CN113891720A - 益生菌组合物和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选自乳杆菌属(Lactobacillus)的至少一种益生菌菌株，所述至少一种益生菌菌株用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎。具体地，本发明涉及选自乳杆菌属的至少一种益生菌菌株，所述至少一种益生菌菌株用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎，其中对骨关节炎的所述治疗和/或预防是通过治疗和/或预防软骨损伤、关节处的骨损伤和与骨关节炎相关的炎症中的一种或多种来进行的。

Description

益生菌组合物和其用途
技术领域
本发明涉及选自乳杆菌属(Lactobacillus)的至少一种益生菌菌株，所述至少一种益生菌菌株用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎。具体地，本发明涉及选自乳杆菌属的至少一种益生菌菌株，所述至少一种益生菌菌株用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎，其中对骨关节炎的所述治疗和/或预防是通过治疗和/或预防软骨损伤、关节处的骨损伤和与骨关节炎相关的炎症中的一种或多种来进行的。
背景技术
骨关节炎(OA)是一种可能由关节软骨和下层骨的分解引起的关节疾病。与其它类型的关节炎不同，在OA中，通常仅关节受到影响。覆盖关节中的骨末端的软骨受损允许骨一起摩擦，从而引起关节的疼痛、肿胀和运动减少。随着时间的推移，关节也可能失去其正常形状。
OA最常见的症状是关节疼痛和僵硬。最初，症状可能仅在锻炼后出现，但随着时间的推移，症状可能会变得恒定。其它症状可以包含关节肿胀、运动范围减小，以及当背部受到影响时，手臂和腿部无力或麻木。最常涉及的关节是靠近手指末端、拇指根部、颈部、下背部、膝盖和臀部的关节。身体一侧上的关节通常比另一侧的关节受到的影响更大。通常症状会持续数年。所述症状会影响工作和正常的日常活动。
根据全球疾病负担研究2015(GBD 2015，疾病和损伤发病率和患病率合作者(Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators),2016,《柳叶刀(Lancet)》,388(10053):1545-1602)，骨关节炎是最常见的关节炎形式，影响约2.37亿人(占世界人口的3.3％)。在60岁以上的人中，约10％的男性和18％的女性受到影响。OA是导致约2％的残疾寿命的原因，并且随着人们年龄的增长在两性中变得更加普遍。年轻人有时会在关节损伤后发展为OA。
造成OA的原因包含既往关节损伤、关节或肢体发育异常以及遗传因素。超重、腿长不一或从事导致高水平的关节压力的工作的人的风险更大。OA被认为是由关节上的机械应力和低度炎性过程引起的。随着软骨的损失，下层骨也会受到影响。由于疼痛可能使得难以锻炼，因此也可能发生肌肉损失。诊断通常基于体征和症状，其中偶尔使用医学成像和其它测试来支持或排除其它问题。与主要是炎性病状的类风湿性关节炎相反，在骨关节炎中，关节不会变热或变红。
虽然骨关节炎是可能导致总体软骨损失并且对其它关节组织造成形态学损伤的退行性关节疾病，但在骨关节炎进展的最早阶段会发生更微妙的生化变化。健康软骨的含水量通过将水排出的压缩力和将水吸入的流体静压和渗透压进行精细平衡。胶原纤维施加压缩力，而Gibbs-Donnan效应和软骨蛋白聚糖产生渗透压，所述渗透压倾向于将水吸入。
然而，在骨关节炎发作期间，胶原基质变得更加混乱，并且软骨内的蛋白聚糖含量减少。胶原纤维的分解导致含水量的净增加。出现这种增加是因为尽管存在蛋白聚糖的整体损失(并且因此渗透拉力降低)，但胶原蛋白的损失超过了所述整体损失。在没有蛋白聚糖的保护作用的情况下，软骨的胶原纤维可能变得易于降解并且因此加剧退化。滑膜(关节腔内衬)和周围关节囊的炎症也可能发生，尽管与类风湿性关节炎中发生的滑膜炎症相比，这通常是轻度的。在来自软骨的分解产物被释放到滑膜空间中并且关节内衬的细胞试图将所述分解产物去除时，可能会发生炎症。
在OA中，关节内的其它结构也可能会受到影响。关节内的韧带变厚和纤维化，并且半月板可能受损和磨损。在人进行关节置换时，半月板可能完全不存在。被称为“骨刺”或骨赘的新骨生长物可以在关节边缘上形成，可能是为了试图在不存在半月板的情况下改善关节软骨表面的一致性。软骨下骨体积增加，并且矿化程度降低(矿化不足)。所有这些变化均可能引起正常运行出现问题。骨关节炎关节的疼痛与增厚的滑膜和软骨下骨病变有关。
目前的治疗包含锻炼、努力减小关节压力、支持性团体(support group)和止痛药。努力减小关节压力包含休息和使用手杖。减肥可能对超重的人有所帮助。止痛药可以包含扑热息痛(对乙酰氨基酚)以及NSAID，如萘普生或布洛芬。由于缺乏关于益处以及成瘾风险和其它副作用的信息，通常不鼓励长期使用阿片类药物。如果尽管进行了其它治疗，但疼痛仍会干扰正常生活，则关节置换手术可能会有所帮助。人工关节通常持续10到15年。
因此，在本领域内仍然需要找到针对哺乳动物，并且特别是人的骨关节炎的有效预防和治疗方法。
本发明寻求解决骨关节炎的问题。
如所附实验实例所示，通过预防和/或减少软骨损伤、关节处的骨损伤和与骨关节炎相关的炎症，施用根据本发明的益生菌对哺乳动物的骨关节炎具有令人惊讶的积极效果。
发明内容
本发明的第一方面提供了乳杆菌属的至少一种益生菌菌株，所述至少一种益生菌菌株用于治疗和/或预防哺乳动物，优选地人的骨关节炎。
“在治疗和/或预防中的用途”包含在受试者中产生以下效果的用途的含义：预防、延迟、保护以免受与骨关节炎相关的一种或多种症状和/或其它标志物、降低其严重程度和/或将其消除。
优选地，对骨关节炎的治疗和/或预防是通过减少和/或预防软骨损伤、关节处的骨损伤和与骨关节炎相关的炎症中的一种或多种来进行的。
优选地，根据本发明的第一方面的用途是通过减少和/或预防软骨损伤来进行的。
优选地，根据本发明的第一方面的用途是通过治疗和/或预防关节处的骨损伤来进行的。
优选地，根据本发明的第一方面的用途是通过治疗和/或预防与骨关节炎相关的炎症，优选地通过治疗和/或预防局限于关节的炎症进行的。
“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包含被治疗的事件或病状得到改善、严重程度降低、消除、不再发生、防止进一步发生、延迟和/或停止的含义。这种治疗通常在事件(或相同类型的事件)发生或病情明显后进行。还应当理解，此类术语可以包含这样的含义，即事件或条件保持在当前状态而不会变得更糟或进一步发展。
“预防(prevent)”、“预防(prevention)”或“预防(preventing)”包含被预防的事件或条件被防止、延迟、减轻(例如，严重程度降低)、阻止发生或停止的含义。这种预防通常发生在事件发生或病情显现之前，但是应当理解，这也意味着防止进一步发生相同类型的事件。还应当理解，此类术语可以包含这样的含义，即事件或条件保持在当前状态而不会变得更糟或进一步发展。
例如，与未施用至少一种益生菌菌株相比或与施用缺乏至少一种益生菌菌株的对应组合物相比，在施用根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株(或包括至少一种益生菌菌株的组合物)后骨关节炎的量度(例如，骨关节炎评分，如根据Glasson等人,2010,《骨关节炎和软骨(Osteoarthritis Cartilage)》,18增刊3:S17-23，所述文献的全部内容通过引用并入本文)可以减少至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％。在哺乳动物中，应当测量一个关节的一个区域的最小值。例如，优选在膝关节处，如在胫骨或股骨处的软骨中测量骨关节炎评分。膝关节处的骨关节炎评分可以在膝关节外侧或内侧处的软骨中进行测量。如本文中使内侧半月板去稳定的实例所示，膝关节处的骨关节炎评分可以特别地在股骨处，特别是在内侧股骨处的软骨中进行测量。还优选在关节内的皮质骨，如膝的软骨下骨板的接触点(板)处和/或在关节处的骨骺小梁骨(包含软骨下骨)，如膝关节处的胫骨或股骨的骨骺小梁骨中进行骨测量。
“软骨损伤”包含关节处软骨的任何瑕疵、缺损、破裂、损伤或撕裂的含义，特别是在此类损伤可能导致骨关节炎或以其它方式与骨关节炎相关的情况下。
软骨是有弹性且光滑的弹性组织，是覆盖并保护关节处长骨末端的橡胶状填充物，并且是胸腔、耳朵、鼻子、支气管、椎间盘和许多其它身体组件的结构组件。所述软骨不像骨那样硬和刚硬，但其比肌肉坚硬得多并且柔性小得多。软骨基质由糖胺聚糖、蛋白聚糖、胶原纤维和有时弹性蛋白组成。
软骨由称为软骨细胞的特化细胞构成，所述软骨细胞可以产生大量胶原胞外基质，这是富含蛋白聚糖和弹性蛋白纤维的丰富基质。
软骨分类为三种类型：弹性软骨、透明软骨和纤维软骨，所述三种软骨的胶原蛋白和蛋白聚糖的相对含量不同。
弹性软骨存在于外耳、咽鼓管和会厌中，并且含有弹性纤维网络、II型胶原纤维和作为主要蛋白质的弹性蛋白。
纤维软骨由各种比例的白色纤维组织和软骨组织的混合物组成，并且是唯一一种除了正常II型胶原蛋白之外还含有I型胶原蛋白的软骨。纤维软骨存在于与骨连接的软组织、耻骨联合、椎间盘纤维环、半月板、手腕的三角形纤维软骨盘和将颌骨连接到颅骨的颞下颌关节中。纤维软骨有时还可以在透明软骨一直撕裂到骨头的地方形成瘢痕，但是不是通常覆盖关节表面的光滑玻璃状关节软骨的理想替代物(“关节”意指身体关节、身体关节处或与身体关节相关)。虽然纤维软骨能够填充关节软骨缺损，但其结构与透明软骨的结构显著不同；其密度更加致密，并且其无法像透明软骨一样承受日常活动的需求。因此，与透明软骨相比，纤维软骨的分解风险更高。
透明软骨是最普遍的软骨类型，并且存在于许多关节表面(其中其被称为关节软骨)以及肋骨、鼻子、喉部和气管中。透明软骨主要由II型胶原蛋白和硫酸软骨素组成。虽然经常发现关节软骨与半月板和关节盘紧密接触，但关节软骨不被认为是完全由纤维软骨组成的这些结构中的任一种的一部分。因此，关节软骨的生化分解通常导致骨关节炎。
