CN113876789B - Licraside用于制备治疗胆汁淤积药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种Licraside用于制备治疗胆汁淤积药物的新用途。首先,本发明发现Licraside(异甘草素‑4‘‑O‑芹糖(1→2)葡萄糖苷)能够靶向激动FXR,可用于制备FXR靶点激动剂;其次,本发明发现所述的Licraside能够显著抑制胆汁淤积模型小鼠总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)含量,抑制谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷酰转移酶(GGT)活性,具有显著的利胆退黄作用,效果与现有临床用药奥贝胆酸相当或更好;并且所述的Licraside基本无毒,安全性良好,可用于制备治疗胆汁淤积及其相关并发症的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种Licraside用于制备治疗胆汁淤积药物的新用途。
背景技术
胆汁淤积是指由各种原因造成的胆汁形成、分泌和排泄障碍,引发胆汁进入血液的病理状态,临床表现为瘙痒、乏力和黄疸等。胆汁淤积早期无明显症状,随病情进展可出现高胆红素血症,严重者可引发肝衰竭甚至死亡。目前治疗胆汁淤积的主要方法是去除病因和利胆治疗,其中胆汁淤积的常用治疗西药为熊去氧胆酸,黄疸的治疗药物为葡萄糖醛酸酶诱导剂、活性炭及白蛋白等。而中医对“胆淤”及“黄疸”的病因和发病机制有独特认识,并在中药治疗该类疾病中积累了丰富的宝贵经验,从中药中寻找安全有效的“利胆退黄”药物有望成为胆汁淤积治疗药物研发的有效途径。现代研究显示,“利胆退黄”类中药具有多靶点作用、疗效显著和副作用少等优点,临床疗效显著且应用广泛。如中药经典方剂茵栀黄方是由茵陈、栀子、黄芩和金银花四味药材组成,具有清热解毒,利湿退黄之功效,在治疗胆汁淤积型疾病,如黄疸型肝炎、新生儿/小儿黄疸等方面取得较好疗效。
正常肝脏胆酸盐合成及转运保持平衡状态,一旦该平衡被打破就会引发胆汁淤积。FXR 是一种胆酸盐激活的核受体,FXR激活可上调胆汁酸外排转运体胆盐输出泵及多药耐药相关蛋白家族的表达,从而促进肝脏胆汁酸向胆管及血液系统的外排;且FXR激活可抑制胆固醇 7α-羟化酶的表达从而减少肝脏胆汁酸的合成,说明FXR是调控肝脏胆汁酸合成与转运的重要调节分子。目前发现,肝细胞膜转运蛋白既负责胆酸盐转运,又参与胆红素转运,因此FXR 基因缺失会引起胆汁淤积和黄疸。
鉴于核受体FXR在胆汁淤积及黄疸的发病中发挥重要作用,目前FXR激动剂的研发已受到国内外学者的广泛关注。
本发明意外发现Licraside能够同时靶向激动FXR,可用于制备FXR激动剂;而且所述的Licraside能够显著抑制胆汁淤积模型小鼠总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)含量,抑制谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷酰转移酶(GGT)活性,具有显著的利胆退黄的双重作用,效果与现有临床用药奥贝胆酸相当或更好;并且所述的Licraside基本无毒,安全性良好,可用于制备治疗胆汁淤积及其相关并发症的药物。
发明内容
针对上述技术问题,本发明的目的在于提供一种Licraside用于制备治疗胆汁淤积药物的新用途,具体包括以下内容:
第一方面,本发明提供了一种Licraside或其药学上可接受的盐在制备FXR靶点激动剂中的应用,所述Licraside的结构式如下式(Ⅰ)所示:
优选地,所述Licraside或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的辅料或载体制成药学上可接受的任一剂型。
优选地,所述剂型包括片剂、注射剂、胶囊剂。
第二方面,本发明提供了一种Licraside或其药学上可接受的盐在制备治疗胆汁淤积药物中的应用,所述Licraside的结构式如下式(Ⅰ)所示:
优选地,所述Licraside或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的辅料或载体制成药学上可接受的任一剂型。
