BR112020026032A2 - composições probióticas e usos das mesmas - Google Patents

Abstract

A invenção refere-se a pelo menos uma cepa probiótica escolhida dentre Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434) e/ou pelo menos uma cepa probiótica de Lactobacillus plantarum, para o uso no tratamento e/ou na prevenção de perda óssea trabecular em um mamífero, preferencialmente em um mamífero não roedor; mais preferencialmente, em um humano; com máxima preferência, em uma mulher na perimenopausa, uma mulher pós-menopausa ou uma mulher seis anos ou menos após o início da menopausa.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para: “COMPOSIÇÕES PROBIÓTICAS E USOS DAS MESMAS”

CAMPO DA TÉCNICA DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a pelo menos uma cepa probiótica escolhida dentre Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434) e/ou pelo menos uma cepa probiótica de Lactobacillus plantarum caracterizada pelo fato de que é para o uso no tratamento e/ou na prevenção de perda óssea trabecular em um mamífero. Preferencialmente, o uso é para o tratamento de um mamífero não roedor; mais preferencialmente, de um ser humano e, com máxima preferência, de uma mulher na perimenopausa, pós-menopausa ou uma mulher seis anos ou menos após o início da menopausa.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O tecido ósseo é um tecido mineralizado de dois tipos, osso cortical (também conhecido como compacto) e osso trabecular (também conhecido como absorvente ou esponjoso).

[0003] O osso cortical é mais denso e mais forte do que o osso trabecular e forma a parte externa dura (córtex) dos ossos. Microscopicamente, o osso cortical, em humanos, é composto de ósteons, colunas formadas por anéis concêntricos de matriz calcificada chamados lamelas que envolvem um canal central (Haversiano) que contém os vasos sanguíneos, nervos e vasos linfáticos. O osso cortical, normalmente, tem uma superfície exterior de tecido conjuntivo do periósteo e uma superfície interior de tecido conjuntivo do endósteo que formam a fronteira entre o osso cortical e o trabecular.

[0004] O osso trabecular é o tecido interno do osso esquelético e é uma rede porosa de células abertas que compreende minúsculas unidades em forma de treliça (trabéculas). O osso trabecular tem uma razão área de superfície:volume mais alta do que o osso cortical, porque é menos denso, o que o torna mais macio e fraco, porém mais flexível. A maior área de superfície também o torna adequado para atividades metabólicas, como a troca de íons de cálcio. O osso trabecular é, normalmente, encontrado nas extremidades dos ossos longos, próximo às articulações e no interior das vértebras. Microscopicamente, a unidade anatômica e funcional primária do osso trabecular é a trabécula. Ao contrário dos círculos concêntricos dos ósteons, as trabéculas, normalmente, formam uma rede irregular de formações de osteoblastos em forma de haste, cobertos por endósteo, e os espaços entre são preenchidos com medula óssea e células-tronco hematopoiéticas. O osso trabecular é responsável por, aproximadamente, 20% da massa óssea total, mas tem quase dez vezes a área de superfície em comparação com o osso cortical.

[0005] Outros tipos de tecido encontrados nos ossos incluem medula óssea, endósteo, periósteo, nervos, vasos sanguíneos e cartilagem.

[0006] Existem cinco tipos de ossos no corpo humano (de um mamífero), caracterizados por seu formato: longo, curto, plano, irregular e sesamoide. 'Ossos longos', por exemplo, o fêmur e a maioria dos outros ossos dos membros, dos dedos das mãos e dos pés, normalmente têm um eixo (diáfise) produzido a partir, principalmente, do osso cortical que forma uma cavidade preenchida com quantidades menores de medula e uma cabeça arredondada (epífise) em cada extremidade do osso. Uma epífise, geralmente, compreende o osso trabecular envolto por camadas de osso cortical. 'Ossos curtos', por exemplo, os do pulso e do tornozelo, estão, aproximadamente, sob a forma de cubo e, normalmente, compreendem uma fina camada óssea cortical que envolve o interior do osso trabecular. 'Ossos planos', por exemplo, o esterno, costelas, quadris e a maioria dos ossos do crânio, são finos e, geralmente, curvos, com duas camadas paralelas de osso cortical que ensanduicham uma camada óssea trabecular. 'Ossos irregulares', por exemplo, vértebras, sacro, cóccix, temporal, esfenoide, etmoide, zigomático, maxila, mandíbula, palatino, concha nasal inferior e hioide, têm uma forma irregular e, geralmente, compreendem camadas finas de osso compacto em torno do interior do osso trabecular. Ossos sesamoides, por exemplo, patela e pisiforme, são ossos embutidos nos tendões.

[0007] O tecido ósseo (tecido do osso) tanto do osso cortical quanto do osso trabecular, normalmente, compreende um número relativamente pequeno de células presas em uma matriz resistente de fibras de colágeno (osseína) nas quais cristais de sal inorgânico (por exemplo, hidroxilapatita/hidroxiapatita de cálcio) aderem para fortalecer o osso. O restante da matriz é, normalmente, preenchido com substância fundamental - uma substância semelhante a um gel amorfo no espaço extracelular que contém todos os componentes da matriz extracelular, incluindo água, glicosaminoglicanos (GAGs; por exemplo, hialuronano), proteoglicanos aos quais os GAGs estão ligados (por exemplo, heparano sulfato e sulfato de queratina), glicoproteínas (por exemplo, osteonectina, osteopontina, sialoproteína óssea), osteocalcina e proteínas de conexão (por exemplo, vinculina, espectrina e actomisina). O osso é formado pelo endurecimento da matriz em torno das células aprisionadas, as quais, normalmente, mudam de osteoblastos para osteócitos inativos.

[0008] A osteoporose é uma doença em que os ossos se tornam frágeis e com maior probabilidade de fratura.

Normalmente, o osso perde a densidade, que mede a quantidade de cálcio e minerais no osso. A osteoporose é o tipo mais comum de doença óssea. Cerca de metade de todas as mulheres com mais de 50 anos terá uma fratura no quadril, punho ou vértebra (osso da coluna) durante a vida.

O osso é um tecido vivo. O osso existente é, constantemente, substituído por um osso novo. A osteoporose ocorre quando o corpo não consegue formar o osso novo em quantidade suficiente, quando muitos ossos existentes são reabsorvidos pelo corpo, ou ambos. O cálcio é um dos minerais importantes necessários para a formação dos ossos.

Se alguém não ingere cálcio e vitamina D suficientes, ou se o corpo não absorve cálcio suficiente de sua dieta, os ossos podem se tornar quebradiços e mais propensos a fraturas. Uma queda no estrogênio nas mulheres na época da menopausa e uma queda na testosterona nos homens é uma das principais causas de perda óssea.

[0009] As fraturas causadas pela osteoporose constituem um grande problema de saúde e resultam em um enorme fardo econômico para os sistemas de saúde. O risco ao longo da vida de qualquer fratura osteoporótica é alto no mundo ocidental (cerca de 50% para mulheres e 20% para homens), e as fraturas estão associadas à mortalidade e à morbidade significativas. O osso cortical constitui, aproximadamente, 80% do osso no corpo, e vários estudos mostraram que o osso cortical é o principal determinante da resistência óssea e, portanto, da suscetibilidade à fratura. A perda óssea após os 65 anos de idade é, principalmente, devido à perda do osso cortical e não do osso trabecular (Lancet, 2010, 15 de maio; 375(9727): 1.729 a 1.736). No entanto, o risco de fratura é maior em locais do esqueleto nos quais o osso trabecular é predominante, particularmente na cabeça do fêmur, nas vértebras e no rádio distal, cujos são os locais de fratura mais comuns (McDonnell et al. 2007, Ann Biomed Eng, 35(2): 170 a 189).

Além disso, os pacientes que já tiveram uma fratura vertebral têm maior probabilidade de sofrer mais fraturas em um ano e essa probabilidade aumenta com o número de fraturas sofridas (McDonnell et al 2007, supra).

[0010] O esqueleto é remodelado por osteoblastos de formação óssea (OBs) e osteoclastos de reabsorção óssea (OCLs). O fator estimulador de colônias de macrófagos (M- CSF) aumenta a proliferação e a sobrevivência das células precursoras de OCLs, bem como regula a expressão do ativador de receptor do fator nuclear-κB (RANK) em OCL.

Isso permite que o ligante RANK (RANKL) se ligue e inicie a cascata de sinalização que leva à formação de OCL. O efeito de RANKL pode ser inibido pela Osteoprotegerina (OPG), que é um receptor de proteção para RANKL.

[0011] A perda óssea osteoporótica ocorre devido a um desequilíbrio no processo de remodelação. Isso pode ocorrer por meio de uma combinação de aumento da atividade de reabsorção, com cavidades mais profundas sendo formadas pelos osteoclastos e insuficiência na formação de tecido ósseo de reposição pelos osteoblastos. A atividade de remodelação é baixa no esqueleto periférico e alta no esqueleto central, e isso aumenta o risco de fraturas devido à perda óssea nas vértebras (McDonnell et al 2007, supra).

[0012] A associação entre inflamação e perda óssea está bem estabelecida e, em doenças autoimunes, a reabsorção óssea osteoclástica é impulsionada por citocinas inflamatórias produzidas por células T ativadas. Além disso, vários estudos demonstram que a inflamação sistêmica de baixo grau, indicada por níveis séricos moderadamente elevados de proteína C reativa de alta sensibilidade (hsCRP), está associada à baixa BMD, à elevada reabsorção óssea e ao aumento do risco de fratura. A deficiência de estrogênio que ocorre após a menopausa resulta no aumento da formação e na sobrevivência prolongada dos osteoclastos.

Sugere-se que isso seja devido a uma série de fatores, incluindo a perda dos efeitos imunossupressores de estrogênio, resultando no aumento da produção de citocinas que promovem a osteoclastogênese e os efeitos diretos de estrogênio nos OCLs. De acordo com esses dados, o bloqueio das citocinas inflamatórias TNFα e IL-1 leva a uma diminuição dos marcadores de reabsorção óssea em mulheres na pós-menopausa.