透明软骨的外部被称为软骨膜的纤维膜覆盖，或当透明软骨沿着关节表面时被滑膜覆盖。这种膜含有通过扩散为软骨提供营养的血管。软骨本身不含有血管(其是无血管的)或神经(其是无神经的)。关节软骨的压缩或弹性软骨的屈曲会产生流体流动，这有助于营养物扩散到软骨细胞中。与其它结缔组织相比，软骨的胞外基质周转非常缓慢并且无法修复。
膝的关节软骨损伤可能会单独发现，但更常见的是与韧带和半月板损伤结合地发现。由于关节力学的改变，先前接受过外科手术干预的人面临更多关节软骨损伤的机会。关节软骨损伤也可能出现在肩部，引起疼痛、不适和活动受限。关节软骨通常不会在损伤或疾病后再生(通过形成同一类型的组织进行修复的过程)，从而导致组织损失和如骨关节炎等缺损的形成。
软骨损伤可以通过本领域已知的任何合适的方法来确定。例如，软骨损伤可以通过MRI扫描或通过关节镜检查来确定。损伤可以通过分级系统，如国际软骨修复协会(International Cartilage Repair Society)建立的关节镜分级系统来评估：
0级：(正常)健康软骨；
1级：软骨具有软点、水泡或表面磨损；
2级：小于软骨层厚度二分之一的轻微撕裂；
3级：病变具有超过软骨层厚度二分之一的深裂隙；
4级：软骨撕裂是全厚的并且暴露下层(软骨下)骨。
可替代地，可以使用在Glasson等人(2010,《骨关节炎和软骨》,18增刊3:S17-23)中详述的由国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)推荐的评分系统来评估损伤，特别是当评估小鼠的损伤时。
在优选实施例中，评估膝关节处，如胫骨和/或股骨处的软骨损伤。可以评估膝关节的外侧或内侧的软骨损伤。例如，可以评估内侧胫骨、外侧胫骨、内侧股骨和/或外侧股骨处的软骨损伤。优选地，如在临床环境中，评估这些部位中的所有四个部位处的软骨损伤。然而，应当理解，可能仅需要评估这些部位中的一个、两个或三个部位处的软骨损伤。如本文中使内侧半月板去稳定的实例所示，可以评估膝关节的内侧处，特别是内侧股骨处的软骨损伤。
“关节处的骨损伤”包含关节区域中的骨骼的任何瑕疵、缺损、破裂、损伤或病变，特别是在此类损伤可能导致骨关节炎或以其它方式与骨关节炎相关的情况下。还包含在骨关节炎期间可能发生的骨体积和矿化不足的任何疾病相关的增加。例如，小梁骨骺骨和皮质软骨下骨板(接触点)的增厚是骨关节炎中可能观察到的典型结构变化。
骨组织是两种类型的矿化组织，即皮质(也称为致密)骨和小梁(也称为松质或海绵状)骨。
皮质骨比小梁骨更密集、更坚固，并形成骨骼的硬外部(皮层)。从微观上讲，人的皮质骨由骨质构成，这些骨质圆柱由钙化基质的同心环(称为薄片)形成，其围绕着含有血管、神经和淋巴管的中央(哈弗斯(Haversian))管。皮质骨通常具有骨膜结缔组织的外表面和骨内膜结缔组织的内表面，其形成皮质骨与小梁骨之间的边界。
小梁骨是骨骼的内部组织，并且是包括微小格状单元(小梁)的开孔多孔网络。小梁骨比皮质骨具有更高的表面积/体积比，因为其密度较小，使其更软、更弱，但更具柔性。较大的表面积也使其适于代谢活动，如钙离子的交换。小梁骨通常位于长骨的末端、关节附近以及椎骨内部。在显微镜下，小梁骨的主要解剖和功能单元是小梁。与骨单位的同心圆不同，小梁通常形成覆盖在骨内膜中的成骨细胞的细杆状形成物的不规则网络，并且之间的空间填充有骨髓和造血干细胞。小梁骨约占总骨量的20％，但表面积却比皮质骨近十倍。
骨中发现的其它类型的组织包含骨髓、骨干、骨膜、神经、血管和软骨。
人体(哺乳动物)的骨有五种类型，以其形状为特征：长、短、扁平、不规则和籽骨样。“长骨”，例如股骨和四肢、手指和脚趾的大多数其它骨骼，通常具有主要由皮质骨形成的轴(骨干)，形成了填充有较少量骨髓的腔，而在骨头的每一端头部呈圆形(骨骺)。骨骺通常包括被皮质骨层包围的小梁骨。“短骨”，例如手腕和脚踝的骨骼，大致呈立方体形，通常包括围绕小梁骨内部的皮质骨薄层。“扁平骨”，例如胸骨、肋骨、臀部和大多数头骨，是薄的并且通常是弯曲的，其中两个平行的皮质骨层夹着一层小梁骨。“不规则的骨骼”，例如椎骨、骶骨、尾骨、颞骨、蝶骨、筛骨、颧骨、上颌骨、下颌骨、腭骨、下鼻甲和舌骨，具有不规则的形状，通常包括围绕小梁骨内部的紧凑的薄骨层骨。籽骨，例如膝盖骨和豌豆骨，是包埋在肌腱中的骨骼。
皮质骨和小梁骨两者的骨组织(骨组织)通常包括相对较少数量的细胞，这些细胞被困在胶原蛋白(骨胶原)纤维的坚韧基质中，无机盐晶体(例如，羟磷灰石钙/羟磷灰石)粘附在基质上以增强骨骼。基质的其余部分通常填充有研磨物质—一种胞外空间中的无定形凝胶状物质，含有胞外基质的所有成分，包含水、糖胺聚糖(GAG；例如，乙酰透明质酸)、与GAG结合的蛋白聚糖(例如，硫酸肝素和硫酸角蛋白)、糖蛋白(例如，骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液蛋白)、骨钙蛋白和连接蛋白(例如，纽蛋白、血影蛋白和肌动蛋白)。骨骼是由包裹细胞周围的基质硬化而形成的，所述包裹细胞通常从成骨细胞变为无活性骨细胞。
骨骼通过形成骨的成骨细胞(OB)和吸收骨的破骨细胞(OCL)进行重塑。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)增加了OCL前体细胞的增殖和存活，并上调了OCL中核因子-κB(RANK)受体激活剂的表达。这允许RANK配体(RANKL)结合并启动引起OCL形成的信号级联反应。骨保护素(OPG)可以抑制RANKL的作用，而骨保护素是RANKL的诱饵受体。
炎症与骨质流失之间的联系已得到很好的确立，在自身免疫性疾病中，破骨细胞的骨吸收是由活化T细胞产生的炎性细胞因子驱动的。另外，一些研究表明，以高敏感性C反应蛋白(hsCRP)适度升高的血清水平表明低度全身性炎症与低BMD、骨吸收增加和骨折风险增加相关。绝经后发生的雌激素缺乏症会导致破骨细胞的形成增加和存活时间延长。认为这是由于许多因素引起的，包含雌激素的免疫抑制作用丧失，导致破骨细胞生成的细胞因子产生增加以及雌激素对OCL的直接作用。与这些数据一致，炎性细胞因子TNFα和IL-1的阻断导致绝经后早期女性的骨吸收标志物降低。
骨损伤可以通过本领域已知的任何合适的量度来确定。例如，骨损伤可以通过测量骨损失来确定，如骨矿物质含量或骨矿物质密度的变化。优选地，评估关节处的骨损伤，例如在膝关节的骨骺骨(其包含软骨下骨)中，特别是胫骨骨骺小梁骨(胫骨的近端骨骺处的小梁骨)和股骨骨骺小梁骨(股骨的远端骨骺处的小梁骨，如股骨髁中的一个或两个的一部分)中的一个或两个，软骨下内侧胫骨和股骨骨板中的一个或两个和/或软骨下外侧胫骨和股骨骨板中的一个或两个(所有四个都是皮质骨)。
胫骨的上部被称为胫骨近端或胫骨近端骨骺。根据McKinnis(2014,《肌肉骨骼影像基础(Fundamentals of Musculoskeletal Imaging)》,第4版,F.A.戴维斯公司(F.A.Davis Company),费城；特别是图13-1,可于2019年4月16日访问https://fadavispt.mhmedical.com/content.aspx？bookid＝1899&sectionid＝141191793)，胫骨近端由内侧和外侧髁组成，其在上方形成胫骨或胫骨平台的关节面。类似地，股骨的下部称为股骨远端或股骨远端骨骺。根据McKinnis(2014，见上文)，股骨远端表现出内侧和外侧髁(参见McKinnis的图13-1，见上文)。
“软骨下”包含关节中软骨下方的骨层的含义。因此，在膝关节中，胫骨近端的软骨下骨恰好在膝关节软骨的下方(远端)，并且股骨远端的软骨下骨恰好在膝关节软骨的“下方”(近端)。软骨下骨由皮质部分(软骨下骨板)和小梁部分(软骨下小梁骨)组成，例如，参见Arijmand等人(2019,《科学报告(Sci Rep)》8(1):11478)的图1。
“骨骺”包含包括骨骺的骨区域的含义，包含软骨下骨。因此，对于膝关节的骨骼，例如胫骨，“骨骺骨”包含在上文的Arijmand等人的图1中被称为软骨下和骨骺的区域。
“骨矿物质含量”(BMC)包含骨组织中骨矿物质(例如，钙)含量的含义。BMC的度量通常包含g和g/cm。优选地，BMC以克(g)测量。
“骨矿物质密度”(BMD)包含骨组织中骨矿物质(例如，钙)含量的含义，以密度表示。BMD的度量通常包含每单位骨体积的矿物质质量(例如，立方厘米)，或者当通过临床成像(密度法)评估时，每单位骨表面的光密度(例如，平方厘米)。例如，BMD可以以g/cm2或g/cm3表示。因此，BMD可以通过将以g为单位的BMC除以骨骼的表面积来计算，或者可以通过将以g/cm为单位的BMC除以扫描线处的骨骼的宽度来计算。BMD通常是骨强度的量度，并且骨矿物质密度降低可以增加骨折的几率。
骨矿物质含量和骨矿物质密度可以通过本领域已知的任何方法来测量。例如，BMC和BMD可以通过以下方法进行测量：双能X射线吸收法(DXA或DEXA)、双X射线吸收法和激光(DXL)、定量计算断层摄影术(QCT)、定量超声(QUS)、单光子吸收法(SPA)、双光子吸收法(DPA)、数字X射线放射线测定法(DXR)或单能X射线吸收法(SEXA)。DXA是使用最广泛的技术，但是QCT(或小型动物的X射线微计算断层摄影术[微CT])是优选的，因为其能够测量骨骼的体积。
“与骨关节炎相关的炎症”包含由骨关节炎的病状引起的任何炎症的含义。因此，通常，与骨关节炎相关的炎症局限于关节。“局限于关节的炎症”包含滑膜(关节腔内衬)和周围关节囊的炎症的含义。这种炎症可能是由于软骨分解产物释放到滑膜空间中并且试图通过关节内衬的细胞去除这些分解产物而引起的。具体地，“与骨关节炎相关的炎症”和“局限于关节的炎症”包含血管翳、滑膜增生和滑膜下炎症(还参见表2，见下文)。
“血管翳”包含纤维组织、滑膜和/或炎性细胞在关节边缘处的骨骼和/或软骨的表面上的长出物的含义。“滑膜增生”，也称为滑膜细胞增生，包含滑膜成纤维细胞的细胞数量增加的含义。“滑膜下炎症”包含炎性细胞(嗜中性粒细胞、巨噬细胞和/或淋巴细胞)浸润到滑膜空间中的含义。
然而，关节中的严重慢性炎症(例如，导致发热和发红)不是骨关节炎的典型体征，但通常是类风湿性关节炎的体征。因此，与类风湿性关节炎相比，骨关节炎的炎症程度通常是轻度的。
在不存在炎症但存在骨关节炎的特征的情况下，这种病状可以被称为骨关节病。然而，根据术语“骨关节炎”的常见用法，术语“骨关节炎”在本文中的广泛使用还旨在涵盖病状“骨关节炎”。
