粗多糖溶液中加入AB-8大孔吸附树脂，用量为50％，放入30℃、180rpm的摇床振荡4h，抽滤，保留滤液，3500Da透析袋透析，冻干，将样品标记为TWE-W；往脱色后的AB-8树脂中加入800mL的50％乙醇，放入30℃、180rpm的摇床中振荡4h，抽滤，保留滤液，3500Da透析袋透析，冻干，将样品标记为TWE-E；
活性炭脱色(D组)：往TWE粗多糖溶液中加入活性炭颗粒，用量为1.5％，在pH5.0、60℃水浴条件下脱色45min，冷却静置，抽滤，保留滤液，3500Da透析袋透析，冻干，将样品标记为TWE-C；往脱色后的活性炭中加入800mL的50％乙醇，放入30℃、180rpm的摇床中振荡45min，抽滤，保留滤液，3500Da透析袋透析，冻干，将样品标记为TWE-EC。
3、粗多糖层析纯化
通过上述步骤，可以从TWE中提取得到经4种脱色方法处理的共6种TWE多糖，分别标记为TWE-U、TWE-P、TWE-W、TWE-E、TWE-C、TWE-EC，还需要经过DEAE-Sepharose FF离子柱进行分离纯化，包括下述步骤：
1)上样：将10g TWE多糖溶于20mL蒸馏水中，1000rpm离心2min，取上清液均匀滴加到DEAE-Sepharose FF离子柱上表面，采用非梯度洗脱的方法分离纯化TWE多糖；
2)蒸馏水洗脱：用苯酚-硫酸法检测流出液是否含糖并收集含糖组分，旋蒸浓缩，冷冻干燥，将样品标记为TWE-0，为了使TWE多糖与离子柱充分结合，用至少1L蒸馏水洗脱；
3)0.2M NaCl溶液洗脱：用苯酚-硫酸法检测流出液是否含糖并收集含糖组分，3500Da透析袋透析除盐，用0.02M AgNO3溶液检测透析液中是否含有Cl-，旋蒸浓缩，冷冻干燥，将样品标记为TWE-0.2；
4)0.4M NaCl溶液洗脱：用苯酚-硫酸法检测流出液是否含糖并收集含糖组分，3500Da透析袋透析除盐，用0.02M AgNO3溶液检测透析液中是否含有Cl-，旋蒸浓缩，冷冻干燥，将样品标记为TWE-0.4；
5)2M NaCl溶液洗脱：用苯酚-硫酸法检测流出液是否含糖并收集含糖组分，3500Da透析袋透析除盐，用0.02M AgNO3溶液检测透析液中是否含有Cl-，旋蒸浓缩，冷冻干燥，将样品标记为TWE-2；
4、多糖制品的肿瘤细胞抑制活性
通过上述步骤，可以得到纯度相对较高的TWE多糖的分离纯化组分，采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,噻唑蓝)比色法检测TWE多糖及其分离纯化组分对人非小细胞肺癌细胞A549的抑制效果，包括下述步骤：
1)配制样品：称取适量的样品用无菌PBS(磷酸盐缓冲液)溶解，并用0.22μm的灭菌滤头过滤除菌，再用无菌PBS稀释到相应的浓度；
2)收集对数期细胞铺板：将A549细胞以5000个细胞/100μL/孔的密度种植在96孔细胞培养板中(边缘孔用无菌PBS填充)，将细胞培养板放入5％CO2、37℃的CO2培养箱中培养；
3)24h后，每孔加入10μL样品；
4)继续培养24h后，通过显微镜观察细胞形态，每孔加入10μL MTT(噻唑蓝)溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，培养4h；
5)4h后，终止培养。小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，置于摇床低速振荡10min，使结晶充分溶解；
6)用酶联免疫检测仪测各孔的吸光值A490nm；
7)计算抑制率：
抑制率＝(1-实验组/平均对照组)×100％
参见附图1。TWE多糖的制备和纯化按照图1所示流程进行，共获得22种多糖，分别为6种脱色TWE多糖(TWE-U、TWE-P、TWE-W、TWE-E、TWE-C、TWE-EC以及16种分离纯化后的TWE多糖(TWE-U-0、TWE-U-0.2、TWE-U-0.4、TWE-U-2、TWE-P-0、TWE-P-0.2、TWE-P-0.4、TWE-P-2、TWE-W-0、TWE-W-0.2、TWE-W-0.4、TWE-W-2、TWE-E-0、TWE-E-0.2、TWE-E-0.4、TWE-E-2)。
表1 TWE多糖的脱色效果比较
Figure BDA0003335717120000051