[0013] Nos últimos anos, a importância da microbiota intestinal (GM) tanto para a saúde quanto para a doença tem sido intensamente estudada. A GM consiste em trilhões de bactérias que, coletivamente, contêm 150 vezes mais genes do que nosso genoma humano. É adquirido no nascimento e, embora seja uma entidade distinta, claramente coevoluiu com o genoma humano e pode ser considerada um órgão multicelular que se comunica e afeta seu hospedeiro de várias maneiras. A composição da GM é modulada por uma série de fatores ambientais, como dieta e tratamentos com antibióticos. Moléculas produzidas pelas bactérias intestinais podem ser benéficas e prejudiciais e são conhecidas por afetar as células endócrinas do intestino, o sistema nervoso entérico, a permeabilidade intestinal e o sistema imunológico. Foi postulado que a composição microbiana perturbada está envolvida em uma variedade de condições inflamatórias, dentro e fora do intestino, incluindo doença de Crohn, colite ulcerativa, artrite reumatoide, esclerose múltipla, diabetes, alergias alimentares, eczema e asma, bem como obesidade e a síndrome metabólica.

[0014] Bactérias probióticas são definidas como microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem um benefício à saúde do hospedeiro e acredita-se que as mesmas alteram a composição da microbiota intestinal.

[0015] O documento nº WO 2014/163568 divulga dados experimentais que relatam a administração da cepa probiótica Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434) e a combinação das cepas probióticas Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434), Lactobacillus plantarum HEAL 9 (DSM 15312) e Lactobacillus plantarum HEAL 19 (DSM 15313) a camundongos ovarioctomizados (ovx) como um modelo de osteoporose, particularmente osteoporose pós-menopausa.

Efeitos protetores significativos foram relatados no osso cortical em camundongos ovx, mas não no osso trabecular em camundongos ovx.

[0016] Assim, ainda existe uma necessidade na técnica de encontrar métodos preventivos e terapêuticos eficazes contra a perda óssea trabecular em um mamífero e, particularmente, em humanos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0017] Um primeiro aspecto da invenção fornece pelo menos uma cepa probiótica escolhida dentre Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434) e/ou pelo menos uma cepa probiótica de Lactobacillus plantarum caracterizada pelo fato de que é para o uso no tratamento e/ou na prevenção de perda óssea trabecular em um mamífero.

[0018] O uso, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser através do aumento da absorção de íons Ca2+ em um mamífero.

[0019] Por "uso no tratamento e/ou na prevenção", inclui-se o significado de um uso que dá origem a um efeito em um sujeito de prevenir, retardar, proteger contra, reduzir a gravidade de e/ou remover um ou mais sintomas e/ou outros marcadores associados a uma doença ou condição.

[0020] Por "tratar", "tratamento" ou "que trata", inclui-se o significado de que a condição ou o evento a ser tratado é melhorado, que tem sua gravidade reduzida, removido, bloqueado para que não ocorra mais, protegido contra reincidência, atrasado e/ou feito para cessar. Esse tratamento, geralmente, ocorre depois que o evento (ou o mesmo tipo de evento) ocorre ou após uma condição ter se manifestado. Também será observado que tais termos podem incluir o significado de que uma condição ou evento é mantido no estado atual sem piorar ou se desenvolver ainda mais.

[0021] Por “prevenir”, “prevenção” ou “que previne”, inclui-se o significado de que a condição ou o evento que está sendo prevenido é protegido, atrasado, reduzido (por exemplo, tem sua gravidade reduzida), bloqueado quanto à reincidência ou feito para cessar. Essa prevenção, normalmente, ocorre antes que o evento ocorra ou que a condição se manifeste, mas será observado que isso também pode significar a prevenção de novas ocorrências do mesmo tipo de evento. Também será observado que tais termos podem incluir o significado de que uma condição ou evento é mantido no estado atual sem piorar ou se desenvolver ainda mais.

[0022] Por exemplo, uma medida de perda óssea trabecular (por exemplo, teor mineral ósseo trabecular, densidade mineral óssea trabecular) após a administração de pelo menos uma cepa probiótica (ou de uma composição que compreende a pelo menos uma cepa probiótica), de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser reduzida em pelo menos 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30 %, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% em comparação com a não administração de pelo menos uma cepa probiótica, ou em comparação com a administração de uma composição correspondente sem a pelo menos uma cepa probiótica. No mínimo, uma região óssea trabecular deve ser medida no mamífero. Por exemplo, é preferencial que a perda óssea trabecular seja medida na coluna lombar. A perda óssea trabecular também pode ser medida na articulação do joelho, por exemplo, medindo-se o volume ósseo e/ou a espessura óssea trabecular epifisária (incluindo o osso subcondral), como o osso trabecular epifisário da tíbia ou fêmur na articulação do joelho (ver também, por exemplo,

Milz e Putz, 1994, Quantitative morphology of the subcondral plate of the tibial plateau, J Anat 185(Pt. 1): 103 a 110, cujos conteúdos estão incorporados ao presente documento em sua totalidade a título de referência).

[0023] Por “perda óssea trabecular”, inclui-se o significado de que o teor mineral ósseo e/ou a densidade mineral óssea do osso trabecular é reduzida ao longo do tempo.

[0024] Preferencialmente, a pelo menos uma cepa probiótica para o uso de acordo com o primeiro aspecto da invenção é eficaz para tratar e/ou prevenir a perda óssea trabecular na coluna lombar.

[0025] Preferencialmente, a pelo menos uma cepa probiótica para o uso de acordo com o primeiro aspecto da invenção é eficaz para tratar e/ou prevenir a perda óssea trabecular na articulação do joelho, particularmente um ou ambos os ossos trabeculares epifisários tibiais (osso trabecular na epífise proximal da tíbia) e o osso trabecular epifisário femoral (osso trabecular na epífise distal do fêmur, como parte de um ou ambos os côndilos femorais).

[0026] A parte superior da tíbia é chamada de tíbia proximal ou epífise tibial proximal. De acordo com McKinnis (2014, Fundamentals of Musculoskeletal Imaging, 4ª edição, FA Davis Company, Filadélfia; particularmente, na Figura

13-1, acessado em 16 de abril de 2019 em https://fadavispt.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1899&se ctionid=141191793), a tíbia proximal consiste em côndilos medial e lateral, que formam, superiormente, a superfície articular da tíbia ou o planalto tibial. Da mesma forma, a parte inferior do fêmur é chamada de fêmur distal ou epífise femoral distal. De acordo com McKinnis (2014, supra), o fêmur distal exibe côndilos medial e lateral (ver Figura 13-1 por McKinnis, supra).

[0027] Por “subcondral”, inclui-se o significado da camada óssea logo abaixo da cartilagem em uma articulação.

Assim, na articulação do joelho, o osso subcondral da tíbia proximal está logo abaixo (distal à) da cartilagem da articulação do joelho, e o osso subcondral do fêmur distal está logo "abaixo" (proximal à) cartilagem da articulação do joelho. O osso subcondral consiste em uma parte cortical (placas de osso subcondral) e uma parte trabecular (osso trabecular subcondral), por exemplo, ver a Figura 1 de Arijmand et al (2019, Sci Rep 8(1):11.478).

[0028] Por “epifisário”, inclui-se o significado da região do osso que compreende a epífise, incluindo o osso subcondral. Consequentemente, para os ossos da articulação do joelho, por exemplo, a tíbia, "osso epifisário" estão inclusas as regiões denominadas de subcondral e epifisária na Figura 1 de Arijmand et al, supra.

[0029] Por “teor mineral ósseo” (BMC), inclui-se o significado da quantidade de minerais ósseos (por exemplo, cálcio) no tecido ósseo. As medidas de BMC, geralmente, incluem g e g/cm. Preferencialmente, o BMC é medido em gramas (g).

[0030] Por “densidade mineral óssea” (BMD), inclui- se o significado da quantidade de minerais ósseos (por exemplo, cálcio) no tecido ósseo, expressa como densidade.

As medidas de BMD, normalmente, incluem massa de mineral por volume de osso (por exemplo, centímetro cúbico) ou, quando avaliada por imageamento clínico (densitometria), inclui densidade óptica por área (por exemplo, centímetro quadrado) da superfície óssea. Por exemplo, a BMD pode ser expressa em g/cm2 ou em g/cm3. Consequentemente, a BMD pode ser calculada a partir do BMC em g dividindo-se pela área de superfície do osso ou a partir do BMC em g/cm dividindo- se pela largura do osso na linha digitalizada. A BMD é, tipicamente, uma medida da resistência de um osso e a densidade mineral óssea reduzida pode aumentar a chance de fraturas, osteopenia e osteoporose.

[0031] O teor mineral ósseo e a densidade mineral óssea podem ser medidos por meio de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, BMC e BMD podem ser medidos por absortometria de raios X de energia dupla (DXA ou DEXA), absortometria de raios X duplo e laser (DXL),

tomografia computadorizada quantitativa (QCT), ultrassom quantitativo (QUS), absortometria de fóton único (SPA), absortometria de fóton duplo (DPA), radiogrametria digital de raios X (DXR) ou absortometria de raios X de energia única (SEXA). DXA é a técnica mais amplamente usada, mas QCT (ou microtomografia computadorizada de raios X [microCT] para pequenos animais) é preferencial, pois é capaz de medir o volume ósseo.

[0032] A perda óssea trabecular e/ou o teor mineral ósseo trabecular podem ser medidos por meio de qualquer método adequado conhecido na técnica para medir a BMD e/ou BMC em osso trabecular, incluindo aqueles listados anteriormente.

[0033] O uso, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode compreender o tratamento e/ou a prevenção de perda óssea trabecular associada à osteopenia.

[0034] A osteopenia é uma condição na qual a densidade mineral óssea é inferior ao normal. É considerado por muitos médicos um precursor da osteoporose. No entanto, nem todas as pessoas com diagnóstico de osteopenia desenvolverão osteoporose. Preferencialmente, a osteopenia é definida por ter um escore T de densidade mineral óssea (por exemplo, no quadril total e/ou na coluna, como na coluna lombar) de -1 > T > -2,5.

[0035] O escore T de densidade mineral óssea (ou

'escore T' como usado no presente documento), tipicamente, representa o número de desvios padrão acima ou abaixo da média para a densidade mineral óssea de um adulto saudável de referência de 30 anos de idade. Por exemplo, o adulto saudável de referência de 30 anos pode ser do mesmo sexo e etnia que o paciente ou pode ser uma mulher branca. Um escore T de -1 ou superior é indicativo de densidade óssea normal (saudável) e um escore T de -2,5 ou inferior é indicativo de osteoporose. Preferencialmente, a densidade mineral óssea e/ou o escore T de densidade mineral óssea são medidos na coluna lombar, mas também podem ser medidos em outras regiões do esqueleto, por exemplo, outra região espinhal, quadril total, colo do fêmur, articulação do joelho, osso trabecular epifisário tibial (incluindo osso subcondral), osso trabecular epifisário femoral (incluindo osso subcondral). Será observado que o escore T de densidade mineral óssea pode ser calculado usando-se uma medição de densidade mineral óssea feita por qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo os métodos descritos anteriormente. Preferencialmente, o escore T de densidade mineral óssea é calculado usando-se uma medição da densidade mineral óssea obtida por absortometria de raios X de energia dupla (DXA).