患者组
根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株适用于哺乳动物。根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株可以适用于啮齿类哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠。优选地，所述至少一种益生菌菌株适用于非啮齿类哺乳动物使用，例如猫、狗、马、猴子。最优选地，所述至少一种益生菌菌株适用于人(男性和/或女性)，包含老年人(如年龄在50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁或85岁以上的人)、绝经后女性、围绝经期女性和绝经前女性，因为这些人是患有骨关节炎或通常可能患有骨关节炎的个体。所述至少一种益生菌菌株也可以适用于肥胖哺乳动物，尤其是肥胖人(男性和/或女性)。
在其它方面，健康的人也可以从本发明中受益，以便预防软骨损伤、关节处的骨损伤或局限于关节的炎症，这可能导致骨关节炎。
优选地，根据本发明的第一方面的供使用的至少一种益生菌菌株用于治疗和/或预防绝经后女性、绝经开始之后六年或更短时间的女性、围绝经期女性或绝经前女性的OA。
优选地，根据本发明的第一方面的供使用的至少一种益生菌菌株对治疗和/或预防雄性哺乳动物，具体地男性的骨关节炎是有效的。优选地，所述至少一种益生菌菌株用于年龄在45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁或80岁以上的男性或年龄介于45岁与80岁之间，如介于45岁与50岁之间、介于50岁与55岁之间、介于55岁与60岁之间、介于60岁与65岁之间、介于65岁与70岁之间、介于70岁与75岁之间、介于75岁与80岁之间、介于45岁与55岁之间、介于50岁与60岁之间、介于55岁与65岁之间、介于60岁与70岁之间、介于65岁与75岁之间、介于70岁与80岁之间、介于45岁与60岁之间、介于50岁与65岁之间、介于55岁与70岁之间、介于60岁与75岁之间、介于65岁与80岁之间、介于45岁与65岁之间、介于50与70之间、介于55岁与75岁之间、介于60岁与80岁之间、介于45岁与70岁之间、介于50岁与75岁之间、介于55岁与80岁之间、介于45岁与75岁之间或介于50岁与80岁之间的男性。
另外或可替代地，根据本发明的第一方面的供使用的至少一种益生菌菌株对治疗和/或预防雌性哺乳动物，具体地绝经后女性、绝经开始后六年或更短时间的女性、围绝经期女性或绝经前女性的骨关节炎。具体地，所述至少一种益生菌菌株可以适用于年龄在45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁或80岁以上的女性。例如，所述至少一种益生菌菌株可以适用于年龄介于45岁与80岁之间，如介于45岁与50岁之间、介于50岁与55岁之间、介于55岁与60岁之间、介于60岁与65岁之间、介于65岁与70岁之间、介于70岁与75岁之间、介于75岁与80岁之间、介于45岁与55岁之间、介于50岁与60岁之间、介于55岁与65岁之间、介于60岁与70岁之间、介于65岁与75岁之间、介于70岁与80岁之间、介于45岁与60岁之间、介于50岁与65岁之间、介于55岁与70岁之间、介于60岁与75岁之间、介于65岁与80岁之间、介于45岁与65岁之间、介于50与70之间、介于55岁与75岁之间、介于60岁与80岁之间、介于45岁与70岁之间、介于50岁与75岁之间、介于55岁与80岁之间、介于45岁与75岁之间或介于50岁与80岁之间的女性。
优选地，“绝经后女性”是从绝经开始起一年、两年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年、十年、十一年或十二年内的女性，并且最优选地是绝经开始后六年或更短时间的女性。
绝经是大多数女性生活中月经周期永久停止并且不再能够生育的时间。绝经通常发生在49岁与52岁之间。医学专家通常将绝经定义为女性一年没有阴道流血时发生的绝经。因此，绝经本身的日期通常是在最后一次出现经血后12个月过去后追溯性确定的。在生理水平上，绝经是由于卵巢中雌激素和孕激素的分泌减少而发生的。因此，绝经也可以通过卵巢分泌这些激素的减少来定义，并且可以通过测量血液或尿液中的激素水平来确定绝经的诊断。在那些经过外科手术切除子宫但仍然有卵巢的患者中，绝经可能被视为在手术时或激素水平下降时发生。子宫切除后，绝经症状通常较早发生。
术语“绝经前”包含直到最后一个月经期的年份的含义，此时生殖激素的水平变得越来越可变和更低，并且存在激素戒断的影响。绝经前通常在每月周期明显变得不规律之前开始。“绝经前妇女”是指绝经前的女性。
术语“围绝经期”(字面上是“围绝经期”)是指绝经过渡期，通常是在月经来潮的最后一天之前和之后的时间。因此，“围绝经期女性”是指围绝经期的女性。通常，围绝经期开始于40岁与50岁之间(平均年龄为47.5岁)，并且可以持续四到十年。例如，围绝经期可以持续四到八年，开始于时间段之间的时间长度的变化时间并且结束于最终月经期后的一年(北美绝经协会(The North American Menopause Society)，https://web.archive.org/web/20130410111346/http://www.menopause.org/for-women/menopauseflashes/menopause-101-a-primer-for-the-perimenopausal)。可替代地，围绝经期可以持续六到十年，结束于最后一次月经期后12个月(Dr Jerilynn C.Prior,月经周期和排卵研究中心(Centre for Menstrual Cycle and Ovulation Research)，https://web.archive.org/web/20130225055347/http://cemcor.ca/help_yourself/perimenopause)。与绝经前相比，围绝经期期间的雌激素水平平均高出约20-30％，且通常波动较大。这些波动会导致围绝经期以及绝经的许多生理变化，包含潮热、盗汗、睡眠困难、阴道干燥或萎缩、失禁、骨质疏松和心脏病。
术语“绝经后”通常是描述至少有12个月没有经历过任何月经的女性(因而证实月经周期已经停止)，假设所述女性有子宫并且没有怀孕或处于哺乳期。在没有子宫的女性中，绝经或绝经后可以通过血液测试显示卵泡刺激素(FSH)水平非常高来鉴定。因此，绝经后也可以定义为女性卵巢变得不活跃之后的时间。随着女性生殖激素水平持续下降并在绝经后一段时间内波动，如潮热等激素戒断效应可能需要数年才能消失。
益生菌菌株
益生菌被定义为“当以适当量施用时可以赋予宿主健康益处的活微生物”(Hill等人,《自然评论：胃肠病学与肝脏病学(Nat Rev Gastroenterol Hepatol)》,2014,11(8):506-514)。乳杆菌属和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的细菌是益生菌产品中最常用的细菌。这些细菌通常是安全的，因为益生菌产品基于这些生物体。为了使细菌符合益生菌的定义，通常必须能够在肠道中生存并在肠道中定居，在生产和储存过程中生存，并有证据表明其对消费者健康具有积极作用。
“至少一种益生菌菌株”包含一种或多种细菌菌株的含义，所述一种或多种细菌菌株当以足够量施用时会赋予宿主健康益处。通常，所述至少一种益生菌菌株的施用将改变肠微生物群的组成。
根据本发明的第一方面的供使用的至少一种益生菌菌株可以选自乳杆菌属的任何合适的菌株。具体地，根据本发明的第一方面的供使用的乳杆菌属的至少一种益生菌菌株可以选自以下物种的一种或多种菌株：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)。
乳杆菌属的至少一种益生菌菌株可以是副干酪乳杆菌的至少一种菌株。
优选地，副干酪乳杆菌的所述至少一种益生菌菌株选自副干酪乳杆菌DSM 13434(8700:2)或副干酪乳杆菌DSM 13432(02:A)。
副干酪乳杆菌DSM 13434(8700:2)和副干酪乳杆菌DSM 13432(02:A)由普诺碧公司(Probi AB)于2000年4月6日保藏于Mascheroder Weg 1b,D-38124Braunschweig,Germany的DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH。
优选地，副干酪乳杆菌的所述至少一种益生菌菌株是副干酪乳杆菌DSM 13434(8700:2)。
乳杆菌属的至少一种益生菌菌株可以是植物乳杆菌的至少一种菌株。
优选地，植物乳杆菌的所述至少一种益生菌菌株选自植物乳杆菌DSM 6595(299)、植物乳杆菌DSM 9843
Figure BDA0003306108740000111
植物乳杆菌DSM 15312(HEAL 9)、植物乳杆菌DSM 15313(HEAL 19)、植物乳杆菌DSM 15316(HEAL 99)、植物乳杆菌DSM 32131(GOS42)、植物乳杆菌DSM 17852(LB3e)和植物乳杆菌DSM 17853(LB7c)。
植物乳杆菌DSM 6595(299)于1991年7月2日以普诺碧(即，普诺碧公司)的名义保藏于Mascheroder Weg 1B,D-3300Braunschweig,Germany的DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VONMIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH。
植物乳杆菌DSM 9843
Figure BDA0003306108740000121
由普诺碧公司于1995年3月16日保藏于MascheroderWeg1b,D-38124 Braunschweig,Germany的DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMENUND ZELLKULTUREN GmbH。
