CN113933401B - 分离检测阿伐斯汀中间体z3中基因毒性杂质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种分离测定阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的方法。本发明方法采用的色谱柱是十八烷基键合硅胶为填料，采用缓冲盐溶液、有机溶液进行梯度洗脱，将阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质进行分离检测；检测波长为270±5nm；流速为每分钟0.9～1.1ml；柱温为30±2℃。本发明方法采用高灵敏度、高耐用性色谱方法，可在24分钟内将基因毒性杂质和可能转化为含基因毒性结构的杂质与供试品主峰及供试品中可能存在的其他13个已知杂质很好分离，提供了现有技术未能解决的基因毒性杂质的分离测定问题；本分析方法时间短、灵敏度高、专属性强、重现性好、操作简单可行。

Description

分离检测阿伐斯汀中间体Z3中基因毒性杂质的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC法分离测定阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的方法。

背景技术

阿伐斯汀是一种中等强度的竞争性组织胺H1受休拮抗剂，属于抗组胺药。密度：1.17g/cm³，熔点：222℃(熔融分解)。是以2,6-二溴吡啶为起始原料,经酰化反应,HECK反应得到(E)-3-[6-[(4-甲苯基)羰基]-2-吡啶基]丙烯酸乙酯，再经Wittig反应得到(E)-6-[(E/Z)-3-(1-吡咯烷基)-1-(4-甲基苯基)丙烯基]-2-吡啶丙烯酸乙酯，经酸转化，水解，重结晶得阿伐斯汀。

阿伐斯汀能与组织胺竞争效应细胞上的组织胺H1受体，使组织胺不能同H1受体结合，从而抑制其引起过敏反应。没有明显的抗胆碱作用，对中枢神经系统的穿透能力低。因此，抗胆碱副作用和对中枢神经系统的副作用小。本品主要以原形经肾排泄。阿伐斯汀可以治疗过敏性鼻炎、过敏性皮肤疾病、慢性自发性荨麻疹、症状性皮肤划痕症、胆碱性荨麻疹、自发的后日性寒冷感冒荨麻疹、湿疹痕痒。

阿伐斯汀中间体Z₃，根据其合成工艺路线，存在诸多杂质，其中杂质Z_1c为基因毒性杂质，杂质Z_3x可能转为基因毒性杂质；

由于杂质Z_1c为基因毒性杂质，杂质Z_3x可能转化为基因毒性杂质，因此需在中间体Z₃中控制至较低限度。目前暂无定分析方法及文献分析方法可将杂质Z_1c和杂质Z_3x与中间体Z₃及Z₃中可能含有的其余各已知杂质有效分离。

发明内容

本发明目的之一是提供一种分离阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的方法，该方法可有效分离阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质，确保药物原料安全性。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

分离阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的方法，所述方法采用的色谱柱是十八烷基键合硅胶为填料，采用流动相A、流动相B和流动相C进行梯度洗脱，将所述阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质进行分离；所述流动相A为缓冲盐溶液，流动相B、流动相C为有机溶液；所述阿伐斯汀中间体Z₃中相关杂质为杂质Z₁、杂质Z₂、杂质Z_2a、杂质Z_2b、杂质Z_2e、杂质Z_2f、杂质Z_3a、杂质Z_3b、杂质Z_3c、杂质Z_3d、杂质Z_3e、杂质Z_3f、杂质Z_3x1、杂质Z_1c和Z_3x中的一种或多种，基因毒性杂质为Z_1c和/或Z_3x；所述中间体Z₃及相关杂质结构式具体如下：

进一步，所述流动相A为0.05mol/L乙酸铵溶液、体积百分比浓度为0.2％的三乙胺溶液，使用磷酸将所述流动相A的pH调至3.8～4.2；

具体的，所述流动相A的pH为4；

进一步，所述流动相B为乙腈；所述流动相C为甲醇；

进一步，所述梯度洗脱程序为：

进一步，所述流动相流速为0.9～1.1ml/min；

具体的，所述流动相流速为1.0ml/min；

进一步，所述色谱柱柱温为28～32℃；

具体的，所述色谱柱柱温为30℃；

进一步，所述方法进样量为10～30μl；

具体的，所述方法进样量为20μl；

进一步，所述色谱柱为Thermo Acclaim C18 120 4.6mm×250mm，5μm。

本发明目的之二是提供一种检测阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的方法，该方法可以有效检测阿伐斯汀中间体Z₃中是否存在所述基因毒性杂质。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

