CN113912607A - 一种SNAP-tag探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种SNAP-tag探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及核医学技术领域，特别涉及一种SNAP‑tag探针及其制备方法与应用。该SNAP‑tag探针具有通式I所示结构，制备方法简单，对SNAP具有很好的亲和力，其在体内较为稳定，可以作为直接/间接靶向载体。SNAP靶向探针可以应用于SNAP过表达肿瘤分子成像中，在肿瘤分子成像中具有重要应用价值。将本发明的小分子化合物探针与其它分子成像探针偶联可以对多种肿瘤实现分子成像，可以很好的应用于肿瘤诊断。

Description

一种SNAP-tag探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及核医学技术领域，特别涉及一种SNAP-tag探针及其制备方法与应用。
背景技术
正电子发射断层显像(positron emission tomography，PET)是核医学发展的一项新技术，是无创伤性高品质影像诊断的新技术，PET可以全身一次成像，所以很容易从复杂的或治疗后发生变化的结构中寻找到早期的原发、复发或转移病灶，确定疾病累及的范围，并协助制定治疗方案。PET全身显像往往可以发现亚临床型病灶，从而有助于更准确地分期，避免不必要的手术。因此，PET可以更早期、灵敏、准确、定量、客观地诊断和指导治疗多种疾病，在确定癌症的发生与发展、神经系统的状况，及心血管等方面有广泛的应用。
蛋白质特异性的小分子荧光染料标记技术的发展克服了荧光蛋白在蛋白质等诸多领域应用中的局限性。该类技术通过标准的基因工程手段构建靶蛋白与多肽、蛋白质标签的重组蛋白，利用荧光探针配体与相应多肽、蛋白标签的特异性高效识别，实现对靶蛋白的定点荧光标记。SNAP-tag凭借其较高的特异性、稳定性及配体的多样性获得迅速发展，在细胞成像、蛋白质体内外研究、微生物致病机理、疾病诊断等方面得到广泛的应用。SNAP-tag是通过改造人的O6-鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(human O6-alkylguanine-DNAalkyltransferase，hAGT)获得的一种与O6修饰的苯甲基鸟嘌呤(benzylguanine，BG)荧光底物高特异性共价结合的特异性蛋白质标签。将SNAP-tag与各种亚细胞结构的标志性蛋白质或特异性信号肽融合表达，通过不同荧光底物与SNAP-tag的高效识别，可以实现对亚细胞结构的高特异性标记，并对特定微环境进行动态追踪。目前的SNAP-tag探针通常连接有罗丹明等荧光染料，与SNAP-tag结合后荧光增强倍数只有1-2倍。此外罗丹明等染料的正电性导致此类探针及容易在线粒体聚集，很大程度上增加了荧光成像的背景。并且荧光染料分子需要保持高的光稳定性，以防止强激光的淬灭效应，还需要达到免洗荧光成像，才能够实现实时对活细胞内目标蛋白的监测。因此，荧光强度、荧光成像背景以及荧光的稳定性等都是SNAP-tag面临的难题。另外，关于将SNAP-tag技术应用于PET显像的研究未见报道。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种SNAP-tag探针及其制备方法与应用。该SNAP-tag探针能与SNAP特异性、不可逆、稳定的共价结合，能用于过表达SNAP的组织或肿瘤的PET成像，具有重要的应用价值。
本发明的技术方案如下文所示。
本发明一方面提供了一种SNAP-tag探针，所述SNAP-tag探针的结构如通式I所示：
Figure BDA0003279714300000021
其中，N为双功能螯合剂，L为连接子，m选自1～5中的任意整数。
根据本发明的一些实施方式，所述双功能螯合剂包括p-SCN-Bn-NOTA、p-SCN-Bn-NODA、p-SCN-Bn-DOTA、p-SCN-Bn-DTPA的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述连接子选自聚乙二醇、6-氨基己酸、天冬氨酸、甘氨酸、聚乙烯、鸟嘌呤肽核酸单体GB、含脂肪链的化合物。
根据本发明的一些实施方式，所述聚乙二醇的结构式为(PEG)n，n＝1-20；所述脂肪链的碳原子数为2-10。
根据本发明的一些实施方式，通式I选自以下化合物：
Figure BDA0003279714300000022
