TWI607759B - 副乾酪乳桿菌菌株ｇｍｎｌ－６５３用於製備抗骨質流失的組合物的用途 - Google Patents

Description

副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653用於製備抗骨質流失的組合物的用途

本發明係關於一種促進骨質再生的副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653及其用於製備抗骨質流失的組合物的用途，特別是關於一種具有增加與骨質相關的細胞激素表達、抑制蝕骨相關基因RANKL及降低血清中細胞激素IL-17A的能力的副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653及其用於製備抗骨質流失的組合物的用途。

骨質疏鬆症為一種全身骨骼疾病，其特徵包括骨量減少，骨組織的顯微結構變差，造成骨骼脆弱，骨折危險性增高。

骨再塑過程中，包括造骨細胞的骨形成作用，以及蝕骨細胞的骨吸收作用，共同維持骨組織的動態平衡，一旦骨吸收超過骨形成，即會導致骨流失，最後引起骨質疏鬆症。一般而言，骨質疏鬆症又分成停經後骨質疏鬆症和老年性骨質疏鬆症兩類。停經後骨質疏鬆症常見於停經後婦女，由於女性停經後體內雌性素量急遽減少，蝕骨細胞活性增強而吸收骨小樑，最終使骨小樑變細、斷折、數目減少、不連續，減弱骨強度；而老年性骨質疏鬆症為造骨細胞功能衰退，鈣和維生素D攝取量不足，腸道吸收功能變差，導致骨合成減少，骨皮質變粗鬆大孔，骨小樑消失，骨 強度明顯減低。

目前防治骨質疏鬆及骨折的藥物，依其作用機轉可分為抗蝕骨或抗流失類藥物、促造骨或促骨生成類藥物以及混合型三類。抗蝕骨類藥物包括鈣劑、維他命D、抑鈣素、雙磷酸鹽、雌激素受體調節劑、性激素類、蝕骨細胞酵素抑制劑、RANKL單株抗體等，混合型目前只有鍶鹽一種。防治骨質疏鬆的藥物本身伴隨了一些副作用。臨床試驗結果發現合併使用藥物，並無加成效果，反而會互相抵制，或是增加副作用之發生率或強度，所以目前各國各種骨質疏鬆防治指引，均不建議併用兩種抗流失劑，或是併用抗流失劑與促造骨劑。

臨床上常使用於老人及更年期婦女之骨質疏鬆藥品，如福善美錠、克骨鬆錠、可骨華錠等雙磷酸鹽類藥品，長期服用若未注意口腔衛生或進行拔牙、植牙手術，恐發生嚴重顎骨關節壞死；近期研究亦發現，其可能引起非典型股骨骨折之不良反應。

過去雖然有部分文獻指出某些特定益生菌菌株具有降低卵巢摘除大小鼠之骨質流失的能力，例如：L.reuteri ATCC PTA 6475；L.paracasei DSM13434；L.plantarum DSM 15312、DSM 15313及B.longum等，並發現是經由降低發炎反應的機制以達到延緩骨質流失的能力，但他們都是活菌形式的使用，在使用上易受胃酸、膽鹽及抗生素藥物的影響，在使用的時間點上限制較多。此外，活菌數目易受保存條件，如溫度、溼度等的影響，因此在產品劑型上也較受限制。

故，有必要提供一種副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653用於製備抗骨質流失的組合物的用途，以解決習用技術中所存在的問題。

本發明之主要目的在於提供一種副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653(Lactobacillus Paracasei GMNL-653)用於製備抗骨質流失的組合物的用途，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653及組合物可通過任何形式進入消化系統內，增加細胞激素TGF-β及IL-10的表達，同時可抑制及降低蝕骨相關基因(如RANKL)的表現量，降低血清中與骨質流失相關的細胞激素IL-17A的含量，因此達成改善骨質流失的問題。