检测阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的方法，利用目的一中所述的方法将阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质进行分离，通入检测器进行检测，将供试品色谱图与已知对照品色谱图进行对比，判定阿伐斯汀中间体Z₃中是否含有所述基因毒性杂质；所述检测器波长设定为270±5nm；

进一步，所述检测器波长设定为270nm。

本发明目的之三是提供一种测定阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的方法，该方法可以测定伐斯汀中间体Z₃中所述基因毒性杂质的含量。

为了实现上述目的，不发明的技术方案为：

测定阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的方法，所述方法具体包含以下步骤：

1)溶液配制：

取供试样品溶于稀释剂中，得供试品溶液；取所述基因毒性杂质对照品，用稀释剂溶解稀释得对照品溶液；

2)分离；

利用权目的一中所述的方法，将阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质进行分离；

3)检测；

利用目的二中所述的方法，检测阿伐斯汀中间体Z₃中是否存在所述基因毒性杂质；

4)测定；

根据检测得到的色谱图，以峰面积考察供试品溶液中阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的含量；

进一步，所述稀释剂及体积比为甲醇：水：甲酸：800:200:1。

本发明的有益效果在于：本发明方法采用高灵敏度、高耐用性色谱方法，可在24分钟内将基因毒性杂质Z_1c和可能转化为含基因毒性结构的杂质Z_3x与供试品主峰及供试品中可能存在的其他13个已知杂质很好分离，基因毒性杂质控制限度为0.00625％，提供了现有技术未能解决的杂质Z_1c和杂质Z_3x的分离测定问题；分析方法时间短、灵敏度高、专属性强、重现性好、操作简单可行。

附图说明

图1为专属性试验的HPLC色谱图；

图2为检测限试验的HPLC色谱图；

图3为色谱条件变化耐用性试验2的HPLC色谱图；

图4为色谱条件变化耐用性试验3的HPLC色谱图；

图5为色谱条件变化耐用性试验4的HPLC色谱图；

图6为色谱条件变化耐用性试验5的HPLC色谱图；

图7为色谱条件变化耐用性试验6的HPLC色谱图；

图8为色谱条件变化耐用性试验7的HPLC色谱图；

图9为色谱条件变化耐用性试验8的HPLC色谱图；

图10为色谱条件变化耐用性试验9的HPLC色谱图；

图11为色谱条件变化耐用性试验10的HPLC色谱图；

图12为色谱条件变化耐用性试验11的HPLC色谱图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

取本品适量，精密称定，加稀释剂[甲醇-水-甲酸(800:200:1)]使溶解并稀释制成每1ml中约含2.5mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。用十八烷基键合硅胶为填充剂(ThermoAcclaim C184.6mm×250mm，5μm，或效能相当的色谱柱)；以缓冲盐为流动相A(0.05mol/L乙酸铵(含有0.2％三乙胺，用磷酸调pH4.0)，以乙腈为流动相B，以甲醇为流动相C，按表1进行线性梯度洗脱，检测波长为270nm；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃。

取杂质Z_1c和Z_3x各适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中各含156ng的混合溶液，作为杂质对照品溶液。精密量取对照品溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按杂质Z_3x、Z_1c顺序出峰。取供试品同法测定，供试品溶液的色谱图中杂质Z_1c和Z_3x峰面积应不得大于对照品溶液中Z_1c和Z_3x峰面积(0.00625％)。

表1梯度洗脱表

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)	流动相C(％)
				0	72	20	8
1	72	20	8
				10	57	35	8
10.1	20	72	8
				17	20	72	8
17.1	72	20	8
				24	72	20	8

本方法基因毒性杂质控制限度为0.00625％，高灵敏度(LOD0.0014％)，将杂质Z_1c和杂质Z_3x与中间体Z₃中其他已知杂质及主成分有效分离。

实施例2

专属性

中间体Z3可能存在的其他杂质：杂质Z₁、杂质Z₂、杂质Z_2a、杂质Z_2b、杂质Z_2e、杂质Z_2f、杂质Z_3a、杂质Z_3b、杂质Z_3c、杂质Z_3d、杂质Z_3e、杂质Z_3f、杂质Z_3x1、杂质Z_1c和Z_3x共计15个杂质。我们对杂质Z_1c和Z_3x与其他13个杂质及主成分与间分离情况进行考察。

