CN103910808A - 一种香料烟花蕾多糖、其制备方法及其作为抗氧化剂的应用 - Google Patents

一种香料烟花蕾多糖、其制备方法及其作为抗氧化剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种香料烟花蕾多糖，其制备方法包括以下步骤：按照料液比为1∶20-40的比例向预处理后的香料烟花蕾中添加蒸馏水，于50-80℃、200-500W下超声提取4-8min，然后离心，取上清液旋转蒸发浓缩后醇析静置，离心取沉淀，采用Sevage法脱除蛋白后再次醇析静置并离心取沉淀，经后处理即得；同时公开了该多糖作为抗氧化剂的应用。本发明从烟草花蕾中提取多糖，不仅能够减少烟草加香的成本，并且烟草花蕾多糖能在烟草中发挥其清除自由基、抗癌等活性，给广大烟民带来了福音。本发明方法提取时间短，提取率高，适用于工业生产。

Description

一种香料烟花蕾多糖、其制备方法及其作为抗氧化剂的应用
技术领域
        本发明属于烟草产品技术领域，具体涉及一种香料烟花蕾多糖、其制备方法及其作为抗氧化剂的应用。
背景技术
多糖，又称多聚糖，是由单糖组成的高分子化合物。它是来自高等植物、动物细胞膜以及微生物细胞的天然大分子物质，它是由十个到上万个单糖基以糖苷键结合而成的天然大分子物质，由于其分子式为(CH2O)n，所以通常人们又称其为“碳水化合物”。 我国对多糖的研究起步相对较晚，起始于20世纪70年代，1982年中国生物化学协会在青岛召开第一次糖的生物学术会议。随后，全国各地掀起多糖研究的热潮，研究的对象涉及真菌类、植物、动物以及花粉等多种来源的多糖；近年来，国内对大量中草药多糖及糖缀合物如天门冬、纯毛石耳、山药、枸杞、芦荟、月皮、松子壳、玉米穗、白木通、板蓝根、酸枣仁多糖等进行了深入的化学结构分析和广泛的生物活性研究，相继报道了它们具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫能力等药理作用。
多糖的提取一般采用热水、酸、碱、乙醇等作为溶剂，并且多数采用热水浸提法进行粗提。聂凌鸿采用热水浸提广东淮山水溶性多糖, 在固液比1∶8，浸提温度45℃，浸提时间2h的最佳工艺条件下，提取率为0.2816%。而在固液比1∶8，NaOH浓度为0.3mol/L, 浸提时间为1h的最佳碱提工艺条件下, 广东淮山水溶性多糖的提取率为0.2529%。在广东淮山水溶性多糖的最佳提取工艺中, 碱提具有相对较快的速度, 而热水浸提能够得到相对较高的提取率。另外, 也可以两种溶剂结合使用。水提取的缺点是提取温度高, 耗时长且效率低, 成本高, 安全性低, 而酸碱提取易破坏多糖的空间结构及活性。
国内在对于烟草花蕾基础方面的研究还刚刚起步，在相关文献中仅见少量报告。因此设计一种烟草花蕾多糖的提取方法十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种香料烟花蕾多糖、其制备方法及其作为抗氧化剂的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种香料烟花蕾多糖的制备方法，包括以下步骤：按照料液比为1∶20-40（质量体积比g∶ml）的比例向预处理后的香料烟花蕾中添加蒸馏水，于50-80℃、200-500W下超声提取4-8min，然后离心，取上清液旋转蒸发（优选为65-75℃）浓缩后醇析静置，离心取沉淀，再次溶解沉淀后采用Sevage法脱除蛋白后再次醇析静置并离心取沉淀，经后处理（所述后处理方法为：真空冷冻干燥）即得香料烟花蕾多糖。
制得的香料烟花蕾多糖再利用层析柱分离纯化后得精制多糖。
所用层析柱的填料为Sepharose CL-6B；洗脱液为0.2 mol/L的NaCl溶液。
所述预处理将香料烟花蕾干燥后粉碎至50-70目。
上述方法中，醇析静置时的温度为2-6℃，静置时间为10-14h；离心时离心速率为8000-10000r/min，离心时间为10-15min，离心时的温度为2-6℃。