GRUPO DE PACIENTES

[0036] A pelo menos uma cepa probiótica, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, é adequada para ser usada em mamíferos. A pelo menos uma cepa probiótica, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser adequada para mamíferos roedores, por exemplo, camundongos, ratos, porquinhos-da-índia. Preferencialmente, a pelo menos uma cepa probiótica é adequada para ser usada por mamíferos não roedores, por exemplo, gatos, cães, cavalos, macacos.

[0037] Com máxima preferência, a pelo menos uma cepa probiótica é adequada para humanos (homens e/ou mulheres), incluindo idosos (como humanos com mais de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 anos), mulheres na pós-menopausa, mulheres na perimenopausa e mulheres na pré- menopausa, visto que estas são indivíduos em que a perda óssea trabecular e a perda do teor mineral ósseo trabecular são um problema (ou podem, tipicamente, se tornar um).

[0038] Por outro lado, pessoas saudáveis também podem se beneficiar da invenção, a fim de prevenir a perda óssea trabecular, o que pode levar à osteoporose.

[0039] Com máxima preferência, a pelo menos uma cepa probiótica é adequada para o uso por uma mulher na pós-menopausa, por exemplo, uma mulher com um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze anos desde o início da menopausa e, com máxima preferência, uma mulher seis anos ou menos após o início da menopausa.

[0040] Preferencialmente, a pelo menos uma cepa probiótica é adequada para o uso em uma mulher com mais de 45, 50, 55 ou 60 anos. Por exemplo, a pelo menos uma cepa probiótica pode ser adequada para o uso em uma mulher com idades entre 45 e 65, como entre 45 e 50, 50 e 55, 55 e 60, 60 e 65, 45 e 55, 50 e 60, 55 e 65, 45 e 60, 50 e 65 ou 45 e 65.

[0041] A menopausa é o período na vida da maioria das mulheres em que os períodos menstruais param permanentemente e elas não podem mais ter filhos. A menopausa, geralmente, ocorre entre 49 e 52 anos de idade.

Os profissionais médicos costumam definir que a menopausa ocorre no momento em que a mulher não teve sangramento vaginal por um ano. Consequentemente, a data da menopausa, em si, é, tipicamente, determinada retroativamente, após 12 meses depois do último aparecimento do sangue menstrual. No nível fisiológico, a menopausa ocorre devido a uma diminuição na produção dos hormônios estrogênio e progesterona pelos ovários. Consequentemente, a menopausa também pode ser definida por uma diminuição na produção desses hormônios pelos ovários, e o diagnóstico da menopausa pode ser confirmado por meio da medição dos níveis hormonais no sangue ou na urina. Nas pessoas que fizeram cirurgia para remover o útero, mas ainda têm ovários, a menopausa pode ser considerada como ocorrida no momento da cirurgia ou quando os níveis hormonais caíram.

Após a remoção do útero, os sintomas da menopausa, geralmente, ocorrem mais cedo.

[0042] O termo “pré-menopausa” inclui o significado dos anos anteriores ao último período menstrual, quando os níveis de hormônios reprodutivos estão se tornando mais variáveis e mais baixos, e os efeitos da abstinência hormonal estão presentes. A pré-menopausa, geralmente, começa antes que os ciclos mensais se tornem visivelmente irregulares. Uma “mulher na pré-menopausa” é uma mulher em seu período de pré-menopausa.

[0043] O termo "perimenopausa" (literalmente 'próximo à menopausa') refere-se aos anos de transição da menopausa e é, normalmente, um período antes e depois da data do episódio final do fluxo menstrual.

Consequentemente, uma “mulher na perimenopausa” é uma mulher em seu período de perimenopausa. Normalmente, a perimenopausa começa entre os 40 e 50 anos de idade (média de 47,5 anos) e pode durar de quatro a dez anos. Por exemplo, a perimenopausa pode durar de quatro a oito anos, começando com o tempo das mudanças na duração dos períodos e terminando um ano após o período menstrual final (The North American Menopause Society, https://web.archive.org/web/20130410111346/http://www.menop ause.org/for-women/menopauseflashes/menopause-101-a-primer- for-the-perimenopausal). Alternativamente, a perimenopausa pode durar de seis a dez anos, terminando 12 meses após o último período menstrual (Dr Jerilynn C. Prior, Centre for Menstrual Cycle and Ovulation Research, https://web.archive.org/web/20130225055347/http://cemcor.ca /help_yourself/perimenopause). Os níveis de estrogênio são, em média, cerca de 20 a 30% mais altos durante a perimenopausa do que durante a pré-menopausa, frequentemente com grandes oscilações. Essas oscilações causam muitas das mudanças físicas durante a perimenopausa, assim como a menopausa, incluindo ondas de calor, suores noturnos, dificuldade para dormir, secura ou atrofia vaginal, incontinência, osteoporose e doenças cardíacas.

[0044] O termo "pós-menopausa", geralmente, descreve mulheres que não tiveram nenhum fluxo menstrual por um período mínimo de 12 meses (confirmando, assim, que os ciclos menstruais cessaram), presumindo que elas tenham útero e não estejam grávidas ou amamentando. Em mulheres sem um útero, a menopausa ou a pós-menopausa pode ser identificada por meio de um exame de sangue que mostra um nível muito alto de hormônio folículo estimulante (FSH).

Assim, a pós-menopausa também pode ser definida como o período após o ponto em que os ovários de uma mulher se tornam inativos. Como os níveis de hormônio reprodutivo da mulher continuam a cair e a oscilar por algum tempo na pós- menopausa, os efeitos da suspensão do hormônio, como ondas de calor, podem levar vários anos para desaparecer.

[0045] Alternativamente, a pelo menos uma cepa probiótica pode ser adequada para o uso por homens, como um homem com idade maior do que 45, 50, 55 ou 60 anos, ou um homem com idades entre 45 e 65, como entre 45 e 50, 50 e 55, 55 e 60, 60 e 65, 45 e 55, 50 e 60, 55 e 65, 45 e 60, 50 e 65 ou 45 e 65.

[0046] A pelo menos uma cepa probiótica, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, também pode ser adequada para o uso em um mamífero com osteopenia, como um humano com um escore T de densidade mineral óssea de -1 > T > -2,5, preferencialmente quando o escore T é medido na coluna lombar.

CEPAS PROBIÓTICAS

[0047] Bactérias probióticas são definidas como “microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem um benefício à saúde do hospedeiro” (Hill et al, Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2014, 11(8):506 a 514). Bactérias dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium são as bactérias mais frequentemente utilizadas em produtos probióticos. Essas bactérias, geralmente, são seguras, assim como os produtos probióticos baseados nesses organismos. Para que uma bactéria atenda à definição de probiótico, ela, normalmente, deve ser capaz de sobreviver e colonizar os intestinos, sobreviver aos processos de produção e de armazenamento e apresentar evidências de que tem efeitos positivos na saúde do consumidor.

[0048] Por “pelo menos uma cepa probiótica”, inclui-se o significado de uma ou mais cepas de bactérias que, quando administradas em quantidades adequadas, conferem um benefício à saúde do hospedeiro. Normalmente, a administração da dita pelo menos uma cepa probiótica alterará a composição da microbiota intestinal.

[0049] A "pelo menos uma cepa probiótica", de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434).

[0050] Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, foi depositado em 6 de abril de 2000 em DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Brunsvique, Alemanha, por Probi AB.

[0051] A "pelo menos uma cepa probiótica", de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser pelo menos uma cepa probiótica de Lactobacillus plantarum.

[0052] Preferencialmente, a pelo menos uma cepa probiótica de Lactobacillus plantarum é escolhida a partir de Lactobacillus plantarum 299 (DSM 6595), Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843), Lactobacillus plantarum HEAL 9 (DSM 15312), Lactobacillus plantarum HEAL 19 (DSM 15313),

Lactobacillus plantarum HEAL 99 (DSM 15316), Lactobacillus plantarum GOS42 (DSM 32131), Lactobacillus plantarum DSM 17852 (LB3e) e Lactobacillus plantarum DSM 17853 (LB7c).

[0053] Lactobacillus plantarum 299 (DSM 6595) foi depositado em 2 de julho de 1991 em DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH, Mascheroder Weg 1 B, D-3300 Brunsvique, Alemanha, em nome da Probi (isto é, Probi AB).

[0054] Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843) foi depositado em 16 de março de 1995 em DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Brunsvique, Alemanha, por Probi AB.

[0055] Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313 e Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, foram depositados em 27 de novembro de 2002 em DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Brunsvique, Alemanha, por Probi AB.

[0056] Lactobacillus plantarum GOS42 (DSM 32131) foi depositado em 2 de setembro de 2015 em Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstr. 7 B, D-38124 Brunsvique, Alemanha por Probi AB.

[0057] Lactobacillus plantarum DSM 17852 (LB3e) e Lactobacillus plantarum DSM 17853 (LB7c) foram depositados em 6 de janeiro de 2006 em DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Brunsvique, Alemanha, por Probac AB. Todos os direitos e deveres relacionados aos depósitos de microrganismos DSM 17852 e DSM 17853 foram, subsequentemente, concedidos e aceitos pela Probi AB, cuja, agora, é a depositante das cepas DSM 17852 e DSM 17853.

[0058] Em uma modalidade de acordo com o primeiro aspecto da invenção, Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434) está destinado ao uso em combinação com pelo menos uma cepa probiótica de Lactobacillus plantarum. Por exemplo, Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434) pode ser usado em combinação com uma, duas ou mais cepas probióticas de Lactobacillus plantarum.

[0059] Na modalidade mais preferencial de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a pelo menos uma cepa probiótica é Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434) que está em combinação com Lactobacillus plantarum HEAL 9 (DSM 15312) e Lactobacillus plantarum HEAL 19 (DSM 15313).

[0060] As cepas probióticas, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, podem ser viáveis, inativadas ou mortas. Preferencialmente, as cepas probióticas são viáveis. Por exemplo, preferencialmente as cepas probióticas são liofilizadas.

COMPOSIÇÕES

[0061] A pelo menos uma cepa probiótica, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode estar presente em uma composição que compreende pelo menos um carreador adequado. Por exemplo, o carreador pode ser um diluente ou excipiente. A composição pode ser uma formulação sólida ou líquida e, consequentemente, pelo menos um carreador pode ser um sólido ou um líquido, ou pode compreender tanto o pelo menos um componente sólido quanto o pelo menos um componente líquido.