Figure BDA0003279714300000031
本发明另一方面还提供了上述SNAP-tag探针的制备方法，包括如下步骤：
Figure BDA0003279714300000032
1)采用固相合成法合成
Figure BDA0003279714300000033
2)
Figure BDA0003279714300000041
与苯甲基鸟嘌呤(BG)缩合反应生成
Figure BDA0003279714300000042
3)
Figure BDA0003279714300000043
进行脱保护反应，得到
Figure BDA0003279714300000044
4)
Figure BDA0003279714300000045
与双功能螯合剂进行缩合反应，得到通式I化合物，即所述的SNAP-tag探针。
根据本发明的一些实施方式，步骤1)中，所述采用固相合成法合成
Figure BDA0003279714300000046
具体为：
Figure BDA0003279714300000047
向CTC树脂中加入
Figure BDA0003279714300000048
DMF(N,N-二甲基甲酰胺)和DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)进行反应，再加入甲醇继续反应，得到第一反应物；
第一反应物进行脱保护处理；再加入Fmoc-L-OH、DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)、HOBt(1-羟基苯并三氮唑)和DMF进行反应，通过TFA(三氟乙酸)切割，得到
Figure BDA0003279714300000051
根据本发明的一些实施方式，步骤2)中，
Figure BDA0003279714300000052
和BG溶于DMF中，加入缩合试剂HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯)和DIPEA，在室温下反应，反应结束后真空浓缩得到
Figure BDA0003279714300000053
根据本发明的一些实施方式，步骤2)中，反应时间为1.5～2.5h。
根据本发明的一些实施方式，步骤3)中，
Figure BDA0003279714300000054
溶于哌啶/DMF溶液中，进行脱保护反应，反应结束后，真空浓缩得到
Figure BDA0003279714300000055
根据本发明的一些实施方式，步骤3)中，所述脱保护反应的反应时间为10～50min。
根据本发明的一些实施方式，步骤4)中，
Figure BDA0003279714300000056
与双功能螯合剂溶于ACN/H2O的混合溶剂中，加入DIPEA反应，得到通式I化合物。
根据本发明的一些实施方式，步骤4)中，所述缩合反应的反应时间为2～3h。
本发明另一方面还提供了一种靶向SNAP的放射性药物，包括，放射性核素标记的上述通式I所示化合物：
Figure BDA0003279714300000061
根据本发明的一些实施方式，所述放射性核素可以选自18F、188Re、186Re、90Y、89Sr、68Ga、111In、183Gd、59Fe、225Ac、212Bi、211At、45Ti、60Cu、61Cu、67Cu、64Cu和62Cu；优选地，所述放射性核素选自18F、68Ga或64Cu。
本发明另一方面还提供了上述靶向SNAP的放射性药物的制备方法，包括如下步骤：
将通式I所示化合物溶于弱酸性缓冲液中，加入放射性核素混合反应，得到放射性核素标记的式I所示化合物。
根据本发明的一些实施方式，包括如下步骤：
将式I所示化合物溶于弱酸性缓冲液中，加入无水乙醇、三氯化铝和放射性核素，80～120℃水浴10～20min，得到放射性核素标记的通式I所示化合物，即所述靶向SNAP的放射性药物。
本发明另一方面还提供了如上所述的SNAP-tag探针或如上所述的靶向SNAP的放射性药物在制备显像剂中的应用。
本发明另一方面还提供了如上所述的SNAP-tag探针或如上所述的靶向SNAP的放射性药物在制备放射免疫显像剂中的用途。
本发明另一方面还提供了如上所述的SNAP-tag探针或如上所述的靶向SNAP的放射性药物在离体实验或生命有机体分子成像中的应用。
在本发明中，“显像剂”是引入体内后能进行脏器、组织或分子显像的放射性药物；放射性药物引入体内后，能浓聚于靶器官或组织中，通过显像仪器对其发射的射线进行探测，从而获得药物在体内的分布图像，用以诊断各种疾病。根据本发明的一些实施方式，所述的SNAP-tag探针或所述的靶向SNAP的放射性药物可以用于过表达SNAP的组织或肿瘤的体内或体外PET成像。