為達上述之目的，本發明的一實施例提供一種副乾酪乳桿菌菌株用於製備抗骨質流失的組合物的用途，其中該副乾酪乳桿菌菌株是副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653(Lactobacillus Paracasei GMNL-653)，並以寄存編號BCRC 910721寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。

在本發明的一實施例中，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653是死菌型態。

在本發明的一實施例中，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653是熱殺死菌株。

在本發明的一實施例中，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653具有降低血清中細胞激素IL-17A(Interleukin-17A)含量的能力。

在本發明的一實施例中，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653具有增加細胞激素IL-10(Interleukin-10)表達的能力。

在本發明的一實施例中，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653具有增加細胞激素TGF-β表達的能力。

在本發明的一實施例中，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653具有抑制蝕骨相關基因RANKL表達的能力。

在本發明的一實施例中，該抗骨質流失的組合物是一醫藥組合物、一營養補充品、一保健食品、一醫療食品或其組合。

在本發明的一實施例中，該抗骨質流失的組合物另包含一載體，以將該抗骨質流失的組合物製成片劑、膠囊、散劑或口服液體製劑。

第1圖：顯示實驗2中各組的細胞激素TGF-β的表現量長條圖。

第2圖：顯示實驗2中各組的蝕骨相關基因RANKL的表現量長條圖。

第3圖：顯示實驗2中各組的細胞激素IL-10的表現量長條圖。

第4圖：顯示實驗3中各組的血清中IL-17A的含量長條圖。

為了讓本發明之上述及其他目的、特徵、優點能更明顯易懂，下文將特舉本發明較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下。此外，本發明所提到的單數形式“一”、“一個”和“所述”包括複數引用，除非上下文另有明確規定。數值範圍(如10%~11%的A)若無特定說明皆包含上、下限值(即10%≦A≦11%)；數值範圍若未界定下限值(如低於0.2%的B，或0.2%以下的B)，則皆指其下限值可能為0(即0%≦B≦0.2%)。上述用語是用以說明及理解本發明，而非用以限制本發明。

本發明之一實施例提供一種抗骨質流失的副乾酪乳桿菌菌株及其用於製備抗骨質流失的組合物的用途，該副乾酪乳桿菌菌株是副乾 酪乳桿菌菌株GMNL-653(Lactobacillus Paracasei GMNL-653)，並以寄存編號BCRC 910721寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653可為活菌菌株或死菌菌株，可例如是熱殺死菌株。該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653具有抗發炎能力，且能抑制蝕骨相關基因RANKL的表達及細胞激素IL-17A(Interleukin-17A)的產生。

本發明之一實施例提供一種抗骨質流失的組合物，其包含如上所述之副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653。較佳的，該抗骨質流失的組合物也可以一醫藥組合物、一營養補充品、一保健食品、一醫療食品或其組合的方式呈現。該抗骨質流失的組合物可以根據有效性或方便性來考量設計成不同的形態，例如，利用一載體，將該抗骨質流失的組合物製成片劑、膠囊、散劑或口服液體製劑，然不限於此，也可以製成其他藥理或生理可接受的型態。此外，該抗骨質流失的組合物較佳是以食用方式進入消化系統，使得該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653在消化系統內發揮其效果。

上述實施例中的該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653主要是從人體腸道篩選分離獲得的多個分離株的其中一株。利用表1之引子(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)進行PCR以複製多個分離株各自的16S rDNA片段，接著將其加以定序，定序完成後得到其中一株的16S rDNA基因序列如下(SEQ ID NO：3)；隨後，由NCBI網站比對後的結果可知，該分離株的16S rDNA序列與副乾酪乳桿菌(Lactobacillus Paracasei)的16S rDNA序列相似，相似度均為99%以上，故可知此菌株GMNL-653確實屬於副乾酪乳桿菌。

該副乾酪乳桿菌GMNL-653的完整16S rDNA序列(SEQ ID NO：3)如下：

對該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653進行醱酵試驗，可獲得如表2的結果。

為了驗證本發明所提供之該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653具有抗發炎的特性，且能達到抑制骨質流失的目的，進行了以下動物模式的實驗。