[0062] Exemplos de um carreador líquido adequado incluem água, leite, água de coco, sucos e bebidas de frutas, substitutos do leite (bebida de soja, bebida de aveia, nozes e outras bebidas à base de plantas), bebidas gaseificadas, glicerina, propilenoglicol e outros solventes aquosos.

[0063] Exemplos de um carreador ou excipiente sólido adequado incluem maltodextrina, inulina, uma celulose, como celulose microcristalina (MCC), hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) ou hidroxipropilcelulose (HPC), álcoois de açúcar, polietilenoglicóis de alto peso molecular, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina, desintegrantes, como amido (preferencialmente milho, batata, tapioca ou outro amido vegetal), amido glicolato de sódio, croscarmelose de sódio e certos complexos de silicato e ligantes de granulação como polivinilpirrolidona, sacarose, gelatina e acácia. Além do mais, os agentes lubrificantes, como estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talco podem ser incluídos.

[0064] Em uma modalidade de acordo com o primeiro aspecto da invenção, o carreador pode ser selecionado a partir de um carreador farmaceuticamente aceitável, um excipiente farmaceuticamente aceitável, um carreador de qualidade alimentar, um excipiente de qualidade alimentar, um diluente e um alimento.

[0065] Exemplos de carreadores, excipientes e diluentes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem os que são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica, por exemplo os indicados em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edição, vol. 1 & 2 (ed. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company).

[0066] Por “qualidade alimentar” inclui-se carreadores, ingredientes e excipientes que atendem aos critérios 'geralmente reconhecidos como seguros' (GRAS).

[0067] Por “alimento”, inclui-se qualquer substância para o consumo com a finalidade de fornecer benefício nutricional ou suporte para um organismo.

Exemplos de carreadores de alimentos adequados incluem bebidas (por exemplo, sucos), produtos lácteos (por exemplo, iogurtes, queijo, sorvetes, fórmulas infantis e pastas como margarina), produtos alternativos lácteos (por exemplo, soja, nozes ou outras bebidas à base de plantas, iogurtes e pastas), produtos à base de cereais (por exemplo, pães, biscoitos, cereais matinais, massas e barras de alimentos secos, como barras saudáveis) e comida para bebês (por exemplo, purê de frutas e/ou vegetais).

[0068] A composição, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser uma composição não fermentada seca, uma composição fermentada ou uma composição fermentada seca. A fermentação, neste contexto, inclui, particularmente, a fermentação de ácido láctico por bactérias lácticas em condições anaeróbias. No caso de uma composição não fermentada seca, substancialmente nenhuma fermentação ocorre antes da ingestão por um sujeito e, portanto, a fermentação só ocorre no trato gastrointestinal após a ingestão da composição por um sujeito.

[0069] Consequentemente, em algumas modalidades de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a composição está sob a forma de um alimento, sendo que o alimento é um produto à base de cereais, um produto lácteo, uma bebida do tipo suco ou um alimento fermentado.

[0070] Exemplos de alimentos fermentados incluem produtos lácteos fermentados (como iogurte, kefir ou lassi), alternativas ao leite fermentado livre de lácteo (como kefir de leite de coco), produtos à base de cereais fermentados (como aveias, mingau, milho, sorgo, trigo), vegetais fermentados (como chucrute, kimchi ou picles), soja ou legumes fermentados (como natto ou tempeh) e chá fermentado (como kombucha).

[0071] Em algumas modalidades de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a pelo menos uma cepa probiótica está presente em uma composição que não ocorre naturalmente, por exemplo, a composição compreende mais do que a cepa probiótica (ou cepas probióticas) e água.

[0072] Em uso, a pelo menos uma cepa probiótica ou a composição que compreende a pelo menos uma cepa probiótica, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser misturada com um carreador líquido ou sólido antes da administração a um mamífero. Por exemplo, um sujeito pode misturar a pelo menos uma cepa probiótica ou a composição da mesma com um carreador que compreende um ou mais líquidos escolhidos dentre água, leite, água de coco, sucos e bebidas de frutas, substitutos do leite (bebida de soja, bebida de aveia, noz e outras bebidas à base de plantas), bebidas gasosas ou algum outro solvente ou bebida aquosa antes da ingestão. Da mesma forma, a pelo menos uma cepa probiótica ou a composição da mesma pode ser misturada com um carreador que consiste em um ou mais alimentos.

Carreadores de alimentos adequados incluem carreador de mingau, carreador de cevada, produtos lácteos fermentados ou não fermentados, como iogurtes, sorvetes, milkshakes, sucos de frutas, bebidas, sopas, pães, biscoitos, massas, cereais matinais, barras de alimentos secos, incluindo barras saudáveis, alimentos à base de plantas, como produtos de soja, pastas, comida para bebês, nutrição infantil, fórmulas infantis, substitutos do leite materno desde o nascimento.

[0073] Preferencialmente, a formulação é uma dosagem unitária que contém uma dose ou unidade diária, uma subdose diária ou uma fração apropriada da mesma da composição que compreende as cepas probióticas.

[0074] A composição, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser um suplemento dietético. Por “suplemento dietético”, inclui-se o significado de um produto manufaturado destinado a suplementar a dieta quando tomado por via oral, por exemplo, como uma pílula, cápsula, comprimido ou líquido. Os suplementos dietéticos podem conter substâncias que são essenciais à vida e/ou aquelas que não foram confirmadas como essenciais à vida, mas podem ter um efeito biológico benéfico. Quando a composição, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, está sob a forma de um suplemento dietético, o carreador (ou carreadores) a ser adicionado inclui aqueles bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, aqueles dados em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edição, vol. 1 e 2 (ed. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company). Quaisquer outros ingredientes que são, normalmente, usados em suplementos dietéticos são conhecidos por uma pessoa versada na técnica e também podem ser adicionados, convencionalmente, em conjunto com pelo menos uma cepa probiótica.

[0075] A composição, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser fornecida sob a forma de uma solução, suspensão, emulsão, comprimido, grânulo, pó, cápsula, pastilha, goma de mascar ou supositório.

[0076] Por exemplo, em uma modalidade preferencial, a composição, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, é um suplemento dietético que está sob a forma de uma cápsula que compreende Lactobacillus liofilizada, como um suplemento dietético sob a forma de uma cápsula que compreende 1010 CFU de Lactobacillus liofilizados.

[0077] Em uma modalidade de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a pelo menos uma cepa probiótica está presente (por exemplo, em uma composição) em uma quantidade de cerca de 1x106 a cerca de 1x1014 CFU/dose; preferencialmente, de cerca de 1x108 a cerca de 1x1012 CFU/dose; mais preferencialmente, de cerca de 1x109 CFU a cerca de 1x1011 CFU/dose e, com máxima preferência, de cerca de 1x1010 CFU/dose. Se pelo menos uma cepa probiótica consistir em mais de uma cepa probiótica, tais quantidades representam o total de CFU/dose da combinação de cepas probióticas. Por exemplo, a pelo menos uma cepa probiótica pode estar presente em uma quantidade de cerca de 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012 ou cerca de 1x1013 CFU/dose. A pelo menos uma cepa probiótica pode estar presente em uma quantidade de cerca de 1x1014, 1x1013, 1x1012, 1x1011, 1x1010, 1x109, 1x108 ou cerca de 1x107 CFU/dose. A pelo menos uma cepa probiótica, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, também pode ser usada sozinha em água ou qualquer outro veículo aquoso no qual a pelo menos uma cepa probiótica é adicionada ou misturada antes da ingestão.

[0078] Em uma modalidade de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a composição é suplementada com vitamina D. Por exemplo, a vitamina D pode estar sob a forma de vitamina D3 colecalciferol ou vitamina D2 ergocalciferol. Preferencialmente, a vitamina D está sob a forma de vitamina D3 colecalciferol. A ingestão diária recomendada (RDI) de vitamina D é de 400 unidades internacionais (IU) (aproximadamente 10 µg) para crianças de até 12 meses, 600 IU (aproximadamente 15 µg) para idades de 1 a 70 anos e 800 IU (aproximadamente 20 µg) para pessoas com mais de 70 anos (https://ods.od.nih.gov/factsheets/VitaminD- HealthProfessional/), mas algumas agências de saúde recomendam 10 µg (aproximadamente 400 IU) por dia ou 15 µg (aproximadamente 600 IU) por dia. A quantidade de vitamina D com a qual a composição pode ser suplementada pode ser, por exemplo, de até 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 800 IU, ou superior, ou de até 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5 ou 20 µg ou superior.

[0079] Em uma modalidade de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a composição é suplementada com Ca2+ sob a forma de, por exemplo, um sal, por exemplo, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, sais de cálcio de ácido cítrico, gluconato de cálcio, glicerofosfato de cálcio, lactato de cálcio, óxido de cálcio, sulfato de cálcio. A ingestão diária recomendada (RDI) de Ca2+ é de 800 mg. A quantidade de Ca2+ com a qual a composição pode ser suplementada pode ser, por exemplo, de até 320 mg, 300 mg, 250 mg, 200 mg, 180 mg, 160 mg, 140 mg, 120 mg, 100 mg, 80 mg, 60 mg, 50 mg, 40 mg, 30 mg, 20 mg ou até 10 mg.

[0080] A composição, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser administrada oralmente, bucalmente ou sublingualmente sob a forma de comprimidos, cápsulas, pós, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentes saborizantes ou corantes, para aplicações de liberação imediata, retardada ou controlada.

A composição pode ser administrada sob a forma de uma composição em pó como uma composição microbiana de fusão rápida, por exemplo aquelas descritas no documento nº WO 2017/060477 ou no Pedido de Patente por Probi nº UK

1708932.7 ou na publicação por Probi nº WO 2018/224509 relacionada à tecnologia Probi® Fast Melt, cujos conteúdos estão incorporados ao presente documento em sua totalidade a título de referência. Quando o pó não tem uma composição microbiana de fusão rápida, o mesmo pode ser adequado para ser adicionado a um alimento (por exemplo, iogurte) ou bebida (por exemplo, água ou leite) antes da ingestão.

[0081] Quando a composição está sob a forma de um pó, ela normalmente seria preenchida em um recipiente vedado, que fornece uma barreira de oxigênio e umidade a fim de proteger e manter a viabilidade das bactérias probióticas na composição. Consequentemente, quando a composição está sob a forma de um pó, preferencialmente a composição é embalada em bastões de folha de alumínio vedados, em que cada bastão compreende uma dose da composição, isto é, uma dose da bactéria probiótica.