为达到较高的提取率，较好的，上述方法中，选用以下参数：料液比为1∶35；超声提取温度为70℃，超声提取的功率为300w，超声提取时间为6min；离心温度为4℃。
利用上述方法制得的香料烟花蕾多糖。
上述方法制得的香料烟花蕾多糖作为抗氧化剂的应用。
Sevage法脱除蛋白采用本领域常规技术即可。醇析静置时优选使用无水乙醇进行醇析。
本发明在单因素实验分析的基础上，确定了超声波法提取香料烟花蕾多糖的最佳工艺为：功率300W、时间6min、料液比1:35、温度70℃，在这个条件下，香料烟花蕾多糖有最大提取率，为2.62%；此外，采用邻二氮菲法确定了香料烟花蕾多糖对羟基自由基的清除活性比较显著；采用DPPH法检测确定了香料烟花蕾多糖具有较好的DPPH·自由基清除能力，两种方法证明了香料烟花蕾多糖是一种良好的抗氧化物质。
本发明采用超声辅助水提法提取香料烟烟草花蕾多糖，超声辅助水提法比传统方法更有效率。与传统萃取相比，超声辅助水提取法能够显著缩短提取的时间、提高提取率，是一种高效实用的多糖提取方法，适用于工业生产。
超声的工作机理如下：超声的机械化学作用通过破坏细胞壁和加强细胞内的传质作用，提高了植物中有机化合物的提取速度。超声波在液体内传播时，液体介质不断受到压缩和拉伸，在拉力作用下，液体断裂形成暂时的近似真空的空洞，压缩时，这些空洞就会发生崩溃，出现局部高温以及放电现象，产生空化作用。超声波空化可以从稳态空化转化成瞬态空化，空化泡瞬间长大破裂，吸收的能量在极短的时间和极小的空间内释放出来，形成高温高压的环境，同时伴随有一定强度的冲击波和微声流，从而破坏细胞壁结构, 使其在瞬间破裂，释放细胞内的有效成分，大大提高了提取率。超声方法比传统方法更有效率，并且超声波萃取法并不影响水溶性多糖的生物性能。
烟草燃烧过程中的潜香类物质能释放出对人的香味感受起着重要作用的香味成分。这类化合物具有在自然条件下挥发性弱，化学性质稳定的特点。在烟草中糖类物质与其他化合物之间通过反应形成的烟草糖苷化合物就是非常重要的一类潜香化学物质。因此糖类是加香时很重要的一种物质，本发明从烟草花蕾中提取多糖，不仅能够减少烟草加香的成本，并且烟草花蕾多糖能在烟草中发挥其清除自由基、抗癌等活性，给广大烟民带来了福音。
附图说明
图1为香料烟花蕾多糖组分Fr-I和Fr-II的 Sepharose CL-6B层析柱分离图谱；
图2为香料烟花蕾多糖组分Fr-I和Fr-II的红外鉴定图谱；
图3为香料烟花蕾多糖组分Fr-I和Fr-II对OH·自由基的清除能力；
图4为香料烟花蕾多糖组分Fr-I和Fr-II对DPPH·自由基的清除能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
下述实施例中所述香料烟花蕾为巴斯玛1号香料烟花蕾，采摘自云南；Sevage试剂选用体积比为5:1的氯仿/正丁醇混合溶液。
实施例1
（1）将香料烟花蕾自然风干后粉碎至50-70目得预处理后的香料烟花蕾10g；
（2）按照料液比为1∶20（质量体积比g∶ml）的比例向预处理后的香料烟花蕾中添加蒸馏水，于50℃、200W下超声提取8min，接着2℃、8000r/min下离心15min后取上清液，65℃下将上清液旋转蒸发浓缩至原来体积的1/2；
（3）2℃下向浓缩液中加入无水乙醇，醇析静置14h，接着2℃、8000r/min下离心15min后取沉淀，再次蒸馏水溶解沉淀之后利用Sevage法脱除蛋白，取上层多糖溶液；
（4）2℃下向多糖溶液中加入无水乙醇，醇析静置14h，然后2℃、8000r/min下离心15min取沉淀，再经真空冷冻干燥即得香料烟花蕾多糖0.2g。
实施例2
（1）将香料烟花蕾自然风干后粉碎至50-70目得预处理后的香料烟花蕾10g；
（2）按照料液比为1∶35（质量体积比g∶ml）的比例向预处理后的香料烟花蕾中添加蒸馏水，于70℃、300W下超声提取6min，接着4℃、10000r/min下离心12min后取上清液，70℃下将上清液旋转蒸发浓缩至原来体积的1/3；