植物乳杆菌DSM 15312(HEAL 9)、植物乳杆菌DSM 15313(HEAL 19)和植物乳杆菌DSM 15316(HEAL 99)由普诺碧公司于2002年11月27日保藏于Mascheroder Weg 1b,D-38124Braunschweig,Germany的DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UNDZELLKULTUREN GmbH。
植物乳杆菌DSM 32131(GOS42)由普诺碧公司于2015年9月2日保藏于Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany的德国微生物和细胞培养物保藏库(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and CellCultures)。
植物乳杆菌DSM 17852(LB3e)和植物乳杆菌DSM 17853(LB7c)由Probac AB于2006年1月6日保藏于Mascheroder Weg 1b,D-38124Braunschweig,Germany的DSMZ-DEUTSCHESAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH。随后将与微生物保藏DSM17852和DSM 17853相关的所有权利和义务授予普诺碧公司，其现在已成为DSM17852和DSM17853菌株的保藏人。
优选地，植物乳杆菌的所述至少一种益生菌菌株是植物乳杆菌DSM 15312(HEAL9)和/或植物乳杆菌DSM 15313(HEAL 19)。
在根据本发明的第一方面的实施例中，乳杆菌属的所述至少一种益生菌菌株选自副干酪乳杆菌的至少一种益生菌菌株和/或植物乳杆菌的至少一种益生菌菌株。优选地，乳杆菌属的所述至少一种益生菌菌株是副干酪乳杆菌DSM 13434(8700:2)和植物乳杆菌的至少一种益生菌菌株。例如，副干酪乳杆菌8700:2(DSM 13434)可以与植物乳杆菌的一种、两种或更多种益生菌菌株组合使用。
在根据本发明的第一方面的最优选的实施例中，所述至少一种益生菌菌株是副干酪乳杆菌DSM 13434(8700:2)与植物乳杆菌DSM 15312(HEAL 9)和植物乳杆菌DSM 15313(HEAL19)的组合。
根据本发明的第一方面的益生菌菌株可以是有活力的、灭活的或死亡的。优选地，所述益生菌菌株是有活力的。例如，优选地，将益生菌菌株冷冻干燥。
组合物
根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株可以存在于包括至少一种合适的载体的组合物中。因此，本发明的第一方面包含一种组合物，所述组合物包括根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株和一种或多种载体，所述组合物用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎。
例如，载体可以是稀释剂或赋形剂。所述组合物可以呈固体或液体调配物的形式，并且因此所述至少一种载体可以是固体或液体或可以包括至少一种固体组分和至少一种液体组分两者。
合适的液体载体的实例包含水、牛奶、椰子水、水果饮料和果汁、牛奶代用品(大豆饮料、燕麦饮料、坚果和其它基于植物的饮料)、起泡饮料、甘油、丙二醇和其它水性溶剂。
合适的固体载体或赋形剂的实例包含麦芽糖糊精、菊粉、纤维素(如微晶纤维素(MCC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)或羟丙基纤维素(HPC))、糖醇、高分子量聚乙二醇、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸、崩解剂(如淀粉(优选地为玉米、马铃薯、木薯或其它植物淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐)以及制粒粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶)。另外，可以包含润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。
在根据本发明的第一方面的实施例中，载体可以选自药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂、食品级载体、食品级赋形剂、稀释剂和食品。
合适的药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂的实例包含本领域的技术人员熟知的载体、赋形剂和稀释剂，例如在《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)》,第19版,第1和2卷(编辑Gennaro,1995,马克出版公司(MackPublishing Company))中给出的载体、赋形剂和稀释剂。
“食品级”包含符合“公认安全”(GRAS)标准的载体、成分和赋形剂。
“食品”包含用于消费的任何物质，以便为哺乳动物，优选地人提供营养益处或支持。合适的食品载体的实例包含饮料(例如，果汁)、乳制品(例如，酸奶、奶酪、冰淇淋、婴儿配方食品和涂抹食品，如人造黄油)、乳制品替代产品(例如，大豆、坚果或其它基于植物的饮料、酸奶和涂抹食品)、基于谷物的产品(例如，面包、饼干、早餐谷物、意大利面和干食品条(如健康条))和婴儿食品(例如，水果泥和/或蔬菜泥)。
根据本发明的第一方面的组合物可以是干燥的非发酵组合物、发酵组合物或干燥的发酵组合物。在此上下文中，发酵具体地包含在厌氧条件下通过乳酸菌发酵乳酸。在干燥的非发酵组合物的情况下，在受试者摄入之前基本上不发生发酵，并且因此发酵仅在受试者摄入组合物之后在胃肠道中进行。
因此，在根据本发明的第一方面的一些实施例中，所述组合物呈食品的形式，其中所述食品是基于谷物的产品、乳制品、果汁饮料或发酵食品。
发酵食品的实例包含发酵乳制品(如酸奶、开菲尔(kefir)或酸奶昔(lassi))、无乳发酵替代乳品(如椰奶开菲尔)、基于发酵谷物的产品(如燕麦、燕麦片、玉米、高粱、小麦)、发酵蔬菜(如德国泡菜、韩国泡菜或咸菜)、发酵豆类或大豆(如纳豆或丹贝)和发酵茶(如康普茶)。
在根据本发明的第一方面的一些实施例中，所述至少一种益生菌菌株存在于非天然存在的组合物中，例如，组合物不仅包括益生菌菌株和水。
在使用中，在向哺乳动物施用之前，可以将根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株或包括所述至少一种益生菌菌株的组合物与液体或固体载体混合。例如，受试者可以在摄入之前将所述至少一种益生菌菌株或其组合物与包括一种或多种液体的载体混合，所述一种或多种液体选自水、牛奶、椰子水、水果饮料和果汁、牛奶代用品(大豆饮料、燕麦饮料、坚果和其它基于植物的饮料)、起泡饮料或其它一些水性溶剂或饮料。类似地，可以将所述至少一种益生菌菌株或其组合物与由一种或多种食品组成的载体混合。合适的食品载体包含燕麦片载体、大麦载体、发酵的或非发酵乳制品，如酸奶、冰淇淋、奶昔、果汁、饮料、汤、面包、饼干、意大利面、早餐谷物、干食品条(包含健康条)、基于植物的食品(如大豆产品)、涂抹酱、婴儿食品、婴儿营养品、婴儿配方食品、出生时的母乳替代品。
优选地，调配物是含有日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分的包括益生菌菌株的组合物的单位剂量。
根据本发明的第一方面的组合物可以是膳食补充剂。“膳食补充剂”包含旨在通过口食用例如丸剂、胶囊剂、片剂或液体剂来补充饮食的制成品的含义。膳食补充剂可能含有生命必需的物质和/或尚未被证实对生命至关重要的物质，但可能具有有益的生物学作用。当根据本发明的第一方面的组合物呈膳食补充剂的形式时，待添加的载体包含本领域的技术人员熟知的载体，例如在《雷明顿：药学科学与实践》,第19版,第1和2卷(编辑Gennaro,1995,马克出版公司)中给出的载体，或任何合适的食品级载体。膳食补充剂中通常使用的任何其它成分是技术人员已知的，并且也可以常规地与至少一种益生菌菌株一起添加。
根据本发明的第一方面的组合物可以以溶液、悬浮液、乳剂、片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、锭剂、口香糖或栓剂的形式提供。
例如，在优选实施例中，根据本发明的第一方面的组合物是包括经过冷冻干燥的乳杆菌属的胶囊形式的膳食补充剂，如包括1010个CFU经过冷冻干燥的乳杆菌属的胶囊形式的膳食补充剂。
在根据本发明的第一方面的实施例中，所述至少一种益生菌菌株以约1×106到约1×1014个CFU/剂量，优选地约1×108到约1×1012个CFU/剂量，更优选地约1×109到约1×1011个CFU/剂量，并且最优选地约1×1010个CFU/剂量的量存在(例如，存在于组合物中)。如果所述至少一种益生菌菌株由多于一种益生菌菌株组成，则此量表示益生菌菌株的组合的总CFU/剂量。例如，所述至少一种益生菌菌株可以以约1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012或约1×1013个CFU/剂量的量存在。所述至少一种益生菌菌株可以以约1×1014、1×1013、1×1012、1×1011、1×1010、1×109、1×108或约1×107个CFU/剂量的量存在。根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株也可以单独用于在摄取之前添加或混合至少一种益生菌菌株的水或任何其它水性媒剂中。
在根据本发明的第一方面的实施例中，组合物补充有软骨保护剂。软骨保护剂(或软骨保护性化合物)包含延迟关节炎(或骨关节炎)的进行性关节间隙变窄特性的任何特定化合物或化学品。例如，软骨保护剂可以执行以下中的一个或多个：(1)刺激胶原蛋白和蛋白聚糖的软骨细胞合成；(2)增强透明质酸的滑膜细胞产生；(3)抑制软骨降解；(4)防止在脉管系统中纤维蛋白形成。可以将技术人员已知的任何软骨保护剂添加到组合物中。在优选实施例中，软骨保护剂选自硫酸软骨素、氨基葡萄糖和/或透明质酸。