Exemplos não limitativos de recipientes adequados incluem um bastão, saco, bolsa ou cápsula. Em uma modalidade preferencial, o recipiente é uma folha de alumínio ou um bastão de polietileno, que é, tipicamente, vedado por soldagem. O bastão está, normalmente, configurado para uma abertura fácil. O bastão pode ter um entalhe para rasgo.

[0082] A composição, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser formulada como uma forma de dosagem sólida de liberação controlada, por exemplo, qualquer uma das descritas no documento nº WO 03/026687 e nas Patentes nºs US 8.007.777 e 8.540.980, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência. A composição pode ser formulada como uma forma de dosagem em camadas, por exemplo, a tecnologia Probi’s BIO-tract®, incluindo qualquer uma das formas de dosagem em camadas descritas no documento nº WO 2016/003870, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0083] Um comprimido pode ser feito por meio de compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes-acessórios. Os comprimidos podem ser preparados comprimindo-se em uma máquina adequada a pelo menos uma cepa probiótica (por exemplo, liofilizada) sob uma forma de fluxo livre, como um pó ou grânulos, opcionalmente misturado com um ligante (por exemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulose), lubrificante, diluente inerte, conservante, desintegrante (por exemplo, glicolato de amido sódico, povidona reticulada, carboximetilcelulose sódica reticulada), agente tensoativo ou dispersante. Os comprimidos moldados podem ser feitos moldando-se em uma máquina adequada uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte.

Os comprimidos podem ser, opcionalmente, revestidos ou marcados e podem ser formulados de modo a fornecer a liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo nos mesmos com o uso de, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose em proporções variáveis para fornecer o perfil de liberação desejado.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0084] Um segundo aspecto da invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende pelo menos uma cepa probiótica, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, para o uso no tratamento e/ou na prevenção de perda óssea trabecular, em um mamífero, preferencialmente um mamífero não roedor; mais preferencialmente, em um humano; com máxima preferência em uma mulher na pós-menopausa.

[0085] A composição farmacêutica, de acordo com o segundo aspecto da invenção, pode ser uma composição, conforme descrito anteriormente referente ao primeiro aspecto da invenção. O termo "farmaceuticamente aceitável" inclui que o um ou mais excipientes não devem ser deletérios para os receptores dos mesmos e devem ser compatíveis com a pelo menos uma cepa probiótica de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Exemplos de tais excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos anteriormente no que diz respeito ao primeiro aspecto da invenção, por exemplo conforme descrito em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª ed., vol. 1 e 2 (ed. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company).

[0086] Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser formulada como uma forma de dosagem sólida de liberação controlada, por exemplo, qualquer uma das descritas no documento nº WO 03/026687 e nas Patentes Nºs US 8.007.777 e

8.540.980, ou a composição farmacêutica pode ser formulada como uma forma de dosagem em camadas, por exemplo, qualquer uma das descritas no documento nº WO 2016/003870.

[0087] O um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser água ou solução salina que serão estéreis e apirogênicos.

[0088] Preferencialmente, a composição farmacêutica, de acordo com o segundo aspecto da invenção, pode ser administrada por meio de qualquer método convencional que inclui alimentação oral e por tubo. A administração pode consistir em uma única dose ou em uma pluralidade de doses durante um período de tempo.

MÉTODOS DE TRATAMENTO

[0089] Um terceiro aspecto da invenção fornece um método para tratar e/ou prevenir a perda óssea trabecular em um mamífero que compreende a administração a um mamífero com necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma cepa probiótica de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou a composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção.

[0090] Em particular, os métodos, de acordo com o terceiro aspecto da invenção, incluem aqueles em que a prevenção de perda óssea trabecular se dá através da redução da perda óssea trabecular em comparação com a não administração das ditas cepas probióticas.

[0091] O mamífero, no qual os métodos de acordo com o terceiro aspecto da invenção são realizados, pode ser qualquer mamífero dado anteriormente em relação ao primeiro aspecto da invenção. Por exemplo, o mamífero pode ser um homem. O mamífero pode ser uma mulher, como uma mulher na perimenopausa ou uma mulher na pó-menopausa.

Preferencialmente, o mamífero é uma mulher dentro de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze anos desde o início da menopausa e, com máxima preferência, uma mulher seis anos ou menos após o início da menopausa. Consequentemente, em uma modalidade dos métodos de acordo com o terceiro aspecto da invenção, o tratamento começa seis anos ou menos após o início da menopausa.

[0092] A administração, de acordo com os métodos do terceiro aspecto da invenção, pode incluir a administração oral, bucal ou sublingual como descrito anteriormente em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[0093] A administração, de acordo com os métodos do terceiro aspecto da invenção, pode incluir a administração a cada um, dois, três, quatro, cinco, seis ou sete dias, ou pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes na semana. Preferencialmente, a administração ocorre uma vez ao dia.

[0094] A administração, de acordo com os métodos do terceiro aspecto da invenção, pode incluir a administração que é repetida por até um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias, por até uma, duas, três, quatro ou cinco semanas, por até um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze meses, ou por mais de um, dois ou três anos ou mais. Preferencialmente, a administração é repetida por pelo menos 7 dias, como por pelo menos uma semana, duas semanas, três semanas; mais preferencialmente, por pelo menos quatro semanas, um mês, dois meses ou três meses e ainda mais preferencialmente, por pelo menos seis meses, nove meses ou um ano.

[0095] A administração, de acordo com os métodos do terceiro aspecto da invenção, é preferencialmente de uma dosagem unitária de cerca de 1x106 a cerca de 1x1014 CFU/dose unitária; preferencialmente de cerca de 1x108 a cerca de 1x1012 CFU/dose unitária; mais preferencialmente,

de cerca de 1x109 a cerca de 1x1011 CFU/dose unitária e, com máxima preferência, de cerca de 1x1010 CFU/dose unitária de acordo com o primeiro aspecto da invenção. A administração, de acordo com os métodos do terceiro aspecto da invenção, resulta preferencialmente em uma dose eficaz de cerca de 1x106 a cerca de 1x1014 CFU/dose unitária; preferencialmente de cerca de 1x108 a cerca de 1x1012 CFU/dose unitária; mais preferencialmente, de cerca de 1x109 a cerca de 1x1011 CFU/dose unitária e, com a máxima preferência, de cerca de 1x1010 CFU/dose unitária. Preferencialmente, a cada sujeito é administrada uma dose unitária por dia. Consequentemente, a administração, de acordo com os métodos do terceiro aspecto da invenção, resulta preferencialmente em uma dose diária de cerca de 1x106 a cerca de 1x1014 CFU/dia; preferencialmente de cerca de 1x108 a cerca de 1x1012 CFU/dia; mais preferencialmente, de cerca de 1x109 a cerca de 1x1011 CFU/dia e, com a máxima preferência, de cerca de 1x1010 CFU/dia.

[0096] Será observado que uma dose diária preferencial também pode ser alcançada pela administração de mais de uma subdose, por exemplo, por meio de uma administração duas vezes ao dia de uma dose unitária que compreende metade da dose diária preferencial.

Consequentemente, os intervalos preferenciais para a dose eficaz também podem representar a dosagem diária preferencial a ser alcançada em qualquer número de doses unitárias que seja prático.

[0097] O sujeito pode ser instruído a consumir a quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma cepa probiótica de acordo com o primeiro aspecto da invenção, ou a composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção, em combinação com água, outro solvente aquoso ou um produto alimentar, por exemplo, iogurte.

USO NO TRATAMENTO E/OU NA PREVENÇÃO

[0098] Um quarto aspecto da invenção fornece o uso de uma composição que compreende pelo menos uma cepa probiótica de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou a composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção, no tratamento e/ou na prevenção de perda óssea trabecular em um mamífero.

[0099] A listagem ou a discussão de um documento aparentemente publicado anteriormente neste relatório descritivo não deve ser necessariamente interpretada como um reconhecimento de que o documento faz parte do estado da técnica ou de que é de conhecimento geral comum.

[0100] A invenção será, agora, descrita em mais detalhes com referência aos seguintes Exemplos e Figuras.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0101] A Figura 1 divulga a mudança relativa

(mudança percentual da linha de base) na densidade mineral óssea (BMD) na coluna lombar após a intervenção por 12 meses com o produto probiótico ou placebo. *** representa uma mudança dentro do grupo de p <0,001. O produto probiótico reduz, significativamente, a perda de densidade mineral óssea na coluna lombar em comparação com o placebo.

[0102] A Figura 2 divulga a mudança relativa (mudança percentual da linha de base) no teor mineral ósseo (BMC) na coluna lombar após a intervenção por 12 meses com o produto probiótico ou placebo. * representa uma mudança dentro do grupo de p <0,05. O produto probiótico reduz, significativamente, a perda do teor mineral ósseo na coluna lombar em comparação com o placebo.

[0103] A Figura 3 divulga a mudança relativa (mudança percentual da linha de base) na densidade mineral óssea (BMD) na coluna lombar após a intervenção por 12 meses com o produto probiótico ou placebo, no subgrupo de participantes com osteopenia na linha de base. * representa uma mudança dentro do grupo de p <0,05. O produto probiótico reduz, significativamente, a perda de densidade mineral óssea na coluna lombar em comparação com o placebo no subgrupo de participantes com osteopenia na linha de base.

[0104] A Figura 4 divulga a mudança relativa (mudança percentual da linha de base) na densidade mineral óssea (BMD) na coluna lombar após a intervenção por 12 meses com o produto probiótico ou placebo, no subgrupo de participantes saudáveis com escore T normal (T ≥ -1 no quadril e na coluna lombar total) na linha de base. * representa uma mudança dentro do grupo de p <0,05. A densidade mineral óssea na coluna lombar foi, significativamente, reduzida com o placebo, mas não com o produto probiótico.

[0105] A Figura 5 divulga a mudança relativa (mudança percentual da linha de base) na densidade mineral óssea (BMD) na coluna lombar após a intervenção por 12 meses com o produto probiótico ou placebo, no subgrupo de participantes que estão a menos de 6 anos do início da menopausa na linha de base. *** representa uma mudança dentro do grupo de p <0,001. O produto probiótico reduz, significativamente, a perda de densidade mineral óssea na coluna lombar em comparação com o placebo no subgrupo de participantes com menos de 6 anos desde o início da menopausa na linha de base.