（3）4℃下向浓缩液中加入无水乙醇，醇析静置12h，接着4℃、10000r/min下离心12min后取沉淀，再次蒸馏水溶解沉淀之后利用Sevage法脱除蛋白，取上层多糖溶液；
（4）4℃下向多糖溶液中加入无水乙醇，醇析静置12h，然后4℃、10000r/min下离心12min取沉淀，再经真空冷冻干燥即得香料烟花蕾多糖0.262g。
实施例3
（1）将香料烟花蕾自然风干后粉碎至50-70目得预处理后的香料烟花蕾10g；
（2）按照料液比为1∶40（质量体积比g∶ml）的比例向预处理后的香料烟花蕾中添加蒸馏水，于80℃、500W下超声提取4min，接着6℃、9000r/min下离心10min后取上清液，75℃下将上清液旋转蒸发浓缩至原来体积的2/3；
（3）6℃下向浓缩液中加入无水乙醇，醇析静置10h，接着6℃、9000r/min下离心10min后取沉淀，再次蒸馏水溶解沉淀之后利用Sevage法脱除蛋白，取上层多糖溶液；
（4）6℃下向多糖溶液中加入无水乙醇，醇析静置10h，然后6℃、9000r/min下离心10min取沉淀，再经真空冷冻干燥即得香料烟花蕾多糖0.235g。
将上述实施例中制得的香料烟花蕾多糖用层析柱进行分离和纯化，获得精制多糖；所用层析柱（2.5×60cm）的填料为Sepharose CL-6B；洗脱液为0.2 mol/L NaCl溶液。具体操作为：取50mg香料烟花蕾多糖，用5mL 0.2 mol/L NaCl溶液溶解后，过孔径0.22μm的滤膜，上柱，洗脱液以0.6mL /min的流速进行洗脱，部分收集器收集，150滴/管。每管取1mL精制多糖溶液，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量。重复上柱5次。将同一组分的多糖收集在一起，浓缩透析（透析袋分子量3500）后，0℃冷冻干燥。采用傅里叶红外光谱技术对其分子结构进行表征，确认获得的两个多糖组分为Fr-I和Fr-II，结果见图1和2。
最佳工艺条件的确定
通过单因素试验确定功率、时间、料液比、温度四个因素对香料花蕾多糖提取率的最佳水平。
功率：在料液比1∶30(质量体积比g∶ml)，提取温度60℃，提取时间4min，超声波功率分别为100、200、300、400、500 W的条件下进行试验，得出最佳功率水平，选择200W、300W和400W三个水平设计正交试验。
时间：在超声波功率300 W，提取温度60℃，料液比1∶30(m∶v)，提取时间分别为2、4、6、8、10 min的条件下进行试验，得出最佳时间水平，选择2min、4min和6min三个水平设计正交试验。
料液比：在超声波功率300 W，提取温度60℃，提取时间4 min，料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1：40(质量体积比g∶ml的条件下进行试验，得出最佳料液比水平，选择1∶25、1∶30和1∶35三个水平设计正交试验。
温度：超声波功率300 W，料液比l∶30(质量体积比g∶ml)，提取时间4min，提取温度分别为40、50、60、70、80℃的条件下进行试验，得出最佳温度水平，选择50℃、60℃和70℃三个温度水平进行正交试验。
正交试验：在单因素实验分析的基础上，选择了200W、300W和400W三个功率水平，2min、4min和6min三个时间水平，1∶25、1∶30和1∶35三个料液比水平，50℃、60℃和70℃三个温度水平,进行正交试验，可得出超声波法提取香料烟花蕾多糖的最佳工艺为：功率300W、时间6min、料液比1∶35、温度70℃时，在这个条件下，采用紫外可见分光光度计，运用苯酚-硫酸显色法测得香料烟花蕾多糖有最大提取率，为2.62%，结果见表1。
表1：香料烟花蕾多糖超声提取正交试验结果
应用试验：香料烟花蕾多糖的抗氧化研究
1、香料烟花蕾多糖组分Fr-I和Fr-II对OH·自由基清除率的测定：