根据本发明的第一方面的组合物可以以片剂、胶囊剂、粉剂、珠粒剂、酏剂、溶液或悬浮液的形式口服、经颊或舌下施用，其可以含有调味剂或着色剂，用于立即释放、延迟释放或控制释放应用。组合物可以以粉末组合物的形式施用，如速溶微生物组合物，例如在与
Figure BDA0003306108740000151
速溶技术相关的WO 2017/060477或普诺碧的出版物WO 2018/224509中描述的粉末组合物，所述两个文献的全部内容通过引用并入本文。当粉末不在速溶微生物组合物中时，其可能适合于在摄入前添加到食品(例如，酸奶)或饮料(例如，水或奶)中。
当组合物呈粉末的形式时，通常将所述组合物填充在密封的容器中，所述容器提供氧气和湿气屏障，以保护和维持益生菌在组合物中的活力。因此，在组合物呈粉末的形式的情况下，优选地将组合物包装在密封的铝箔棒中，其中每个棒包括一个剂量的组合物，即，一个剂量的益生菌。合适的容器的非限制性实例包含棒、袋、小袋或胶囊。在优选实施例中，容器是通常通过焊接密封的铝箔或聚乙烯棒。棒通常被配置成易于撕开。棒可以具有撕开凹口。
根据本发明的第一方面的组合物可以调配成控释固体剂型，例如在WO 03/026687和美国专利第8,007,777号和第8,540,980号中描述的控释固体剂型中的任何一种，所述文献的全部内容通过引用并入本文。所述组合物可以调配成层状剂型，例如普诺碧的包含在WO2016/003870中描述的任何层状剂型的
Figure BDA0003306108740000161
技术，所述文献的全部内容通过引用并入本文。
可以通过压制或模制，任选地用一种或多种辅助成分来制备片剂。压制片剂可以通过在合适的机器中压制呈自由流动形式(如粉末或颗粒剂)的(例如，经过冷冻干燥的)至少一种益生菌菌株来制备，任选地与粘合剂(例如，聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备模制片剂。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以被调配为使得使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素来提供其中活性成分的缓慢或控释，以提供期望的释放曲线。
本发明的第二方面提供了一种组合物，所述组合物包括根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株，所述组合物用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎。
因此，根据本发明的第二方面的组合物可以是根据以上关于本发明的第一方面描述的组合物。
药物组合物
本发明的第二方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株和一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述药物组合物用于治疗和/或预防哺乳动物，优选地非啮齿类哺乳动物，更优选地人，最优选地年龄在45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁或80岁以上的男性或女性的骨关节炎。例如，根据本发明的第二方面的药物组合物可能适合的受试者(例如，患者组)的偏好包含上文关于本发明的第一方面给出的那些偏好。
根据本发明的第二方面的药物组合物可以是如以上关于本发明的第一方面描述的组合物。术语“药学上可接受的”包含一种或多种赋形剂对其接受者必须无害，并且必须与根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株相容。此类药学上可接受的赋形剂的实例是本领域熟知的，并且包含以上关于本发明的第一方面描述的赋形剂，例如在《雷明顿：药学科学与实践》,第19版,第1和2卷(编辑Gennaro,1995,马克出版公司(Mack PublishingCompany))中描述的赋形剂。
例如，药物组合物可以调配成控释固体剂型，例如在WO 03/026687和美国专利第8,007,777号和第8,540,980号中描述的控释固体剂型中的任何一种，或者药物组合物可以调配成分层剂型，例如在WO 2016/003870中描述的分层剂型中的任何一种。
一种或多种药学上可接受的赋形剂可以是无菌的和无热原的水或盐水。
优选地，根据本发明的第二方面的药物组合物可以通过包含口服和管饲的任何常规方法来施用。施用可以在一段时间内由单个剂量或多个剂量组成。
治疗方法
本发明的第三方面提供了一种用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用有效剂量的根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株、根据本发明的第一方面的组合物和/或根据本发明的第二方面的药物组合物。
优选地，根据本发明的第三方面的方法包含其中对骨关节炎的治疗和/或预防是通过治疗和/或预防软骨损伤、关节处的骨损伤和与骨关节炎相关的炎症中的一种或多种来进行的方法。
优选地，对骨关节炎的所述治疗和/或预防是通过治疗和/或预防软骨损伤来进行的。
优选地，对骨关节炎的所述治疗和/或预防是通过治疗和/或预防关节处的骨损伤来进行的。
优选地，对骨关节炎的所述治疗和/或预防是通过治疗和/或预防与骨关节炎相关的炎症，优选地通过治疗和/或预防局限于关节的炎症来进行的。
实施根据本发明的第三方面的方法所针对的哺乳动物可以是以上关于本发明的第一方面给出的任何哺乳动物。优选地，哺乳动物是雄性，具体地男性。哺乳动物可以是雌性，具体地女性，如围绝经期女性或绝经后女性。例如，女性可以是从绝经开始起一年、两年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年、十年、十一年或十二年内的女性，如绝经开始后六年或更短时间的女性。因此，在根据本发明的第三方面的方法的一个实施例中，治疗在绝经开始后六年或更短时间开始。
根据本发明的第三方面的方法的施用可以包含如以上关于本发明的第一方面描述的口服、经颊或舌下施用。
根据本发明的第三方面的方法的施用可以包含至少一天、两天、三天、四天、五天、六天或七天一次或至少一周一次、两次、三次、四次、五次、六次或七次施用。优选地，每天进行一次施用。
根据本发明的第三方面的方法的施用可以包含重复施用长达一天、两天、三天、四天、五天或六天，长达一周、两周、三周、四周或五周，长达一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或十二个月或者长于一年、两年或三年或更长时间。优选地，重复施用至少7天，如至少一周、两周、三周，更优选地至少四周、一个月、两个月或三个月，并且甚至更优选地至少六个月、九个月或一年。
根据本发明的第一方面，根据本发明的第三方面的方法的施用优选地为约1×106到约1×1014个CFU/单位剂量，优选地为约1×108到约1×1012个CFU/单位剂量，更优选地为约1×109到约1×1011个CFU/单位剂量，并且最优选地为约1×1010个CFU/单位剂量的单位剂量。根据本发明的第三方面的方法的施用优选地产生的有效剂量为约1×106到约1×1014个CFU/单位剂量，优选地为约1×108到约1×1012个CFU/单位剂量，更优选地为约1×109到约1×1011个CFU/单位剂量，并且最优选地为约1×1010个CFU/单位剂量。优选地，每天向每个受试者施用一个单位剂量。因此，根据本发明的第三方面的方法的施用优选地产生的每日剂量为约1×106到约1×1014个CFU/天，优选地为约1×108到约1×1012个CFU/天，更优选地为约1×109到约1×1011个CFU/天，并且最优选地为约1×1010个CFU/天。
应当理解的是，优选的每日剂量也可以通过施用多于一个亚剂量来实现，例如，通过每天两次施用包括优选的每日剂量的一半的单位剂量来实现。因此，有效剂量的优选范围也可以表示在任何实际单位剂量下要达到的优选每日剂量。
可以指导受试者将治疗有效量的根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株、根据本发明的第一方面的组合物或根据本发明的第二方面的药物组合物与水、另一种水性溶剂或食品产品，例如酸奶一起食用。
本发明的第四方面提供了包括根据本发明的第一方面的至少一种益生菌菌株、根据本发明的第一方面的组合物或根据本发明的第二方面的药物组合物的组合物用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎的用途。
本说明书中对显然在前公布的文件的列举或讨论不应必然地被视为是承认所述文件是现有技术的一部分或者是公知常识。
现在将参考以下实例和附图更详细地描述本发明。
附图说明
图1公开了实例1的项目计划图。
图2公开了益生菌对胫骨骨骺小梁骨(胫骨近端骨骺处的小梁骨)的影响。(A)如通过胫骨骨骺的微CT评估的，雄性小鼠的DMM手术和未手术膝关节的小梁骨体积/总体积(BV/TV)；(B)小梁厚度(Tb.Th)；(C)小梁分离(Tb.Sp)；(D)小梁数量(Tb.N)；和(E)来自同一实验的小梁模式因子(Tb.Pf)。值是每组11-13只小鼠的平均值±SEM。各组之间的显著差异由*＝p<0.05指示。
图3公开了益生菌对包括皮质骨的胫骨软骨下骨板(内侧和外侧软骨下骨板)的影响。(A)如通过胫骨软骨下骨的微CT评估的，雄性小鼠的DMM手术和未手术膝关节的内侧板厚度；(B)来自同一实验的外侧板厚度。值是每组11-13只小鼠的平均值±SEM。各组之间的显著差异由*＝p<0.05指示。
图4公开了益生菌对股骨骨骺小梁骨(股骨远端骨骺处的小梁骨)的影响。(A)如通过股骨骨骺的微CT评估的，雄性小鼠的DMM手术和未手术膝关节的小梁骨体积/总体积(BV/TV)；(B)小梁厚度(Tb.Th)；(C)小梁分离(Tb.Sp)；(D)小梁数量(Tb.N)；和(E)来自同一实验的小梁模式因子(Tb.Pf)。值是每组10-13只小鼠的平均值±SEM。各组之间的显著差异由*＝p<0.05指示。