[0106] A Figura 6 divulga a mudança relativa (mudança percentual da linha de base) na densidade mineral óssea (BMD) na coluna lombar após a intervenção por 12 meses com o produto probiótico ou placebo, estratificado em relação ao tempo do começo da menopausa. Preto * representa uma mudança dentro do grupo de p <0,05; amarelo *

representa uma diferença entre os grupos de p <0,05; vermelho * representa uma diferença entre os grupos de p=0,055.

[0107] A Figura 7 divulga o diagrama do plano do projeto para o Exemplo Experimental 2.

[0108] A Figura 8 divulga o efeito dos probióticos no osso trabecular epifisário tibial (osso trabecular na epífise proximal da tíbia). (A) Volume ósseo trabecular/volume total (BV/TV) das articulações do joelho de camundongos machos, conforme avaliado por microCT da epífise tibial. (B) Espessura trabecular (Tb.Th); (C) Separação trabecular (Tb.Sp); (D) Número trabecular (Tb.N); e (E) fator de padrão trabecular (Tb.Pf) do mesmo experimento. Os valores são a média ± SEM de 11 a 13 camundongos por grupo. Diferenças significativas entre os grupos indicadas por * = p <0,05.

[0109] A Figura 9 divulga o efeito dos probióticos no osso trabecular epifisário femoral (osso trabecular na epífise distal do fêmur). (A) Volume ósseo trabecular/volume total (BV/TV) de articulações do joelho operadas e não operadas por DMM de camundongos machos, conforme avaliado por microCT da epífise femoral. (B) Espessura trabecular (Tb.Th); (C) Separação trabecular (Tb.Sp); (D) Número trabecular (Tb.N); e (E) fator de padrão trabecular (Tb.Pf) do mesmo experimento. Os valores são a média ± SEM de 10 a 13 camundongos por grupo.

Diferenças significativas entre os grupos indicadas por * = p <0,05.

FORMAS DE DOSAGEM EXEMPLIFICATIVAS

[0110] Além das formulações referenciadas anteriormente (e incorporadas ao presente documento a título de referência), os seguintes exemplos ilustram formulações farmacêuticas de acordo com a invenção.

EXEMPLO A: COMPRIMIDO

[0111] Cepa probiótica (ou cepas probióticas) 1x109 CFU ou preferencialmente 1x1010 CFU

[0112] Lactose 200 mg

[0113] Amido 50 mg

[0114] Polivinilpirrolidona 5 mg

[0115] Estearato de magnésio 4 mg

[0116] Os comprimidos são preparados a partir dos ingredientes supracitados por granulação a úmido seguida por compressão.

EXEMPLO B: FORMULAÇÕES DE COMPRIMIDOS

[0117] As seguintes formulações A e B são preparadas por granulação a úmido dos ingredientes com uma solução de povidona, seguida pela adição de estearato de magnésio e compressão.

FORMULAÇÃO A

[0118] (a) Cepa probiótica (ou cepas probióticas)

1x109 CFU* 1x109 CFU*

[0119] (b) Lactose B.P. 210 mg 26 mg

[0120] (c) Povidona B.P. 15 mg 9 mg

[0121] (d) Glicolato de amido de sódico 20 mg 12 mg

[0122] (e) Estearato de magnésio 5 mg 3 mg

[0123] (* = ou preferencialmente 1x1010 CFU)

FORMULAÇÃO B

[0124] (a) Cepa probiótica (ou cepas probióticas) 1x109 CFU* 1x109 CFU*

[0125] (b) Lactose 150 mg -

[0126] (c) Avicel PH 101® 60 mg 26 mg

[0127] (d) Povidona B.P. 15 mg 9 mg

[0128] (e) Glicolato de amido sódico 20 mg 12 mg

[0129] (f) Estearato de magnésio 5 mg 3 mg

[0130] (* = ou preferencialmente 1x1010 CFU)

FORMULAÇÃO C

[0131] Cepa probiótica (ou cepas probióticas) 1x109 CFU ou preferencialmente 1x1010 CFU

[0132] Lactose 200 mg

[0133] Amido 50 mg

[0134] Povidona 5 mg

[0135] Estearato de magnésio 4 mg

[0136] As seguintes formulações, D e E, são preparadas por compressão direta dos ingredientes mesclados. A lactose usada na formulação E é do tipo de compressão direcional.

FORMULAÇÃO D

[0137] Cepa probiótica (ou cepas probióticas) 1x109 CFU ou preferencialmente 1x1010 CFU

[0138] Amido pré-gelatinizado NF15 150 mg

FORMULAÇÃO E

[0139] Cepa probiótica (ou cepas probióticas) 1x109 CFU ou preferencialmente 1x1010 CFU

[0140] Lactose 150 mg

[0141] Avicel® 100 mg FORMULAÇÃO F (FORMULAÇÃO DE LIBERAÇÃO CONTROLADA)

[0142] A formulação é preparada por granulação a úmido dos ingredientes (a seguir) com uma solução de povidona seguida pela adição de estearato de magnésio e de compressão.

[0143] (a) Cepa probiótica (ou cepas probióticas) 1x109 CFU ou preferencialmente 1x1010 CFU

[0144] (b) Hidroxipropilmetilcelulose 112 mg

[0145] (Methocel K4M Premium)®

[0146] (c) Lactose B.P. 53 mg

[0147] (d) Povidona B.P.C. 28 mg

[0148] (e) Estearato de magnésio 7 mg

[0149] A liberação ocorre ao longo de um período de cerca de 6 a 8 horas e foi concluída após 12 horas.

EXEMPLO C: FORMULAÇÕES DE CÁPSULA FORMULAÇÃO A

[0150] Uma formulação de cápsula é preparada mesclando-se os ingredientes da Formulação D no Exemplo C anterior e preenchendo-se uma cápsula de gelatina dura de duas partes. Formulação B (infra) é preparada de uma maneira semelhante.

FORMULAÇÃO B

[0151] (a) Cepa probiótica (ou cepas probióticas) 1x109 CFU ou preferencialmente 1x1010 CFU

[0152] (b) Lactose B.P. 143 mg

[0153] (c) Glicolato de amido sódico 25 mg

[0154] (d) Estearato de magnésio 2 mg

FORMULAÇÃO C

[0155] (a) Cepa probiótica (ou cepas probióticas) 1x109 CFU ou preferencialmente 1x1010 CFU

[0156] (b) Macrogol 4000 BP 350 mg

[0157] As cápsulas são preparadas fundindo-se o Macrogol 4000 BP, dispersando-se a cepa probiótica (ou cepas probióticas) na fusão e preenchendo-se a fusão em uma cápsula de gelatina dura de duas partes.

FORMULAÇÃO D (CÁPSULA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA)

[0158] A seguinte formulação de cápsula de liberação controlada é preparada extrudando-se os ingredientes a, b e c com o uso de uma extrusora, seguida por esferonização do extrudado e secagem. Os péletes secos são, em seguida, revestidos com a membrana de controle de liberação (d) e preenchidos em uma cápsula de gelatina dura de duas peças.

[0159] (a) Cepa probiótica (ou cepas probióticas) 1x109 CFU ou preferencialmente 1x1010 CFU

[0160] (b) Celulose microcristalina 125 mg

[0161] (c) Lactose BP 125 mg

[0162] (d) Etilcelulose 13 mg EXEMPLO D: FORMULAÇÕES EM PÓ FORMULAÇÃO A (COMPOSIÇÃO MICROBIANA DE FUSÃO RÁPIDA)

[0163] (a) Cepa probiótica (ou cepas probióticas) 80 mg (preferencialmente 1x1010 CFU)

[0164] (b) Eritritol 450 mg

[0165] (c) Inulina 227,5 mg

[0166] (d) Xilitol 227,5 mg

[0167] (e) Sabor de limão 10 mg

[0168] (f) Dióxido de silício 5 mg FORMULAÇÃO B (COMPOSIÇÃO MICROBIANA DE FUSÃO RÁPIDA)

[0169] (a) Cepa probiótica (ou cepas probióticas) 80 mg (preferencialmente 1x1010 CFU)

[0170] (b) Eritritol 425 mg

[0171] (c) Inulina 215 mg

[0172] (d) Xilitol 215 mg

[0173] (e) Maltodextrina 50 mg

[0174] (f) Sabor de limão 10 mg

[0175] (g) Dióxido de silício 5 mg EXEMPLO EXPERIMENTAL 1

MATERIAIS E MÉTODOS PROJETOS DE ESTUDO

[0176] Este foi um estudo clínico multicêntrico, aleatório, duplo-cego e controlado por placebo que incluiu 249 mulheres saudáveis na fase inicial da pós-menopausa. A aleatorização em um dos dois grupos de estudo, probióticos ou placebo, foi feita usando-se um gerador de números aleatórios computadorizado. Todos os participantes do estudo receberam um número de triagem desde o início e, uma vez que foram considerados elegíveis para a participação no estudo, foram alocados aleatoriamente um número de aleatorização. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da triagem para elegibilidade e antes da inscrição no estudo. O objetivo primário foi estudar a mudança percentual em BMD na coluna lombar, com base na absortometria de raios X de dupla energia (DXA), após 12 meses de intervenção com o produto probiótico ou placebo.

CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO

[0177] Os seguintes critérios de inclusão foram aplicados: mulheres saudáveis em fase pós-menopausa precoce

(pelo menos dois anos e no máximo 12 anos desde a última menstruação e pelo menos um ano desde a última ingestão de terapia de reposição hormonal); IMC ≥ 18 e ≤ 30 na triagem;

Escore T de BMD na coluna lombar (L1-L4) > -2,5, conforme medido por DXA; compromisso de não usar quaisquer produtos que possam influenciar o resultado do estudo na opinião do

Investigador e capacidade de compreender e cumprir os requisitos do estudo, conforme julgado pelo Investigador.