實驗1：骨組織分析

菌株：副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei GMNL-653)

菌株處理：

死菌製備：分別自凍管接種副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei GMNL-653)及唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius GMNL-678)到1ml MRS broth，並於37℃有氧下靜置培養20小時。次日，取15μl隔夜培養菌液至1.5ml MRS broth(1%二次活化)，接著於37℃有氧下靜置培養20 小時，再以OD 600nm推估菌數，並將菌數調整為4.1×10⁸cfu/ml，並進行121℃高溫高壓滅菌15分鐘備用。

骨質疏鬆小鼠模式：

由樂斯科生技公司購入8週齡ICR雌鼠，待9週齡時進行去卵巢手術。小鼠在麻醉下，於背部兩側卵巢處切開，進行去卵巢手術；所有組別均在手術後4天開始管餵投予試驗物質。小鼠分為假手術組(Control組，只打開腹腔，未摘除卵巢)；以及4組去卵巢組(Ovariectomy；OVX)。小鼠犧牲時，檢查卵巢組織，確認去除卵巢手術是否成功，手術失敗的動物，實驗結果不採用。4組去卵巢組的小鼠中，取1組為溶媒組(H₂O組)，1組為正對照藥物組(抗骨質疏鬆藥物Alendronate)。Alendronate以去離子水配製濃度0.25mg/ml的懸浮液，小鼠每10公克體重投予0.1ml，一週投予4次。其餘2組分別管餵GMNL-653死菌0.2ml或GMNL-678死菌0.2ml(死菌濃度為4.1×10⁸cfu/ml；換算小鼠劑量8.2×10⁷cells/mouse，換算人體劑量：2×10¹⁰cells/60kg成人)，兩組每天各管餵一次，連續28天後，將小鼠麻醉並以腹腔靜脈採血犧牲，取出股骨供分析。

分析方法：

右股骨遠心端骨幹以微型電腦斷層掃描儀(micro computed tomography；SkyScan 1076,Kontizh,Belgium，解析度為18μm)拍攝電腦斷層掃描圖，並以分析軟體分析骨小樑區域的比率，即骨體積與組織體積的比率(bone volume/tissue volume)。分析的位置選擇生長板下(往近心端)100片的區域，不包含皮質骨。骨礦質密度的分析選擇相同區域分別分析不含皮質骨的骨礦質密度。實驗所得之數據，均以雙尾變異數分析(two-way analysis of variance)，並進行T-test統計分析，所有數據均以平均±標準差(mean±SD)表示；各組與OVX+H₂O組相比後經統計分析，以不同符號表示統計上具顯著差異(*代表p<0.05；**代表p<0.01)。實驗1的結果請見表4及表5。

從表4可看出，小鼠去除卵巢後，造症組(OVX+H₂O)的骨小樑區域的比率，即骨體積與組織體積的比率分析，皆顯著低於假手術組(Control)，表示骨質疏鬆動物模式造症成功。比較投餵GMNL-653死菌、GMNL-678與藥物正對照組，可發現BV/TV分析顯著高於造症組，表示GMNL-653、GMNL-678及藥物Alendronate確實可以減緩卵巢摘除後骨質流失的程度。管餵GMNL-653菌株的這一組，保護效果甚至略優於抗骨質疏鬆藥物Alendronate。

從表5可看出，造症組(OVX+H₂O)的右股骨骨礦質密度皆顯著低於假手組(Control)；而投餵GMNL-653死菌的組別，其骨頭密度明 顯優於造症組(OVX+H₂O)，表示管餵GMNL-653可以減緩卵巢摘除後骨質流失的程度，同時也發現了GMNL-653在保護骨質的效果上明顯優於管餵GMNL-678。