“放射免疫显像剂”，是利用抗原-抗体特异性结合的原理，用放射性核素标记能与体内相应抗原特异性结合的抗体或抗体产品产生的一类放射性药物。在本发明一些实施方式中，所述的SNAP-tag探针或所述的靶向SNAP的放射性药物可用于过表达SNAP的抗原或抗体的体内或体外PET成像。
本发明基于SNAP-tag技术，将其与PET成像结合，研发出一种高稳定性、特异性的探针，与单纯的SNAP-tag技术相比，克服了荧光淬灭、荧光背景强、荧光信号弱以及稳定性差等问题，本发明的SNAP-tag探针能够用于表达SNAP的细胞、组织、器官等的体内和体外的成像，可以实现快速、实时和长时间成像。
本发明的有益效果：
本发明的SNAP靶向探针，对SNAP具有很好的亲和力，其在体内较为稳定，可以作为直接/间接靶向载体。SNAP靶向探针可以应用于SNAP过表达肿瘤分子成像中，在肿瘤分子成像中具有重要应用价值。将本发明的小分子化合物探针与其它分子成像探针偶联可以对多种肿瘤实现分子成像，可以很好的应用于肿瘤诊断。
附图说明：
图1是SNAP基因在HCCLM3-SNAP细胞中稳定表达的流式图；
图2是SNAP基因在HCCLM3-SNAP细胞中稳定表达的共聚焦显微镜图；
图3是实施例3式II化合物的质谱图；
图4是实施例3式II化合物的HPLC谱图；
图5是18F-ALF-NOTA-BG-surface的体外稳定性检测；
图6是18F-ALF-NOTA-BG-surface在HCCLM3-SNAP细胞的摄取；
图7是18F-ALF-NOTA-BG-surface在HCCLM3-SNAP细胞摄取的阻断实验；
图8是18F-ALF-NOTA-BG-surface在HCCLM3-SNAP移植瘤的PET/CT显像。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐释，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例采用的材料：
人肝细胞癌细胞系HCC-LM3细胞购自美国典型培养库(ATCC)。
Balb/c裸鼠购自广东省实验动物中心
SNAP-Alexa Fluor647：品牌ABCAM，货号AB272190；
CTC树脂；
Figure BDA0003279714300000081
(以下为简便表示，记为Fmoc-C6-OH)；
p-SCN-Bn-NOTA；
苯甲基鸟嘌呤(BG)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)
实施例1构建HCCLM3-SNAP稳定表达细胞系
SNAP慢病毒构建HCCLM3-SNAP稳定表达细胞系，流式细胞学术检测SNAP在HCCLM3-SNAP细胞中的表达；
具体实验步骤如下：
将5×105个HCCLM3-SNAP和HCCLM3-Vetor细胞分别加入含10％胎牛血清的200μLDMEM培养基中；
细胞加入0.25mM流式抗体SNAP-Alexa Fluor647(ABCAM，AB272190)，37℃孵育1小时后，用PBS洗涤3次，500μL生理盐水分别重悬HCCLM3-SNAP和HCCLM3-Vetor细胞；
应用流式细胞仪(BD FacsCalibur)检测细胞表面SNAP的表达，并使用FlowJo软件(Treestar)进行分析。所有检测至少重复3次。
如图1所示，红色为SNAP过表达细胞，蓝色为对照组细胞，在细胞数大致相同时，SNAP过表达细胞表面的相对荧光强度明显高于对照组细胞，说明SNAP基因与其特异性荧光底物结合的更多，侧面证明了SNAP基因在HCCLM3-SNAP细胞中稳定表达。
实施例2 SNAP在HCCLM3-SNAP细胞中的表达
免疫荧光检测SNAP在HCCLM3-SNAP细胞中的表达；
具体实验步骤如下：
将约2×104个HCCLM3-SNAP和HCCLM3-Vector细胞分别接种于含10％胎牛血清的200μL DMEM培养基的盖玻片上。
37℃下，细胞与0.25mM SNAP-Surface Alexa Fluor647共孵育4小时，细胞生长至对数生长期后，用PBS洗涤3次。
4％多聚甲醛固定20分钟，清洗3次。
样品用1μg/mL DAPI避光孵育5分钟，洗涤3次。
荧光图像由共聚焦显微镜共聚焦激光扫描系统(奥林巴斯FV1000，日本)以60倍和120倍倍率可视化和捕获，并使用FluoView应用软件FV10-ASW 3.0进行分析。