比较3种脱色方法结果(表1)，发现大孔树脂AB-8的脱色效果最好，30％的H2O2脱色效果次之，而活性炭颗粒几乎没有脱色效果。经AB-8大孔树脂脱色得到的TWE多糖(TWE-W)的纯度也是最高的，比未脱色的(TWE-U)提高了约14％，但产率很低。这可能是因为大孔树脂在吸附色素时也吸附了部分多糖，而大孔树脂醇洗组分(TWE-E)的纯度为34.54％，恰好证明了这一猜测。
表2 TWE多糖分离组分的得率
Figure BDA0003335717120000052
Figure BDA0003335717120000061
TWE-U的总得率最低(表2)，可能是因为样品中色素含量高，在分离纯化过程中色素被DEAE-Sepharose FF离子柱吸附。
本发明共制备得到了6种脱色TWE多糖(TWE-U、TWE-P、TWE-W、TWE-E、TWE-C、TWE-EC)以及16种分离纯化后的TWE多糖(TWE-U-0、TWE-U-0.2、TWE-U-0.4、TWE-U-2、TWE-P-0、TWE-P-0.2、TWE-P-0.4、TWE-P-2、TWE-W-0、TWE-W-0.2、TWE-W-0.4、TWE-W-2、TWE-E-0、TWE-E-0.2、TWE-E-0.4、TWE-E-2)，并检测了这22种TWE多糖对A549细胞的抑制效果。
从图2可知，TWE-U、TWE-E、TWE-C、TWE-EC对A549细胞活性的抑制率基本上呈浓度依赖性，且在某一浓度抑制率突然急遽增加；TWE-P、TWE-W在浓度介于2-10mg/mL之间时，抑制率变化均不大，且均小于50％；其中抑制效果最好的为TWE-U，在低浓度(2mg/mL)时抑制率就达到了50％；结合脱色效果，猜测TWE-U、TWE-E、TWE-C、TWE-EC对A549细胞活性的抑制作用有可能来自于色素类物质，也可能是脱色时将TWE多糖中对A549细胞起抑制作用的活性成分破坏了；TWE-P的分离组分对A549细胞活性的抑制率较未分离的好。
从图3可知，TWE多糖各分离组分对A549细胞活性的抑制率基本上也呈浓度依赖性；这16个样品中，对A549细胞活性的抑制率达到50％以上的有TWE-U-0.4、TWE-P-0、TWE-P-2。
综合来看，TWE-U中起抑制作用的有效成分可能为TWE-U-0.4；TWE-P分离纯化后的组分活性比TWE-P要好；TWE-W和TWE-E的活性比分离纯化后的组分更好。

Claims (7)

1.烟草废弃物水提液中多糖的提取方法，包括下述步骤：
1)粗多糖制备
1.1)量取烟草废弃物水提液，加入等比例的蒸馏水，8000rpm离心20min；
1.2)将上清液边搅拌边倒入4倍体积的无水乙醇中，保鲜膜封口，室温醇沉过夜；
1.3)倒掉上清，保留沉淀，加入蒸馏水复溶，得到粗多糖溶液。
2.如权利要求1所述的方法，还包括下述步骤：
2)将粗多糖溶液置于烧杯中，用氢氧化钠溶液调pH至9.0，逐滴加入30％H2O2并搅拌，30％H2O2用量为10％，60℃水浴搅拌3h，冷却静置，抽滤，保留滤液。
3.如权利要求1所述的方法，还包括下述步骤：
2)往粗多糖溶液中加入质量比50％的AB-8大孔吸附树脂，放入30℃、180rpm的摇床振荡4h，抽滤，保留滤液。
4.如权利要求1所述的方法，还包括下述步骤：
2)往粗多糖溶液中加入质量比50％的AB-8大孔吸附树脂，放入30℃、180rpm的摇床振荡4h，抽滤，保留AB-8大孔吸附树脂，加入50％乙醇，放入30℃、180rpm的摇床中振荡4h，抽滤，保留滤液。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，还包括下述步骤：
3)粗多糖层析纯化
3.1)将上步所得的粗多糖溶液透析冻干；
3.2)称取上步所得多糖，溶于两倍质量的蒸馏水中，1000rpm离心2min，取上清液均匀滴加到DEAE-Sepharose FF离子柱上表面，采用非梯度洗脱的方法分离纯化TWE多糖；
3.3)用苯酚-硫酸法检测流出液是否含糖并收集含糖组分，旋蒸浓缩，冷冻干燥，然后用蒸馏水或NaCl溶液洗脱。
6.多糖应用于抑制肿瘤细胞，所述的多糖是以权利要求1-5任一项所述方法提取而得。
7.多糖应用于抑制人非小细胞肺癌细胞A549，所述的多糖是以权利要求1-5任一项所述方法提取而得。
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