图5公开了益生菌对包括皮质骨的股骨软骨下骨板(内侧和外侧软骨下骨板)的影响。(A)如通过股骨软骨下骨的微CT评估的，雄性小鼠的DMM手术和未手术膝关节的内侧板厚度；(B)来自同一实验的外侧板厚度。值是每组10-13只小鼠的平均值±SEM。各组之间的显著差异由*＝p<0.05指示。
图6公开了益生菌对DMM诱导的软骨损伤的影响。(A)在雄性小鼠的DMM手术膝关节中，四个部位：内侧股骨髁(MFC)、外侧股骨髁(LFC)、内侧胫骨平台(MTP)和外侧胫骨平台(LTP)处的骨关节炎(OA)评分。(B)来自同一实验的股骨部位与胫骨部位处的OA评分总和。(C)来自同一实验的内侧部位与外侧部位处的OA评分总和。值是每组10-13只小鼠的平均值±SEM。各组之间的显著差异由*＝p<0.05和**＝p<0.01指示。
图7公开了益生菌对DMM膝关节的炎症的影响。根据Jackson等人,2014的半定量滑膜炎评分系统对炎症进行评分(参见表2，见下文)。值是每组10-13只小鼠的平均值±SEM。
图8公开了微生物组和益生菌对DMM膝关节的滑膜下炎症的特定炎症量度的影响，根据Jackson等人,2014的半定量滑膜炎评分系统进行评分(参见表2，见下文)。值是每组10-13只小鼠的平均值±SEM。
图9公开了微生物组和益生菌对具有DMM诱导的软骨损伤的小鼠的炎性细胞因子浓度的影响。通过
Figure BDA0003306108740000191
MAP小鼠细胞因子/趋化因子磁珠面板分析来自微生物组实验的小鼠血清样品。总共研究了17种小鼠细胞因子。图表示出了在三种不同干预下观察到的每种细胞因子的浓度(pg/mL)。值是每组4-12只小鼠的平均值±SD(每种细胞因子的实际样品数量指示在每个图表的标题中)。使用“离群值的四分位数间距规则”鉴定离群值。在样品对之间示出了显著的p值。
具体实施方式
示例性剂型
除了以上提及的调配物(并且通过引用并入本文)之外，以下实例还说明了根据本发明的药物调配物。
实例A：片剂
Figure BDA0003306108740000201
片剂由上述成分通过湿法制粒然后通过压缩来制备。
实例B：片剂调配物
以下调配物A和B通过以下来制备：将成分用聚维酮溶液湿法制粒，然后添加硬脂酸镁并且进行压缩。
调配物A
Figure BDA0003306108740000202
调配物B
Figure BDA0003306108740000203
调配物C
Figure BDA0003306108740000204
Figure BDA0003306108740000211
以下调配物D和E是通过直接压缩混合成分来制备的。调配物E中使用的乳糖属于方向压缩类型(direction compression type)。
调配物D
益生菌菌株 1×1010个CFU
预胶化淀粉NF15 150mg
调配物E
益生菌菌株 1×1010个CFU
乳糖 150mg
Figure BDA0003306108740000212
100mg
调配物F(控释调配物)
所述调配物通过以下来制备：将成分(下面的成分)用聚维酮溶液湿法制粒，然后添加硬脂酸镁并且进行压缩。
Figure BDA0003306108740000213
释放在约6-8小时的时间段内发生并且在12小时之后完成。
实例C：胶囊调配物
调配物A
通过混合上述实例B中调配物D的成分并填充到两节硬明胶胶囊中来制备胶囊调配物。以类似的方式制备调配物B(见下文)。
调配物B
Figure BDA0003306108740000214
Figure BDA0003306108740000221
调配物C
(a)益生菌菌株 1×1010个CFU
(b)聚乙二醇4000BP 350mg
胶囊通过以下来制备：将聚乙二醇4000BP熔融；将益生菌菌株分散在熔体中；并且将熔体填充到两节硬明胶胶囊中。
调配物D(控释胶囊)
通过使用挤出机挤出成分a、b和c，然后将挤出物滚圆并干燥来制备以下控释胶囊调配物。然后用释放控制膜(d)将经过干燥的团粒包衣，并且填充到两件式硬明胶胶囊中。
Figure BDA0003306108740000222
实例D：粉末调配物
调配物A(速溶微生物组合物)
Figure BDA0003306108740000223
调配物B(速溶微生物组合物)
Figure BDA0003306108740000224
实验实例1-在DMM手术小鼠中，益生菌对骨关节炎(OA)发展的影响远超过正常微 生物组对OA发展的影响。
检查了肠道微生物组在经受内侧半月板去稳定(DMM)的小鼠的骨关节炎的发展中的作用，并且评估了益生菌对骨关节炎发展的影响远超过正常微生物组对骨关节炎发展的影响。
关于用于此研究的模型的选择，考虑了Glasson等人(2007,129/SvEv小鼠的骨关节炎的外科手术内侧半月板去稳定(DMM)模型(The surgical destabilization of themedial meniscus(DMM)model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse),《骨关节炎和软骨(Osteoarthr Cartil)》15(9):1061-1069)的发现，Glasson等人评估了骨关节炎的前交叉韧带横切(ACLT)和内侧半月板去稳定(DMM)外科手术不稳定性模型。据报道，ACLT会引起更严重的损伤，而DMM会引起轻度至中度的损伤，其类似于自发性OA发展。
材料和方法
如先前所示，使用抗生素处理来耗尽小鼠肠道微生物(Ellekilde等人,2014,《科学报告》4:5922；Reikvam等人,2011,《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》6(3):e17996)。最初，从出生前一周开始，在饮用水中随意向怀孕小鼠施用氨苄青霉素，直到后代小鼠达到3周龄(即，断奶龄)。除了饮用水中的氨苄青霉素之外，如先前所述，每日通过管饲法向后代小鼠施用由万古霉素、新霉素、甲硝唑和两性霉素-B氨苄青霉素组成的抗生素混合物(Reikvam等人,2011,《公共科学图书馆·综合》6(3):e17996)，持续断奶后3周。如先前所述，在所述时间段结束时(出生后六周)，将健康小鼠的粪便样品无菌地移出并且移植到经过抗生素处理的宿主中(粪便微生物群移植，FMT)(Ellekilde等人,2014,《科学报告》4:5922)。简言之，将样品在50％甘油/PBS溶液中以1:10稀释，在液氮中冷冻并且保持在-80℃。接种当天，将粪便溶液进一步以1:5稀释，并且然后通过管饲法(每只接受者小鼠0.15ml)施用。这使肠道微生物组得以恢复。肠道微生物组的假手术重构涉及口服管饲甘油/PBS溶液。
使所有小鼠在8周龄时经受内侧半月板去稳定(DMM)。使用手术显微镜在一条腿上进行DMM。对侧膝关节保持不进行手术，并且用作内部对照来评估DMM对OA发展的影响。益生菌或媒剂(甘油)治疗在DMM前两周(即，在6周龄时)开始并且在外科手术后持续8周(即，直到16周龄)，以便研究益生菌治疗对DMM诱导的OA的预防作用。益生菌治疗是以下三种乳杆菌属(L)菌株的混合物：副干酪乳杆菌DSM 13434、植物乳杆菌DSM 15312和DSM 15313。根据普诺碧公司提供的说明书，将乳杆菌属菌株在饮用水中进行施用(将10mL的含有等量的三种细菌菌株中的每种细菌菌株的研究产品用水稀释至600mL，以使最终总浓度为109个CFU/mL)。对照组接受具有媒剂(甘油)的水(参见图1的项目计划图)。外科手术后八周(即，16周龄时)，通过CO2窒息处死小鼠，并且通过微CT扫描膝关节以寻找软骨下骨的定量和定性变化。
对膝关节的微CT分析按van't Hof(2012,使用微计算断层摄影术分析啮齿类动物中的骨构造(Analysis of bone architecture in rodents using microcomputedtomography),《分子生物学方法(Methods Mol Biol)816:461-476)、Bouxsein等人(2010,使用微计算机断层摄影术评估啮齿类动物的骨微结构的指导(Guidelines forassessment of bone microstructure in rodents using micro-computedtomography),《骨矿物质研究杂志(J Bone Miner Res)》25:1468-1486)以及Campbell和Sophocleous(2014,通过微计算机断层摄影术定量分析骨结构(Quantitative analysisof bone structure by micro-computed tomography),《BoneKEy报告(BoneKEyReports)》,3:564)中描述的进行。如先前在Sophocleous等人(2015,2型大麻素受体调节小鼠对骨关节炎的易感性(The type 2cannabinoid receptor regulates susceptibilityto osteoarthritis in mice),《骨关节炎和软骨》23:1585-1594)中描述的，通过微CT对关节周围骨进行分析。简言之，将Skyscan 1172仪器设置为60kV和167mA。在冠状平面内进行胫骨和股骨骨骺小梁骨分析，分辨率为5mm。采集后，使用Skyscan NRecon程序重构图像，并使用Skyscan CTAn软件进行分析。
在这项动物研究中未测量骨矿物质密度(BMD)，而是反而通过微CT测量了小梁骨体积(BV/TV)。