A participação no estudo não foi aprovada se algum dos seguintes critérios de exclusão foi cumprido: História relevante de > 1 fratura anterior após 50 anos de idade,

conforme julgado pelo investigador; Escore T ≤ - 2,5, no quadril total ou coluna lombar (L1-L4). Esses sujeitos devem ser encaminhados a um clínico geral para investigação posterior; histórico de doença óssea metabólica; peso instável (± cinco [5] kg) nos últimos seis (6) meses;

histórico de hipertireoidismo ou hipotireoidismo instável;

diagnosticado com doença que causa osteoporose secundária no último ano, incluindo hiperparatireoidismo primário,

doença pulmonar obstrutiva crônica, doença inflamatória intestinal (IBD), doença celíaca ou diabetes; histórico conhecido de artrite reumatoide, doença renal ou cardíaca clinicamente significativa, conforme julgado pelo

Investigador; cirurgia de bypass gástrico realizada;

histórico de imunodeficiência ou tratamento imunossupressor; doença diarreica aguda ou crônica; malignidade diagnosticada recentemente (nos últimos cinco

[5] anos); uso de produtos que contêm bactérias probióticas (mais de uma vez por semana) dentro de quatro (4) semanas antes da avaliação inicial; uso de corticosteroides por via oral; uso de suplementos de cálcio e/ou vitamina D dentro de um (1) mês antes da avaliação inicial; uso de qualquer terapia antirreabsortiva, incluindo, por exemplo, terapia de reposição hormonal sistêmica, bifosfonatos (atualmente ou durante os últimos 12 meses); uso de qualquer terapia de estimulação da formação óssea (atualmente ou durante os últimos 12 meses); uso de antibióticos nos últimos 2 (dois) meses; usuário frequente de antibióticos (>2 ciclos durante os últimos 12 meses) devido a episódios de infecção intercorrentes; tabagismo ou uso de produtos que contenham nicotina (atualmente ou nos últimos seis [6] meses); histórico de abuso de álcool ou ingestão excessiva de álcool, conforme julgado pelo Investigador.

PROCEDIMENTOS DE ESTUDO

[0178] Durante uma chamada telefônica de pré- triagem, os sujeitos foram verificados quanto à conformidade com os critérios de elegibilidade (excluindo os critérios DXA), com base em um questionário de histórico médico. Os sujeitos elegíveis foram agendados para uma varredura DXA e, se a elegibilidade para o estudo fosse confirmada, eles seriam reservados para a Visita 1 (visita para avaliação inicial; aleatorização) dentro de duas semanas.

[0179] Visitas adicionais foram realizadas um (1), três (3), seis (6) e 12 meses após a Visita 1 e os participantes do estudo foram contatados por telefone dois (2) e nove (9) meses após a Visita 1 para confirmar que estavam tomando o produto do estudo conforme planejado e para coletar as informações sobre quaisquer AEs e medicamentos concomitantes, bem como o uso de outros produtos que contêm probióticos.

[0180] Amostras de sangue e de urina em jejum para a análise de marcadores de remodelação óssea (forma beta do telopeptídeo C-terminal, CTx; razão de telopeptídeo N- terminal/creatinina, NTx/Cr; osteocalcina, OC; propeptídeo N-terminal de procolágeno tipo I, P1NP) foram coletadas no início do estudo, com 1, 3, 6 e 12 meses. As amostras foram mantidas congeladas a -80 ºC até a análise.

INTERVENÇÃO

[0181] O produto investigacional ativo (IP) consistia em uma combinação das três (3) cepas bacterianas probióticas Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434), Lactobacillus plantarum Heal 9 (DSM 15312) e Lactobacillus plantarum Heal 19 (DSM 15313). O IP foi fornecido em cápsulas que contêm um pó com bactérias liofilizadas e amido de milho usado como preenchimento. Cada cepa bacteriana foi igualmente representada na dose bacteriana total de 1x1010 CFU/cápsula.

[0182] As cápsulas de placebo tinham aparência, sabor e textura idênticos aos do IP ativo, com a exceção de que o pó probiótico foi substituído por peptona de levedura.

[0183] Os participantes foram instruídos a consumir uma cápsula diariamente durante a duração total do estudo, que foi de 12 meses.

MEDIÇÕES DE DENSIDADE MINERAL ÓSSEA E DE TEOR MINERAL ÓSSEO

[0184] A densidade mineral óssea (BMD) e o teor mineral ósseo (BMC) na coluna lombar L1-L4 (LS) foram medidos por absortometria de raios X de dupla energia (DXA) no início e no final do estudo (12 meses). O equipamento usado foi calibrado de acordo com as instruções do fabricante e a leitura central de todas as medidas DXA foi aplicada no estudo.

DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DA AMOSTRA

[0185] Estimou-se que, ao medir a % de mudança da linha de base na BMD na coluna lombar por DXA para se ter uma chance de 80% de ver uma diferença estatisticamente significativa de 2 entre o grupo ativo e o placebo, um tamanho da amostra de 100 sujeitos/grupo seja necessária.

Considerando uma possível taxa de abandono de 20%, optou-se por randomizar os 250 sujeitos no total, alocados para receber o produto ativo do placebo na razão de 1:1.

MÉTODOS ESTATÍSTICOS

[0186] O teste da soma dos postos de Wilcoxon foi usado para a comparação entre os grupos, enquanto o teste dos postos sinalizados de Wilcoxon foi aplicado para a análise das mudanças ao longo do tempo dentro dos grupos.

Os dados apresentados na seção de resultados correspondem ao conjunto de análise completo (intenção de tratar) que consiste em todos os indivíduos que foram randomizados para o estudo e que receberam pelo menos uma (1) dose do produto sob investigação.

RESULTADOS PERDA ÓSSEA REDUZIDA NA COLUNA LOMBAR NO GRUPO PROBIÓTICO

[0187] Após o período de intervenção de 12 meses, a LS-BMD foi, significativamente, reduzida no grupo placebo em 0,77% (p=0,0006), embora, no grupo probiótico, a redução em 0,17% não tenha sido significativa (p=0,40) (Figura 1).

Além disso, a perda de LS-BMD foi, significativamente, reduzida no grupo probiótico em comparação com o grupo placebo (p=0,04; teste de soma de postos de Wilcoxon).

[0188] Olhando-se para as mudanças em LS-BMC, houve uma redução média significativa no grupo placebo em 0,61% (p=0,018), enquanto houve um aumento na mudança relativa média no grupo probiótico em 0,1% (p=0,6). De acordo com a BMD e conforme mostrado na Figura 2, a ingestão de probióticos neutralizou, significativamente, a redução de LS-BMC observada no grupo placebo (p=0,036; teste de soma de postos de Wilcoxon).

MAIOR EFICÁCIA PROBIÓTICA NO SUBGRUPO COM OSTEOPENIA

[0189] Uma análise de subgrupo da população total foi conduzida com base nos níveis de linha de base de escore T no quadril total e na coluna. Os participantes do estudo foram descritos como saudáveis quando o escore T de linha de base era ≥ -1,0 e osteopênicos quando o escore T era -2,5 < T < -1,0. Em ambos os subgrupos de participantes osteopênicos e saudáveis, houve uma redução significativa em LS-BMD nos grupos placebo (p=0,046 e p=0,005, respectivamente), mas não nos grupos de probióticos (Figura 3 e Figura 4). Além disso, houve uma diferença significativa entre o grupo probiótico e o placebo, no subgrupo de mulheres com osteopenia (p=0,046; Figura 3).

ASSOCIAÇÃO ENTRE A REDUÇÃO DA PERDA ÓSSEA NO GRUPO PROBIÓTICO E O TEMPO DESDE O INÍCIO DA MENOPAUSA

[0190] Uma segunda análise de subgrupo foi conduzida com base no tempo médio desde o início da menopausa. O efeito protetor mais pronunciado do tratamento com probióticos foi observado em mulheres com idade inferior a 6 anos após o início da menopausa. Para essas mulheres na pós-menopausa precoce, a perda de LS-BMD foi de 0,18% no grupo tratado com probiótico, uma mudança que foi, significativamente, menor (p=0,025) em comparação com a perda de 1,21% no grupo placebo, conforme mostrado na Figura 5. A eficácia benéfica do produto probiótico na saúde óssea na coluna lombar foi, evidentemente, detectável pelo menos 12 anos após o início da menopausa (Figura 6), com a maior diferença entre os grupos ocorrendo em <6 anos após a menopausa.

NENHUM IMPACTO ÓBVIO DOS PROBIÓTICOS NOS MARCADORES DE RENOVAÇÃO ÓSSEA

[0191] Os marcadores séricos e urinários para a renovação óssea (CTx, NTx/Cr, OC, PN1P) foram analisados em diferentes momentos ao longo do estudo. Embora tenham ocorrido mudanças significativas observadas ao longo do tempo dentro de cada grupo, não houve diferenças obtidas entre o grupo probiótico e o placebo.

CONCLUSÃO

[0192] A conclusão geral dos resultados apresentados no presente documento é que há um claro efeito benéfico do uso do produto probiótico na saúde óssea da coluna lombar em mulheres na pós-menopausa precoce. O benefício mais evidente é observado em mulheres com osteopenia, nas quais se espera que tenham uma maior taxa de reabsorção óssea e atividade inflamatória associada. Uma análise de subgrupo adicional ligada à duração da fase da menopausa das mulheres no momento em que foram recrutadas para o estudo mostra que o efeito protetor do produto probiótico era evidente em todos os subgrupos (de menos de 5 anos desde o início da menopausa até, pelo menos, menos de 12 anos a partir do início da menopausa), com o efeito mais benéfico observado no subgrupo menos de 6 anos a partir do início da menopausa. Acredita-se que o efeito benéfico máximo observado no subgrupo menos de 6 anos após o início da menopausa pode ser devido a uma maior renovação óssea e, especialmente, à atividade de reabsorção óssea durante os primeiros 5 a 6 anos após o início da menopausa em comparação com os anos posteriores do início da menopausa.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 2

MATERIAIS E MÉTODOS PROJETOS DE ESTUDO

[0193] O tratamento com antibióticos foi usado para esgotar os micróbios intestinais de camundongos, como mostrado anteriormente (Ellekilde et al, 2014, Sci Rep 4:5922; Reikvam et al, 2011, PLoS One 6(3):e17996).

Inicialmente, a ampicilina foi administrada a camundongos prenhes por meio de água potável ad libitum a partir de uma semana antes do nascimento até que os camundongos descendentes atingissem a idade de 3 semanas (isto é, idade de desmame). Além da ampicilina na água potável, um coquetel de antibióticos que consistia em vancomicina, neomicina, metronidazol e anfotericina-B ampicilina foi administrado aos camundongos descendentes diariamente por meio de gavagem, conforme descrito anteriormente (Reikvam et al, 2011, PLoS One 6(3):e17996) por 3 semanas após o desmame. No final desse período (seis semanas após o nascimento), amostras fecais de camundongos saudáveis foram removidas assepticamente e transplantadas para os hospedeiros tratados com antibióticos (transplante de microbiota fecal, FMT), conforme descrito anteriormente (Ellekilde et al, 2014, Sci Rep 4:5922). Resumidamente, as amostras foram diluídas em 1:10 de uma solução de glicerol/PBS a 50%, congeladas em nitrogênio líquido e mantidas a -80 ºC. No dia da inoculação, a solução fecal foi, posteriormente, diluída em 1:5 e, em seguida, administrada por meio de gavagem oral (0,15 ml por camundongo receptor). Isso permitiu que o microbioma intestinal fosse restaurado. A reconstituição simulada do microbioma intestinal envolveu a gavagem oral de solução de glicerol/PBS.