如图2所示，DAPI，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于细胞核的染色，呈现蓝色荧光；SNAP-Alexa Fluor647是SNAP的特异性荧光底物，可以与细胞膜表面的SNAP实现特异性结合，呈红色荧光。从图中可以看出SNAP过表达细胞膜有明显的红色荧光，而其对照组细胞膜上未见明显荧光，说明SNAP-Alexa Fluor647与SNAP过表达细胞实现了特异性结合。也从侧面验证了SNAP基因在HCCLM3-SNAP细胞中稳定表达。
实施例3式II化合物的合成
式II化合物(BG-PEG4-p-SCN-Bn-NOTA)的合成，其合成方法步骤如下：
1)Fmoc-PEG4-C6-OH采用固相合成方法进行合成：
把适量的CTC树脂加入反应其中，加入Fmoc-C6-OH和DMF，然后缓慢加入DIPEA进行反应，再加入甲醇，反应半小时，过滤，得到第一反应物；
用DMF洗涤第一反应物三次，加入20％哌啶/DMF溶液进行脱保护30分钟，过滤，然后用DMF洗涤六次，加入Fmoc-PEG4-OH、DIC、HOBt和的DMF进行反应；
用茚三酮检测是否反应完全，当TLC(薄层色谱)板上原料点消失，则判定反应完全，如果反应完全过滤，树脂用DMF洗涤三次，甲醇洗涤后抽干，树脂用TFA切割得到Fmoc-PEG4-C6-OH。
2)Fmoc-PEG4-C6-OH与BG缩合反应生成Fmoc-PEG4-C6-BG
Fmoc-PEG4-C6-OH和BG溶于DMF中，加入缩合试剂HATU和DIPEA，在室温下反应2小时，反应结束后高真空浓缩得到Fmoc-PEG4-C6-BG；
3)Fmoc-PEG4-C6-BG溶于20％哌啶/DMF溶液中，搅拌反应半小时。真空浓缩得到H2N-PEG4-C6-BG粗品，并经过HPLC纯化；
4)H2N-PEG4-C6-BG与p-SCN-Bn-NOTA进行缩合反应即得式II化合物：
纯化后的H2N-PEG4-C6-BG与p-SCN-Bn-NOTA溶于ACN/H2O的混合溶剂中；加入DIPEA反应2.5小时得到BG-C6-PEG4-p-SCN-Bn-NOTA粗品，经过HPLC纯化冻干后得到BG-C6-PEG4-p-SCN-Bn-NOTA(式II化合物
Figure BDA0003279714300000101
)成品，成品纯度约97.6％。
式II化合物的质谱图和如图3所示，MW为1081.2。
对制得的产物式II化合物进行HPLC分析(流动相为：流动相A为
含0.1％TFA的H2O，流动相B为含0.09％TFA的80％ACN与20％H2O；流速为1.0mL/min；梯度洗脱，0～20min时28.0％～38.0％流动相B；柱：SepaxGP-C18 5u 120A 4.6*150mmA1230#)，结果如图4所示。
实施例4放射性核素标记的式II化合物
BG-Surface-PEG4-p-SCN-Bn-NOTA的18F标记方法，其标记方法步骤如下：
在50μg的BG-PEG4-p-SCN-Bn-NOTA中加入60μL醋酸钠(1mM，pH＝4)、180μL无水乙醇、10μL三氯化铝(1mM)和74MBq氟离子(约2mCi)中溶解，在100℃下煮沸15分钟，冷却至室温；
过C18色谱柱(美国Sep-Pak，Waters)，去除游离的氟离子；
生理盐水洗涤C18柱后，用400μL 70％乙醇洗脱，然后置于真空干燥箱中，直至液体消失；
溶于生理盐水中，标记后产物为18F-ALF-NOTA-BG-surface。
实施例5 18F-ALF-NOTA-BG-surface的稳定性
18F-ALF-NOTA-BG-surface的放射性标记及其稳定性研究；
其方法步骤如下：
将18F-ALF-NOTA-BG-surface(100μCi/150μL生理盐水)尾静脉注射到小鼠体内，循环30分钟、1小时和2小时后分别采血，3000g离心10分钟获得小鼠血浆，用高效液相色谱对血浆进行分析。
实验结果如图5所示，为18F-ALF-NOTA-BG-surface的体外稳定性检测，其中(a)、(b)和(c)图分别为30min、1h和2h的小鼠血浆中的18F-ALF-NOTA-BG-surface，可以看出，18F-ALF-NOTA-BG-surface在小鼠体内2小时后仍保持原有的分子量，具有很高稳定性。
实施例6 18F-ALF-NOTA-BG-surface与HCCLM3-SNAP细胞结合能力