对膝关节的组织学分析也按Glasson等人(2007,129/SvEv小鼠的骨关节炎的外科手术内侧半月板去稳定(DMM)模型,《骨关节和炎软骨》15(9):1061-1069)、Glasson SS等人(2010,OARSI组织病理学主动性-对小鼠的骨关节炎的组织学评估的建议(The OARSIhistopathology initiative–recommendations for histological assessments ofosteoarthritis in the mouse),《骨关节炎和软骨》18:S17-23)以及Sophocleous和Huesa(2019,内侧半月板去稳定的骨关节炎小鼠模型(Osteoarthritis Mouse Model ofDestabilization of the Medial Meniscus),第281-293页,在Idris[ed],《骨研究方案(Bone Research Protocols)》,《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,第1914卷,瑚玛娜出版社(Humana Press),纽约，纽约州)中详述的进行。具体地，组织学分析集中于软骨和对膝关节处的局部炎症的评估。组织学分析如先前在Sophocleous等人(2015,见上文)中描述的进行。简言之，将固定的全关节在10％甲酸中脱钙1周。然后根据标准技术对这些关节进行加工并且将其包埋在石蜡中。以45μm间隔通过整个关节取7μm厚度的冠状区段。然后将切片用番红素-O和苏木精进行染色。根据Glasson等人,2010,见上文的国际骨关节炎研究学会(OARSI)半定量评分系统，通过对药理学治疗不知情的观察者进行骨关节炎严重程度组织学评估，再现于表1中。评分分别从内侧胫骨平台(MTP)、内侧股骨髁(MFC)、外侧胫骨平台(LTP)和外侧股骨髁(LFC)产生。
表1-半定量OARSI评分系统(Glasson等人,2010,见上文)
等级 骨关节炎损伤
0 正常
0.5 没有结构变化的番红素-O损失
1 没有软骨损失的小纤维性颤动
2 垂直裂缝向下到表层正下方的层并且表面薄层有一些损失
3 钙化软骨的垂直裂缝/侵蚀延伸到关节面的<25％
4 钙化软骨的垂直裂缝/侵蚀延伸到关节面的25-50％
5 钙化软骨的垂直裂缝/侵蚀延伸到关节面的50-75％
6 钙化软骨的垂直裂缝/侵蚀延伸到关节面的>75％
对膝关节的局部炎症的评估如在Jackson等人(2014,蛋白酶活化受体2而非蛋白酶活化受体1的缺失可以通过分生外机制赋予小鼠针对骨关节炎的保护(Depletion ofprotease-activated receptor 2but not protease-activated receptor 1may conferprotection against osteoarthritis in mice through extracartilaginousmechanisms),《关节炎和风湿病(Arthritis Rheumatol)》66(12):3337-3348)中描述的进行。具体地，用于对局部炎症进行评分的系统是根据Jackson et al,2014,见上文的半定量滑膜炎评分系统，再现于下表2中：
表2–半定量滑膜炎评分系统(Jackson等人,2014,见上文)
Figure BDA0003306108740000251
Figure BDA0003306108740000261
对以下三组雄性小鼠进行所有CT分析：
第1组：“假手术FMT+甘油”(没有粪便微生物群移植并且仅施用媒剂[甘油]的小鼠)；
第2组：“FMT+甘油”(进行了粪便微生物群移植，然后施用媒剂[甘油]的小鼠)；
第3组：“FMT+益生菌”(进行了粪便微生物群移植，然后施用益生菌的小鼠)。
选择雄性小鼠，因为在DMM后，已经显示雄性的OA严重程度显著高于雌性(Ma等人,2007,骨关节炎严重程度在外科手术小鼠模型中是性别依赖性的,《骨关节炎和软骨》,15(6):695-700)。
统计方法
使用单向方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey HSD事后测试(用于均等方差)或Games-Howell事后测试(用于不均等方差)，评估各组之间的显著差异。将显著性水平设置为p<0.05。
结果
在未手术膝中通过益生菌施用增加膝关节处的胫骨骨骺小梁骨的量度
图2显示用FMT重构微生物组对本研究中测量的任何骨指数没有显著影响。
图2A显示，与“FMT+甘油”和“假手术FMT+甘油”组两者相比，“FMT+益生菌”组中的未手术膝的胫骨骨骺小梁骨体积(占总体积的比例)增加。在各组之间未观察到手术膝的胫骨骨骺小梁骨体积的统计学显著性差异。
同样，图2B显示，与“FMT+甘油”和“假手术FMT+甘油”组两者相比，“FMT+益生菌”组中的未手术膝的胫骨骨骺小梁厚度增加。在各组之间未观察到手术膝的胫骨骨骺小梁厚度的统计学显著性差异。然而，仅在“FMT+甘油”组中，手术膝与未手术膝的胫骨骨骺小梁厚度显著更高。
图2C和图2D分别显示，各组之间的胫骨骨骺小梁分离和胫骨骨骺小梁数量没有显著差异。
然而，图2E显示，与“假手术FMT+甘油”组相比，“FMT+益生菌”组中的未手术膝的胫骨骨骺小梁模式因子降低。小梁模式因子(Tb.Pf)与小梁连通性有关。Tb.Pf值越高表示连通性越低，而Tb.Pf值越低表示小梁之间的连通性越好(越高)。因此，结果表明益生菌施用改善了胫骨骨骺小梁连通性。似乎可能的是，这个结果是由于小梁厚度增加(图2B)和总体小梁骨体积增加(图2A)而不是由于小梁数量增加(图2D)。在各组之间未观察到手术膝的胫骨骨骺小梁模式因子的统计学显著性差异。
在未手术膝中通过益生菌施用增加膝关节处的胫骨软骨下骨板的量度
图3A显示，与“假手术FMT+甘油”组相比，“FMT+益生菌”组中的手术膝和未手术膝两者的胫骨软骨下骨板(皮质骨而不是小梁骨)的内侧板厚度增加。另外，与“FMT+益生菌”组的未手术膝相比以及还与“FMT+甘油”组的手术膝相比，“FMT+益生菌”组中的手术膝的胫骨软骨下骨板的内侧板厚度增加。
图3B显示，与“FMT+甘油”和“假手术FMT+甘油”组相比以及与“FTM+益生菌”组的手术膝相比，“FMT+益生菌”组中的未手术膝的胫骨软骨下骨板(皮质骨而不是小梁骨)的外侧板厚度增加。与内侧板厚度不同，与任何其它组相比，未观察到“FMT+益生菌”组的手术膝中的胫骨软骨下骨板的外侧板厚度增加。
因此，内侧骨板与外侧骨板的结果对于未手术膝是类似的，但对于手术膝，仅观察到内侧骨板厚度的统计学显著结果。
在手术膝和未手术膝中通过益生菌施用增加膝关节处的股骨骨骺小梁骨的量度
图4显示用FMT重构微生物组对股骨骨骺骨处的任何骨指数没有显著影响。
然而，与“FMT+甘油”和“假手术FMT+甘油”组相比，施用益生菌(“FMT+益生菌”组)增加了DMM手术和未手术膝关节两者中的股骨骨骺小梁骨体积(占总体积的比例；BV/TV；图4A)和股骨骨骺小梁厚度(Tb.Th.；图4B)。
图4C和图4D分别显示，各组之间的股骨骨骺小梁分离和股骨骨骺小梁数量没有显著差异。
图4E显示，与“FMT+甘油”和“假手术FMT+甘油”组两者相比，“FMT+益生菌”组中的未手术膝的股骨骨骺小梁模式因子降低，指示益生菌施用改善了股骨骨骺小梁连通性。像胫骨骨骺小梁连通性一样，似乎可能的是，这个结果是由于小梁厚度增加(图4B)和总体小梁骨体积增加(图4A)而不是由于小梁数量增加(图4D)。
图4E还显示，与“FMT+甘油”组相比，“FMT+益生菌”组中的DMM手术膝的股骨骨骺小梁模式因子降低，指示小梁连通性更好。
在手术膝中通过施用益生菌增加膝关节处的股骨软骨下骨板的量度
图5A显示，与“假手术FMT+甘油”组相比，“FMT+益生菌”组中的手术膝的胫骨软骨下骨板(皮质骨而不是小梁骨)的内侧板厚度增加。
图5B显示，与“假手术FMT+甘油”组相比以及与“FTM+益生菌”组的未手术膝相比，“FMT+益生菌”组中的手术膝的胫骨软骨下骨板(皮质骨而不是小梁骨)的外侧板厚度增加。
益生菌施用对DMM诱导的软骨损伤的保护作用
图6A显示，与“假手术FMT+甘油”组相比，“FMT+益生菌”组中的手术膝的内侧股骨髁(MFC)处评估的骨关节炎评分(基于软骨组织学)显著降低(降低38.8％±4.1％；p＝0.001)。图6B和图6C进一步显示对于作为整体的股骨部位(内侧股骨髁和外侧股骨髁；降低29.6％±5.7％；p＝0.008)和对于作为整体的内侧部位(内侧股骨髁和内侧胫骨平台)；降低20.2％±4.9％；p＝0.019)，骨关节炎评分降低。
益生菌施用对膝关节处的DMM诱导的局部炎症的保护作用
图7显示，与“假手术+甘油”组(平均评分＝0.96)和“FMT+甘油”组(平均评分＝0.87)相比，“FMT+益生菌”组(平均评分＝0.78)中在手术膝处评估的炎症评分降低。
益生菌施用对膝关节处的DMM诱导的滑膜下炎症的保护作用
图8显示，与“DMM/假手术/甘油”组(平均评分＝0.28)和“DMM/FMT/甘油”组(平均评分＝0.27)相比，“DMM/FMT/益生菌”组(平均评分＝0.15)中在手术膝处评估的滑膜下炎症的具体形态(即，通过表2的评分系统，见下文[Jackson等人,2014])降低。
结论
图2-5中的数据显示，施用益生菌治疗(副干酪乳杆菌DSM 13434、植物乳杆菌DSM15312和DSM 15313的组合)增加了胫骨骨骺处的未手术膝关节处和股骨骨骺处的未手术和手术膝关节处的小梁和皮质骨的量度。用这种益生菌治疗增加皮质骨的发现支持在WO2014/163568和Ohlsson等人(2014,《公共科学图书馆·综合》,9(3):e92368)中描述的早期发现。鉴于在WO 2014/163568和Ohlsson等人(2014,《公共科学图书馆·综合》,9(3):e92368)中描述的研究中未观察到对小梁骨的作用，用这种益生菌治疗增加小梁骨的发现是令人惊讶的。
骨骺小梁骨分析(图2-5)显示，益生菌的施用可以a)增加手术和未手术膝的BV/TV和Tb.Th；b)降低未手术膝的Tb.Pf；c)增加DMM手术膝的内侧和外侧骨板厚度；以及d)增加未手术膝的内侧骨板厚度。虽然较高的骨骺BV/TV和增加的骨板增厚有时可能是更具侵袭性的OA的标志，大家认为在本研究中观察到的骨增厚是由于益生菌对骨形成的影响(类似于Ohlsson等人,2014,见上文中针对皮质骨描述的)，而不是更严重的OA的结果，特别是因为OA评分在接受益生菌治疗的组中更低。
益生菌治疗还提供针对膝关节处，特别是内侧和股骨处，最特别是内侧股骨(内侧股骨髁)处的DMM诱导的软骨损伤的保护。内侧半月板(而非外侧半月板)的去稳定可能已经促成偏向于内侧上更大的整体软骨损伤，其效果是可更容易鉴定由益生菌治疗产生的保护。
益生菌治疗进一步提供针对由DMM引起的膝关节处的局部炎症的保护。
因此，乳杆菌属施用，特别是副干酪乳杆菌DSM 13434与植物乳杆菌DSM 15312和DSM15313的组合，对于预防和/或治疗哺乳动物的骨关节炎是有用的，特别是通过治疗和/或预防软骨损伤以及治疗和/或预防与骨关节炎相关的炎症，特别是局限于关节的炎症。