[0194] O tratamento com probiótico ou veículo (glicerol) começou às 6 semanas de idade e continuou até a idade de 16 semanas. O tratamento probiótico foi uma mistura de três cepas de Lactobacillus (L), L. paracasei DSM 13434, L. plantarum DSM 15312 e DSM 15313. As cepas de Lactobacillus foram administradas em água potável de acordo com as instruções fornecidas pela Probi AB (10 ml do produto do estudo, que contém as quantidades iguais de cada uma das três cepas bacterianas, foram diluídos com água para 600 ml a fim de ter uma concentração total final de 109 CFU/ml. Os grupos de controle receberam água com veículo (glicerol) (ver Figura 7 para o diagrama do plano do projeto). Com 16 semanas de idade, os camundongos foram sacrificados por asfixia com CO2 e as articulações dos joelhos foram escaneadas por microCT a fim de procurar mudanças quantitativas e qualitativas no osso subcondral.

[0195] A análise de microCT das articulações do joelho foi realizada conforme descrito em van 't Hof (2012, Analysis of bone architecture in rodents using microcomputed tomography, Methods Mol Biol 816:461 a 476), Bouxsein et al (2010, Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography, J Bone Miner Res 25:1.468 a 1.486) e Campbell e Sophocleous (2014, Quantitative analysis of bone structure by micro- computed tomography, BoneKEy Reports, 3:564). A análise do osso periarticular foi realizada por microCT conforme descrito anteriormente em Sophocleous et al (2015, The type

2 cannabinoid receptor regulates susceptibility to osteoarthritis in mice, Osteoarthr Cartil 23:1.585 a

1.594). Resumidamente, um instrumento Skyscan 1172 foi ajustado para 60 kV e 167 mA. A análise do osso trabecular epifisário tibial e femoral foi realizada no plano coronal, com uma resolução de 5 mm. Após a aquisição, as imagens foram reconstruídas com o uso do programa Skyscan NRecon e analisadas com o uso do software Skyscan CTAn.

[0196] A análise de microCT foi realizada nos seguintes três grupos de camundongos machos:

[0197] Grupo 1: “FMT simulado + glicerol” (camundongos sem transplante de microbiota fecal e apenas administração de veículo [glicerol]);

[0198] Grupo 2: “FMT + glicerol” (camundongos que passaram por um transplante de microbiota fecal seguido de administração de veículo [glicerol]);

[0199] Grupo 3: “FMT + probióticos” (camundongos que passaram por um transplante de microbiota fecal seguido de administração de probióticos).

[0200] A densidade mineral óssea (BMD) não foi medida neste estudo animal, mas o volume ósseo trabecular (BV/TV) foi medido em seu lugar.

MÉTODOS ESTATÍSTICOS

[0201] As diferenças significativas entre os grupos foram avaliadas com o uso de análise de variância unilateral (ANOVA) seguida por teste post hoc Tukey HSD (para variâncias iguais) ou teste post hoc Games-Howell (para variâncias desiguais). O nível de significância foi estabelecido em p<0,05.

RESULTADOS MEDIDAS AUMENTADAS DE OSSO TRABECULAR EPIFISÁRIO TIBIAL NA ARTICULAÇÃO DO JOELHO COM A ADMINISTRAÇÃO DE PROBIÓTICOS

[0202] As Figura 8 e 9 mostram que a reconstituição do microbioma com FMT não teve um impacto significativo nos índices ósseo trabecular medidos neste estudo.

[0203] A Figura 8A mostra que o volume ósseo trabecular epifisário tibial (como uma proporção do volume total) foi aumentado no grupo "FMT + probióticos" em comparação com os grupos "FMT + glicerol" e "FMT simulado + glicerol". Da mesma forma, a Figura 8B mostra que a espessura trabecular epifisária tibial foi aumentada no grupo "FMT + probióticos" em comparação com os grupos "FMT + glicerol" e "FMT simulado + glicerol".

[0204] A Figura 8C e a Figura 8D mostram que a separação trabecular epifisária tibial e o número trabecular epifisário tibial, respectivamente, não foram significativamente diferentes entre os grupos.

[0205] No entanto, a Figura 8E mostra que o fator de padrão trabecular epifisário tibial foi reduzido no grupo “FMT + probióticos” em comparação com o grupo “FMT simulado + glicerol”. O fator de padrão trabecular (Tb.Pf) está relacionado à conectividade trabecular. Um valor mais alto de Tb.Pf indica menor conectividade, enquanto um valor mais baixo de Tb.Pf indica melhor (mais alta) conectividade entre as trabéculas. Consequentemente, os resultados mostram que a administração de probióticos aprimorou a conectividade trabecular epifisária tibial. Parece provável que este resultado se deva ao aumento da espessura trabecular (Figura 8B) e ao aumento geral do volume ósseo trabecular (Figura 8A), e não devido ao aumento do número trabecular (Figura 8D).

MEDIDAS AUMENTADAS DE OSSO TRABECULAR EPIFISÁRIO FEMORAL NA ARTICULAÇÃO DO JOELHO COM A ADMINISTRAÇÃO DE PROBIÓTICOS

[0206] A administração de probióticos (grupo “FMT + probióticos”) aumentou o volume ósseo trabecular epifisário femoral (como uma proporção do volume total; BV/TV; Figura 9A) e a espessura trabecular epifisária femoral (Tb.Th.; Figura 9B) em comparação tanto com o grupo “FMT + glicerol” quanto com o grupo “FMT simulado + glicerol”.

[0207] A Figura 9C e a Figura 9D mostram que a separação trabecular epifisária femoral e o número trabecular epifisário femoral, respectivamente, não foram significativamente diferentes entre os grupos.

[0208] A Figura 9E mostra que o fator de padrão trabecular epifisário femoral foi reduzido no grupo "FMT + probióticos" em comparação com os grupos "FMT + glicerol" e "FMT simulado + glicerol", o que indica que a administração de probióticos aprimorou a conectividade trabecular epifisária femoral. Como para a conectividade trabecular epifisária tibial, parece provável que esse resultado seja devido ao aumento da espessura trabecular (Figura 4B) e ao aumento geral do volume ósseo trabecular (Figura 4A), e não devido ao aumento do número trabecular (Figura 4D).

CONCLUSÕES

[0209] Consequentemente, esses dados corroboram, ainda, os do Experimento 1 em mostrar que a administração do tratamento com probióticos (a combinação de L. paracasei DSM 13434, L. plantarum DSM 15312 e DSM 15313) aumenta as medidas do osso trabecular sendo, neste caso, na articulação do joelho. O efeito foi observado tanto no osso epifisário tibial quanto no femoral.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratar e/ou prevenir a perda óssea trabecular em um mamífero caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um mamífero com necessidade do mesmo de uma dose eficaz de pelo menos uma cepa probiótica escolhida dentre Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434) e/ou pelo menos uma cepa probiótica de Lactobacillus plantarum.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um humano.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o humano é uma mulher na perimenopausa ou uma mulher na pós-menopausa.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o humano é uma mulher seis anos ou menos após o início da menopausa.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dose eficaz de pelo menos uma cepa probiótica é administrada pelo menos uma vez ao dia ou pelo menos a cada dois, três, quatro, cinco, seis ou sete dias, ou pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dose eficaz de pelo menos uma cepa probiótica é de cerca de 106 a cerca de 1014 unidades formadoras de colônia (CFU) por dose, preferencialmente de cerca de 108 a cerca de 1012 CFU por dose ou, mais preferencialmente, de cerca de 109 a cerca de 1011 CFU por dose.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dose eficaz de pelo menos uma cepa probiótica é de cerca de 1010 CFU por dose.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que uma ou mais doses eficazes de pelo menos uma cepa probiótica são administradas em um dia, e em que a dose diária da pelo menos uma cepa probiótica é de cerca de 106 a cerca de 1014 CFU por dia, preferencialmente de cerca de 108 a cerca de 1012 CFU por dia ou, mais preferencialmente, de cerca de 109 a cerca de 1011 CFU por dia.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dose diária da pelo menos uma cepa probiótica é de cerca de 1010 CFU por dia.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o tratamento e/ou a prevenção de perda óssea trabecular em um mamífero envolve o aumento da absorção de íons Ca2+.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cepa probiótica de Lactobacillus plantarum é escolhida a partir de Lactobacillus plantarum 299 (DSM 6595), Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843), Lactobacillus plantarum HEAL 9 (DSM 15312), Lactobacillus plantarum HEAL 19 (DSM 15313), Lactobacillus plantarum HEAL 99 (DSM 15316), Lactobacillus plantarum GOS42 (DSM 32131), Lactobacillus plantarum DSM 17852 (LB3e) e Lactobacillus plantarum DSM 17853 (LB7c).

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cepa probiótica é Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434) em combinação com Lactobacillus plantarum HEAL 9 (DSM 15312) e Lactobacillus plantarum HEAL 19 (DSM 15313).

13. Método para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cepa probiótica é administrada em uma composição que compreende pelo menos um carreador selecionado a partir de um carreador farmaceuticamente aceitável, um excipiente farmaceuticamente aceitável, um carreador de qualidade alimentar, um excipiente de qualidade alimentar, um diluente e um alimento.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a composição é fornecida sob a forma de uma solução, suspensão, emulsão, comprimido, grânulo, pó, cápsula, pastilha, goma de mascar ou supositório.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o alimento é um produto à base de cereais, um produto lácteo, uma bebida do tipo suco ou um alimento fermentado.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que a composição é suplementada com vitamina D, por exemplo, selecionada a partir de vitamina D3 colecalciferol ou vitamina D2 ergocalciferol.

17. Pelo menos uma cepa probiótica escolhida dentre Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434) e/ou pelo menos uma cepa probiótica de Lactobacillus plantarum caracterizada pelo fato de que é para o uso no tratamento e/ou na prevenção de perda óssea trabecular em um mamífero.

18. Composição caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma cepa probiótica, de acordo com a reivindicação 17, e um ou mais carreadores, para o uso no tratamento e/ou na prevenção de perda óssea trabecular em um mamífero.

19. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma cepa probiótica, de acordo com a reivindicação 17, e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, para o uso no tratamento e/ou na prevenção de perda óssea trabecular em um mamífero.

20. Uso de uma composição caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma cepa probiótica, de acordo com a reivindicação 17, ou o uso de uma composição ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, no tratamento e/ou na prevenção de perda de óssea trabecular em um mamífero.