取1mL 7.5mmol/L邻二氮菲于比色管中，再加1.0mL磷酸缓冲液（pH=7.2），混匀，加入1mL 7.5mmol/L硫酸亚铁溶液，逐滴加入后立即摇匀，然后加入1mL 0.1％的双氧水，加入蒸馏水至5mL。将比色管置于37℃的恒温水浴锅中反应1.5h，在536nm波长下测定吸光度A536（损伤）。
同上法，不加入双氧水，测定A536（未损伤）。
同上法，加入0.5mL 0.1％双氧水，再分别加入不同浓度（0.5、0.8、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mg/mL）的实施例2所得的香料烟花蕾多糖样液，分别测定A536（加样）。
香料烟花蕾多糖组分Fr-I和Fr-II对OH·自由基的清除率I计算方法如下：
I=（A536（加样）－A536（损伤））/（A536（未损伤）－A536（损伤））×100％
试验中还用抗坏血酸进行对照比较，结果如图3所示，当浓度为4.0mg/mL时-OH自由基清除率达到98.6%，说明香料烟花蕾多糖对OH·自由基的清除活性比较显著，是一种良好的抗氧化物质，可作为抗氧化剂。
2、香料烟花蕾多糖组分Fr-I和Fr-II对DPPH·自由基清除率的测定：
准确称取实施例2所得香料烟花蕾多糖0.010mg，溶于10ml蒸馏水中充分混匀，配制成1mg/mL的多糖母液。用蒸馏水将多糖母液稀释成5种浓度：0.2、0.4、0.6、0.8、1、2mg/mL各2mL。试验分为样品组、对照组和空白组：取2 ml DPPH有机溶液，加入10ml具塞试管中，再加入2mL样品溶液，充分混匀，静置30min后在517nm处测定吸光度，记为A2；取2 mL DPPH有机溶液，再加入2mL无水乙醇，充分混匀，静置30min后在517nm处测定吸光度，记为A0；取2 mL无水乙醇，再加入2mL样品溶液，在517nm处测定吸光度，记为A1。
香料烟花蕾多糖组分Fr-I和Fr-II对DPPH·自由基的清除率E计算方法如下：E=[1-(A2-A1)/A0]×100％。
试验中还用抗坏血酸进行对照比较，结果如图4所示，当浓度为0.4mg/mL时，香料烟花蕾多糖对DPPH·自由基清除率为72.9%，当浓度为1mg/mL时对DPPH·自由基清除率为88.2%，说明香料烟花蕾多糖具有较好的DPPH·自由基清除能力，是一种良好的抗氧化物质，可以作为抗氧化剂。

Claims (9)

1.一种香料烟花蕾多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按照料液比为1∶20-40的比例向预处理后的香料烟花蕾中添加蒸馏水，于50-80℃、200-500W下超声提取4-8min，然后离心，取上清液旋转蒸发浓缩后醇析静置，离心取沉淀，采用Sevage法脱除蛋白后再次醇析静置并离心取沉淀，经后处理即得香料烟花蕾多糖。
2.如权利要求1所述的香料烟花蕾多糖的制备方法，其特征在于：利用层析柱将香料烟花蕾多糖分离纯化后得精制多糖。
3.如权利要求2所述的香料烟花蕾多糖的制备方法，其特征在于：所用层析柱的填料为Sepharose CL-6B；洗脱液为0.2mol/L的NaCl溶液。
4.如权利要求1所述的香料烟花蕾多糖的制备方法，其特征在于：所述预处理为将香料烟花蕾干燥后粉碎至50-70目。
5.如权利要求1所述的香料烟花蕾多糖的制备方法，其特征在于：醇析静置时的温度为2-6℃，静置时间为10-14h。
6.如权利要求1所述的香料烟花蕾多糖的制备方法，其特征在于：离心时离心速率为8000-10000r/min，离心时间为10-15min，离心时的温度为2-6℃。
7.如权利要求1所述的香料烟花蕾多糖的制备方法，其特征在于：料液比为1∶35；超声提取温度为70℃，超声提取的功率为300W，超声提取时间为6min；离心温度为4℃。
8.利用权利要求1-7任一所述的香料烟花蕾多糖的制备方法制备的香料烟花蕾多糖。
9.权利要求8所述的香料烟花蕾多糖作为抗氧化剂的应用。
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