γ计数仪检测18F-ALF-NOTA-BG-surface与HCCLM3-SNAP细胞的体外结合能力；
其方法步骤如下：
1)分别将1×106个HCCLM3-SNAP和HCCLM3-Vector细胞，加入200μL培养基。
2)向培养基中加入约370kBq的18F-ALF-NOTA-BG-surface后，37℃孵育1小时，然后用1mL冷PBS清洗3次。
3)用500μL生理盐水悬浮细胞，γ计数器检测两种细胞与18F-ALF-NOTA-BG-surface的结合效率。
结果如图6所示，是18F-ALF-NOTA-BG-surface在HCCLM3-SNAP细胞的摄取；实验表明18F-ALF-NOTA-BG-surface与HCCLM3-SNAP细胞的结合能力明显高于对照组HCCLM3-Vector，初步验证了18F-ALF-NOTA-BG-surface与HCCLM3-SNAP细胞的体外特异性结合能力。
BG-Surface-PEG4-p-SCN-Bn-NOTA对18F-ALF-NOTA-BG-surface与HCCLM3-SNAP结合的竞争性阻断实验；
其方法步骤如下：
1)将1×106个HCCLM3-SNAP，加入200μL培养基。
2)实验组(18F-BG+15μg BG-Surface)：向培养基中加入约370kBq的18F-ALF-NOTA-BG-surface和15μg BG-Surface-PEG4-p-SCN-Bn-NOTA后，37℃孵育1小时，然后用1mL冷PBS清洗3次；
对照组(18F-BG-surface)：向培养基中加入约370kBq的18F-ALF-NOTA-BG-surface后，37℃孵育1小时，然后用1mL冷PBS清洗3次；
3)用500μL生理盐水悬浮细胞，γ计数器检测两种细胞与18F-ALF-NOTA-BG-surface的结合效率。
结果如图7所示，18F-ALF-NOTA-BG-surface在HCCLM3-SNAP细胞摄取的阻断实验，可以看出，大剂量BG-Surface-PEG4-p-SCN-Bn-NOTA能有效地竞争性阻断18F-ALF-NOTA-BG-surface与HCCLM3-SNAP细胞的结合。
实施例7 18F-ALF-NOTA-BG-surface与SNAP体内结合能力
PET/CT检测18F-ALF-NOTA-BG-surface与SNAP体内结合力；
其方法步骤如下：
1)分别消化HCCLM3-SNAP及HCCLM3-Vector细胞后，将1×106两种细胞分别注射至裸鼠右侧肩部皮下、裸鼠左侧肩部皮下；
2)18F标记BG-PEG4-p-SCN-Bn-NOTA，并将已经烘干的18F-ALF-NOTA-BG-surface溶于150uL生理盐水中(约100μCi)；经尾静脉注射至上述裸鼠体内；
3)注射1小时后，进行PET/CT显像
实验结果如图8所示，是18F-ALF-NOTA-BG-surface与SNAP过表达细胞的体内结合研究。应用小动物PET/CT显像进行验证，从图像中可以看出，18F-ALF-NOTA-BG-surface在注射1小时后，在HCCLM3-SNAP细胞处富集，而对照组HCCLM3-Vector并没有富集。说明18F-ALF-NOTA-BG-surface在小鼠体内对HCCLM3-SNAP细胞能够实现特异性结合，具有良好的靶向性。
上述结果表明，本发明的小分子化合物BG-PEG4-p-SCN-Bn-NOTA，对SNAP具有很好的亲和力，其在体内较为稳定，可以作为靶向载体，SNAP靶向小分子化合物可以应用于SNAP过表达肿瘤的分子成像中，在肿瘤分子成像中具有重要价值。将本发明的小分子化合物与分子成像探针偶联，可以很好的应用于肿瘤诊断。
尽管已参照具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变化，所附权利要求书目的在于被解释为包括所有这样的实施方式和等价的变化。此外，本文引用的所有参考文献的内容据此引入本文以供参考。

Claims (15)

1.一种SNAP-tag探针，其特征在于，所述SNAP-tag探针的结构如通式I所示：
Figure FDA0003279714290000011
其中，N为双功能螯合剂，L为连接子，m选自1～5中的任意整数。
2.根据权利要求1所述的SNAP-tag探针，其特征在于，所述双功能螯合剂包括p-SCN-Bn-NOTA、p-SCN-Bn-NODA、p-SCN-Bn-DOTA或p-SCN-Bn-DTPA的至少一种。
3.根据权利要求1所述的SNAP-tag探针，其特征在于，所述连接子选自聚乙二醇、6-氨基己酸、天冬氨酸、甘氨酸、聚乙烯、鸟嘌呤肽核酸单体GB或含脂肪链的化合物。