實驗2：GMNL-653對蝕骨基因、抗發炎細胞激素的影響

萃取脛骨RNA：實驗結束後將小鼠左股骨取下，將脛骨以剪刀剪成小塊，並加入適量的液態氮使骨頭迅速進行磨碎；將磨碎的骨粉加入0.5ml TRIzol^® Reagent進行RNA萃取，加入0.1ml氯仿(chloroform)上下翻轉15次，並置於室溫反應5分鐘後離心並將上層提取至新的微量離心管eppendorf中，並加入0.25ml異丙醇，在室溫放置10分鐘後進行離心；移除上清液，並用0.5ml 75%乙醇清洗離心後的沉澱物；吹乾上述離心後的沉澱物後加入20-50μl的DEPC水(diethylpyrocarbonate treated water)回溶，測定RNA濃度。

RNA反轉cDNA：取1-5μg RNA並補無RNA酶水(RNase-free water)至10μl；另外則加入10×Ramdon primer(2μl)，10mM dNTP(1μl)，65℃ 5分鐘，冰上2-3分鐘；作用完第一階段後，再加入5×RT buffer(4μl)，0.1M DTT(1μl)，RNA酶抑制劑(RNase inhibitor，Invitrogen,RNaseOUTTM,1μl)，RT酵素((Invitrogen,SuperScript®III,1μl)，Mix RT分鐘並置於50℃中60分鐘，以及70℃中15分鐘，進行反轉錄酵素之作用。

脛骨cDNA進行real-time PCR分析：取1μl脛骨cDNA加入4μL，1μM的F+R primers(正向/反向引子序列如下所示)、5μL的2x Rotor-Gene SYBR Green PCR Master Mix(Qiagen,Cat.204076)，放入Q-PCR機器中進行反應，TGF-β及RANKL相對表達量為扣除本身GAPDH所得。

分析方法：實驗所得之數據，均以雙尾變異數分析(two-way analysis of variance)，並進行T-test。統計分析各組均與OVX+H₂O組相比，*代表p<0.05；**代表p<0.01。

如第1圖所示，GMNL-653死菌型態能增加保護骨質流失之細胞激素TGF-β的表現。小鼠去除卵巢後與假手術組相比，抗發炎細胞激素TGF-β表現量明顯降低；餵食GMNL-653死菌的組別中，TGF-β表現量與卵巢摘除組(OVX+H₂O)相比有明顯增加的情形，此結果表示GMNL-653具有促進TGF-β表達之功效，並藉此延緩骨質流失。

接著，如第2圖所示，去除卵巢後給予GMNL-653死菌的組別，可以明顯看出，在小鼠去除卵巢後，造症組(OVX+H₂O)與假手術組(Control)相比，其蝕骨相關基因RANKL表現量有增加的情形；而給予管餵GMNL-653死菌的組別，其蝕骨相關基因RANKL的表現量均明顯低於造 症組(OVX+H₂O)，表示GMNL-653具有抑制RANKL表達之功效，並藉此延緩骨質流失。

繼續參考第3圖，GMNL-653死菌型態也能增加細胞激素IL-10的表現。小鼠去除卵巢後與假手術組相比，抗發炎細胞激素IL-10表現量明顯降低；餵食GMNL-653死菌的組別，IL-10表現量與卵巢摘除組(OVX+H₂O)相比有明顯增加的情形，此結果表示GMNL-653具有促進IL-10表達之功效，並藉此延緩骨質流失。

實驗3：GMNL-653對骨鬆相關的細胞激素IL-17A的影響

分析方法：將各組試驗小鼠麻醉犧牲，收集血液放置室溫下30分鐘後，以10,000g離心10分鐘，收集血清並置於-80℃中分裝保存。IL-17A分析是以原倍血清進行抗原抗體結合反應，並以BioLegend's ELISA MAX^TM Deluxe Sets分析套組執行實驗，實驗步驟均遵循原廠說明書，最後以ELISA reader測定OD 450nm吸光值，每組均重覆二次。