分别取空白溶液(稀释剂)、其他杂质及主成分混合溶液、杂质Z_1c定位溶液、杂质Z_3x定位溶液、供试品溶液、混合溶液各20μl，依法进样，记录色谱图，测定结果见表2、3，附图1。

表2专属性试验积分结果

表3专属性试验测定结果

结论：空白溶液不干扰杂质Z_1c和Z_3x的测定，供试品主成分及供试品可能存在的其他杂质与杂质Z_3x及Z_1c间分离度均大于1.5，方法专属性符合要求。

实施例3

检测限

取检测限溶液连续进样3次，计算主峰峰高与噪声的比值(信噪比)。试验结果见表4、5，附图2。

表4检测限测定积分结果

表5检测限测定结果

结论：杂质Z_3x检测限浓度为0.0354μg/ml，以供试品中存在浓度表示为0.0014％，信噪比均值为3.7；杂质Z_1c检测限浓度为0.0353μg/ml，以供试品中存在浓度表示为0.0014％，信噪比均值为4.3，均符合检测限测试的要求。

实施例4

色谱条件耐用性

取“专属性”项下混合溶液，分别使用正常流动相，预定测试的不同流动相比例、不同缓冲盐pH值、柱温以及柱流速进行测试，待仪器系统稳定后分别测试，考察杂质Z_3x和Z_1c与邻近组分间分离情况、杂质含量及相对保留时间。试验结果见表6～16，见附图1、3～12。

表6色谱条件变化耐用性试验2积分结果

表7色谱条件变化耐用性试验3积分结果

表8色谱条件变化耐用性试验4积分结果

表9色谱条件变化耐用性试验5积分结果

表10色谱条件变化耐用性试验6积分结果

表11色谱条件变化耐用性试验7积分结果

表12色谱条件变化耐用性试验8积分结果

表13色谱条件变化耐用性试验9积分结果

表14色谱条件变化耐用性试验10积分结果

表15色谱条件变化耐用性试验11积分结果

表16色谱条件变化耐用性试验测定结果

结论：当色谱条件有微小波动时，杂质Z_1c和杂质Z_3x与邻近组分间分离度均大于1.5，方法耐用性符合要求。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.分离阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述方法采用的色谱柱是十八烷基键合硅胶为填料，采用流动相A、流动相B和流动相C进行梯度洗脱，将所述阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质进行分离；所述流动相A为缓冲盐溶液，流动相B、流动相C为有机溶液；所述阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质为杂质Z_1c和Z_3x；所述阿伐斯汀中间体Z₃及其基因毒性杂质Z_1c和Z_3x结构式具体如下：

所述流动相A为含有体积百分比浓度为0.2％的三乙胺的0.05mol/L的乙酸铵溶液，使用磷酸将所述流动相A的pH调至3.8～4.2；

所述流动相B为乙腈；所述流动相C为甲醇；

所述梯度洗脱程序为：

。

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.9～1.1ml/min。

3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述色谱柱柱温为28～32℃。

4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述方法进样量为10～30μl。

5.检测阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的方法，其特征在于，利用权利要求1中所述的方法将阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质进行分离，通入检测器进行检测，将供试品色谱图与已知对照品色谱图进行对比，判定阿伐斯汀中间体Z₃中是否含有所述基因毒性杂质；所述检测器波长设定为270±5nm，所述基因毒性杂质为权利要求1所述的基因毒性杂质。

6.测定阿伐斯汀中间体Z₃中基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述方法具体包含以下步骤：

1)溶液配制：

取供试样品溶于稀释剂中，得供试品溶液；取所述基因毒性杂质对照品，用稀释剂溶解稀释得对照品溶液；

2)分离；

利用权利要求1中所述的方法，将阿伐斯汀中间体Z₃中所述基因毒性杂质进行分离；

3)检测；

利用权利要求5中所述的方法，检测阿伐斯汀中间体Z₃中是否存在所述基因毒性杂质；

4)测定；

5)根据检测得到的色谱图，以峰面积考察供试品溶液中阿伐斯汀中间体Z₃中所述基因毒性杂质的含量；所述基因毒性杂质为权利要求1所述的基因毒性杂质。

7.根据权利要求6中所述的方法，其特征在于，所述稀释剂及体积比为甲醇：水：甲酸：800:200:1。