4.根据权利要求3所述的SNAP-tag探针，其特征在于，所述聚乙二醇的结构式为(PEG)n，n＝1-20；所述脂肪链的碳原子数为2-10。
5.根据权利要求1所述的SNAP-tag探针，其特征在于，所述通式I选自以下化合物：
Figure FDA0003279714290000012
Figure FDA0003279714290000021
6.权利要求1～5任一项所述的SNAP-tag探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)采用固相合成法合成
Figure FDA0003279714290000022
2)
Figure FDA0003279714290000023
与苯甲基鸟嘌呤缩合反应生成
Figure FDA0003279714290000024
3)
Figure FDA0003279714290000025
进行脱保护反应，得到
Figure FDA0003279714290000026
4)
Figure FDA0003279714290000031
与双功能螯合剂进行缩合反应，得到通式I化合物，即所述的SNAP-tag探针。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)具体为：向CTC树脂中加入
Figure FDA0003279714290000032
DMF和DIPEA进行反应，再加入甲醇继续反应，得到第一反应物；第一反应物进行脱保护处理；再加入Fmoc-L-OH、DIC、HOBt和DMF进行反应，通过TFA切割，得到
Figure FDA0003279714290000033
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，
Figure FDA0003279714290000034
和苯甲基鸟嘌呤溶于DMF中，加入缩合试剂HATU和DIPEA，在室温下反应，得到
Figure FDA0003279714290000035
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，
Figure FDA0003279714290000036
溶于哌啶/DMF溶液中，搅拌反应，真空浓缩得到
Figure FDA0003279714290000037
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，
Figure FDA0003279714290000038
与双功能螯合剂溶于ACN/H2O的混合溶剂中，加入DIPEA反应，得到通式I化合物。
11.一种靶向SNAP的放射性药物，其特征在于，包括，放射性核素标记的权利要求1～5任一项所述的通式I所示化合物，
Figure FDA0003279714290000041
12.根据权利要求11所述的靶向SNAP的放射性药物，其特征在于，所述放射性核素可以选自18F、188Re、186Re、90Y、89Sr、68Ga、111In、183Gd、59Fe、225Ac、212Bi、211At、45Ti、60Cu、61Cu、67Cu、64Cu和62Cu；优选地，所述放射性核素选自18F、68Ga或64Cu。
13.如权利要求11所述的靶向SNAP的放射性药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将通式I化合物溶于弱酸性缓冲液中，加入放射性核素混合反应，得到放射性核素标记的通式I化合物，即所述靶向SNAP的放射性药物。
14.如权利要求1～5任一项所述的SNAP-tag探针或如权利要求11～12任一项所述的靶向SNAP的放射性药物在制备显像剂、放射免疫显像剂中的应用。
15.如权利要求1～5任一项所述的SNAP-tag探针或如权利要求11～12任一项所述的靶向SNAP的放射性药物在离体实验或生命有机体分子成像中的应用。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117736135B (zh) * 2024-02-19 2024-05-07 西北农林科技大学深圳研究院 一种蛋白质位点特异性修饰的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111333624A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 中国科学院大连化学物理研究所 一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针及其制备方法和应用