分析結果如第4圖所示，小鼠去除卵巢後，造症組(OVX+H₂O)血清中的IL-17A含量與假手術組(Control)相比有增加的情形；而管餵GMNL-653則顯示了血清中的IL-17A含量有明顯降低。統計分析各組均與OVX+H₂O組相比，*代表p<0.05；**p<0.01。

綜合上述結果，可以確定副乾酪乳桿菌GMNL-653的熱殺死菌的形態，在動物實驗的骨組織分析(骨小樑區域的比率，BV/TV)、股骨骨礦質密度(BMD)都能顯著的減緩卵巢摘除小鼠之骨質流失現象。此外，由於已有文獻指出TGF-β在骨生成中之軟骨內骨化(intracartilanginous ossification or endochondral ossification)過程扮演相當重要的角色，實驗中 發現TGF-β缺陷鼠則會減少骨生長及骨礦化現象；IL-10為體內重要的抗發炎細胞激素，有文獻曾指出IL-10可能具有間接平衡體內Ca²⁺(calcium)/Pi(phosphorous)離子之比例；而促發炎細胞激素IL-17則已被證實在雌性激素缺乏之小鼠會協同RANKL做為誘導蝕骨前驅細胞或蝕骨細胞之表現並進行多核作用，以促進蝕骨細胞之增生與分化。在嚙齒類動物中，雌激素具有抑制IL-17所調控的蝕骨細胞分化，而IL-17另一方面又會抑制骨母細胞(osteoblast)之形成與礦化。因此本發明提供之含有副乾酪乳桿菌GMNL-653的組合物可經由增加與骨質相關的細胞激素TGF-β及IL-10的表達、抑制蝕骨基因(RANKL)之表達及降低血清中細胞激素IL-17A含量的能力，進而達到抑制骨質流失的目的。

此外，實驗結果也發現使用GMNL-653的組別在保護骨質流失的效果上優於骨質疏鬆用藥Alendronate。而目前臨床上已發現Alendronate具有許多的副作用，包括心臟病、頑固痛症、顎骨壞死、骨折、食道癌等；因此，安全而無副作用的副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653應用於延緩骨質流失上，應可為未來預防及改善停經後婦女之骨質疏鬆疾病應是一種更好的選擇。

雖然本發明已以較佳實施例揭露，然其並非用以限制本發明，任何熟習此項技藝之人士，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

食品工業發展研究所、2016年2月26日、BCRC 910721

<110> 景岳生物科技股份有限公司

<120> 副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653用於製備抗骨質流失的組合物的用途

<130> TP170229-TW

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PAF primer

<400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 536R primer

<400> 2

<210> 3

<211> 523

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequencing primer

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TGF beta forward primer

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> TGF beta reverse primer

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> RANKL forward primer

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> RANKL reverse primer

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> IL-10 forward primer

<400> 8

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> IL-10 reverse primer

<400> 9

<210> 10

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<213> Artificial Sequence

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<223> GAPDH forward primer

<400> 10

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<223> GAPDH reverse primer

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Claims (6)

1. 一種副乾酪乳桿菌菌株用於製備抗骨質流失的組合物的用途，其中該副乾酪乳桿菌菌株是副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653(Lactobacillus Paracasei GMNL-653)，並以寄存編號BCRC 910721寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)，該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653具有降低血清中細胞激素IL-17A(Interleukin-17A)含量、增加細胞激素IL-10(Interleukin-10)表達或抑制蝕骨相關基因RANKL表達的能力。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653是死菌型態。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653是熱殺死菌株。
4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該副乾酪乳桿菌菌株GMNL-653具有增加細胞激素TGF-β表達的能力。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抗骨質流失的組合物是一醫藥組合物、一營養補充品、一保健食品、一醫療食品或其組合。
6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抗骨質流失的組合物另包含一載體，以將該抗骨質流失的組合物製成片劑、膠囊、散劑或口服液體製劑。