实验实例2–小鼠趋化因子分析
分析了来自实验实例1的小鼠血清中的若干细胞因子/趋化因子的释放。
材料和方法
使用密理博(Millipore)的
Figure BDA0003306108740000291
MAP小鼠细胞因子/趋化因子磁珠面板来评估来自实验实例1中的微生物组实验的三种干预的小鼠血清样品中的炎性细胞因子的存在：
第1组：“假手术FMT/甘油”(没有粪便微生物群移植并且仅施用媒剂[甘油]的小鼠)；
第2组：“FMT/甘油”(进行了粪便微生物群移植，然后施用媒剂[甘油]的小鼠)；
第3组：“FMT/益生菌”(进行了粪便微生物群移植，然后施用益生菌的小鼠)。
评估以下25种小鼠细胞因子：粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ(IFNγ)、白介素1α(IL-1α)、白介素1β(IL-1β)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素10(IL-10)、白介素12的亚基β(IL-12(p40))、白介素12异二聚体(IL12(p70))、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)、白介素17(IL-17)、干扰素γ诱导的蛋白10(IP-10)、角质细胞源性趋化因子(KC)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白1-β(MIP-1β)、巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)、RANTES和肿瘤坏死因子α(TNFα)。
统计方法
使用单向方差分析(ANOVA)评估各组之间的显著差异。将显著性水平设置为p<0.05。
根据D.B.Wilson,实际的元分析效果大小计算器[线上计算器]，使用“F-测试，3个或更多个组”测试“标准化平均差(d)”来计算效应大小，所述效应大小于2020年3月30日从https://campbellcollaboration.org/research-resources/effect-size-calculator.html检索到。
结果
所评估的25种小鼠细胞因子中有八种的浓度低于测试范围，并且因此未被分析：GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、IL12(p70)、TNFα。
其余17种小鼠细胞因子的结果示出于图9中。
通过益生菌施用降低KC
图9显示，与假手术对照小鼠相比，在所研究的17种小鼠细胞因子中，在具有重构微生物组和益生菌施用的小鼠中仅KC(角质细胞源性细胞因子或角质细胞化学吸引剂趋化因子，也称为CXCL1)减少(p＝0.03)。
独立效应大小分析显示，KC的科恩(Cohen)d值为-1.126(95％置信区间：-2.0531到-0.1988)。科恩d值大于±0.8被认为指示大的效应大小。因此，KC化学引诱剂在本实验中具有大的效应大小。
结论
益生菌治疗后角质细胞源性趋化因子(KC)的释放减少。
KC是来自CXC趋化因子家族的小细胞因子并且还被称为趋化因子(C-X-C基序)配体1，缩写为CXCL1，其在人中由基因Cxcl1编码。其由软骨细胞产生并且有助于骨关节炎的病理生理学。KC对机械、炎症和代谢应激是高度响应的(Chauffier等人,2012,《关节骨脊柱(Joint Bone Spine)》79(6):604-609)。KC是趋化因子之一，其通常在损伤后增加并且可能促成损伤后不适当的炎症周期的发展。
滑膜下炎症(图8)表示炎性细胞(嗜中性粒细胞、巨噬细胞和/或淋巴细胞)的浸润。由于KC是嗜中性粒细胞化学引诱剂，图8中滑膜下炎症的减少似乎与图9中所示的益生菌治疗的小鼠中的KC水平降低有关。

Claims (24)

1.一种用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用有效剂量的乳杆菌属(Lactobacillus)的至少一种益生菌菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其中对骨关节炎的所述治疗和/或预防是通过治疗和/或预防软骨损伤来进行的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中对骨关节炎的所述治疗和/或预防是通过治疗和/或预防关节处的骨损伤来进行的。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中对骨关节炎的所述治疗和/或预防是通过治疗和/或预防与骨关节炎相关的炎症，优选地通过治疗和/或预防局限于关节的炎症来进行的。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中乳杆菌属的所述至少一种益生菌菌株选自副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)和约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中乳杆菌属的所述至少一种益生菌菌株选自副干酪乳杆菌的至少一种益生菌菌株和/或植物乳杆菌的至少一种益生菌菌株。
8.根据权利要求7所述的方法，其中乳杆菌属的所述至少一种益生菌菌株选自副干酪乳杆菌DSM 13434(8700:2)和植物乳杆菌的至少一种益生菌菌株。
9.根据权利要求6到8中任一项所述的方法，其中植物乳杆菌的所述至少一种益生菌菌株选自植物乳杆菌DSM 6595(299)、植物乳杆菌DSM 9843
Figure FDA0003306108730000021
植物乳杆菌DSM 15312(HEAL 9)、植物乳杆菌DSM 15313(HEAL 19)、植物乳杆菌DSM 15316(HEAL 99)、植物乳杆菌DSM 32131(GOS42)、植物乳杆菌DSM 17852(LB3e)和植物乳杆菌DSM 17853(LB7c)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种益生菌菌株是副干酪乳杆菌DSM13434(8700:2)与植物乳杆菌DSM 15312(HEAL 9)和植物乳杆菌DSM 15313(HEAL 19)的组合。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述有效剂量的所述至少一种益生菌菌株是至少每天一次或至少每两天、三天、四天、五天、六天或七天或至少一周一次、两次、三次、四次、五次、六次或七次施用的。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述至少一种益生菌菌株的所述有效剂量为每剂量约106到约1014个菌落形成单位(CFU)，优选地每剂量约108到约1012个CFU或更优选地每剂量约109到约1011个CFU。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种益生菌菌株的所述有效剂量为每剂量约1010个CFU。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法，其中一个或多个有效剂量的所述至少一种益生菌菌株在一天内施用，并且其中所述至少一种益生菌菌株的所述日剂量为每天约106到约1014个CFU，优选地每天约108到约1012个CFU或更优选地每天约109到约1011个CFU。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一种益生菌菌株的所述日剂量为每天1010个CFU。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的供使用的方法，其中所述至少一种益生菌菌株以包括至少一种载体的组合物的形式施用，所述至少一种载体选自药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂、食品级载体、食品级赋形剂、稀释剂和食品。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述组合物以溶液、悬浮液、乳剂、片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、锭剂、口香糖或栓剂的形式提供。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述食品是基于谷物的产品、乳制品、果汁饮料或发酵食品。
19.根据权利要求16到18中任一项所述的方法，其中所述组合物补充有软骨保护剂，所述软骨保护剂包含但不限于硫酸软骨素、氨基葡萄糖、透明质酸。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的方法，其中对骨关节炎的所述治疗和/或预防是通过治疗和/或预防关节中，优选地局限于膝关节的滑膜下炎症来进行的。
21.一种乳杆菌属的至少一种益生菌菌株，其用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎。
22.一种组合物，其包括根据权利要求21所述的至少一种益生菌菌株和一种或多种载体，所述组合物用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎。
23.一种药物组合物，其包括根据权利要求21所述的至少一种益生菌菌株和一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述药物组合物用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎。
24.一种包括根据权利要求21所述的至少一种益生菌菌株的组合物或根据权利要求22或23所述的组合物或药物组合物用于治疗和/或预防哺乳动物的骨关节炎的用途。
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