CN111333618A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 中国科学院大连化学物理研究所 一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针及其制备方法
CN111333646A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 中国科学院大连化学物理研究所 一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针及其制备方法及应用
CN111358965A (zh) * 2020-01-22 2020-07-03 哈尔滨医科大学 68Ga标记NOTA修饰的EGFR分子成像探针及制备与应用
CN112194651A (zh) * 2020-10-12 2021-01-08 南方医科大学南方医院 一种pet示踪剂的前体化合物及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2978149B1 (fr) * 2011-07-18 2014-01-10 Cisbio Bioassays Nouveaux agents complexants et complexes de lanthanide correspondant, et leur utilisation comme marqueurs luminescents
WO2019122269A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-27 Spirochrome Ag Novel tunable photoactivatable silicon rhodamine fluorophores
CN108314678B (zh) * 2018-01-17 2019-11-08 浙江大学 以磷脂酰丝氨酸为靶点的分子探针及其用途
CN111333649B (zh) * 2018-12-18 2022-06-03 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于SNAP-tag技术的细胞膜荧光探针及其制备和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111333624A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 中国科学院大连化学物理研究所 一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针及其制备方法和应用
CN111333618A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 中国科学院大连化学物理研究所 一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针及其制备方法
CN111333646A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 中国科学院大连化学物理研究所 一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针及其制备方法及应用
CN111358965A (zh) * 2020-01-22 2020-07-03 哈尔滨医科大学 68Ga标记NOTA修饰的EGFR分子成像探针及制备与应用
CN112194651A (zh) * 2020-10-12 2021-01-08 南方医科大学南方医院 一种pet示踪剂的前体化合物及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SOPHIE STOTZ: "《Covalent 18F-Radiotracers for SNAPTag: A New Toolbox for Reporter Gene Imaging》", 《PHARMACEUTICALS》 *

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