优选地,所述剂型包括片剂、注射剂、胶囊剂。
第三方面,本发明提供了一种Licraside或其药学上可接受的盐在制备治疗黄疸药物中的应用,所述Licraside的结构式如下式(Ⅰ)所示:
优选地,所述Licraside或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的辅料或载体制成药学上可接受的任一剂型。
优选地,所述剂型包括片剂、注射剂、胶囊剂。
第四方面,本发明提供了一种Licraside或其药学上可接受的盐在制备治疗胆汁淤积并发症药物中的应用,所述Licraside的结构式如下式(Ⅰ)所示:
优选地,所述胆汁淤积并发症包括高胆红素血症、胆汁淤积性肝炎、遗传性肝内胆汁淤积、药物性胆汁淤积、胆汁淤积伴胆管损伤、自身免疫性胆汁淤积、胆汁淤积型肝损伤、妊娠期肝内胆汁淤积、病毒性肝炎、酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎。
优选地,所述Licraside或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的辅料或载体制成药学上可接受的任一剂型。
优选地,所述剂型包括片剂、注射剂、胶囊剂。
本发明的有益效果是:
(1)本发明意外发现Licraside能够靶向激动FXR,可用于制备FXR靶点激动剂;可用于制备FXR靶点介导的相关疾病;
(3)所述的Licraside能够显著抑制胆汁淤积模型小鼠总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA) 含量,抑制谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷酰转移酶(GGT) 活性,具有显著的利胆退黄双重作用,效果与现有临床用药奥贝胆酸相当或更好;
(3)并且所述的Licraside基本无毒,安全性良好,可用于制备治疗胆汁淤积及其相关并发症的药物,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1 Licraside对FXR的体外激动活性;
图2 Licraside对ANIT诱导的胆汁淤积小鼠血清生化学指标的影响;
图3 Licraside对ANIT诱导的胆汁淤积小鼠胆汁中总胆汁酸水平(TBA)的影响;
图4 Licraside对ANIT诱导的胆汁淤积小鼠肝脏病理学变化的影响;
图5 Licraside干预后对细胞存活率的影响。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
以下实施例所述的Licraside(异甘草素-4‘-O-芹糖(1→2)葡萄糖苷),CAS:29913-71-1;购买于上海源叶生物科技有限公司;结构式如下式所示,
以下实施例所述试剂或材料若无说明,均为市售。
实施例1 FXR激动活性测定
建立双荧光素酶报告基因实验进行FXR激动剂筛选细胞验证方法,具体实验操作步骤如下:
1.HepG2细胞以15000个/孔的浓度接种于96孔板,DMEM完全培养基培养24h后,待细胞长至70%左右进行转染;提前将转染试剂X-tremegene(Roche)、过表达质粒FXR、报告基因质粒BSEP和海肾荧光素酶质粒、Opti-MEM培养基于室温15-25℃平衡20min;按比例配置转染混合液,分别为每100μL Opti-MEM培养基含质粒各1μg,转染试剂4μL,质粒和转染试剂比例为1:2,轻柔混匀;取出96孔板,每孔加10μL转染混合试剂,继续培养 24h;24h后,分别加入20μM、40μM、80μM、100μM浓度的Licraside干预细胞24h。
2.药物干预24h后,向细胞中加入裂解液Passive Lysis Buffer(Promega),每孔加50μL,待细胞充分裂解,取20μL裂解液加入Lockwellmaxisorp检测板中,同时加入Luciferase Assay Reagent 20μL,振荡混匀后检测萤火虫荧光素酶活性。检测完后,每孔同时加入20μL Stop&Reagent,震荡混匀后静置,3min后使用酶标仪检测海肾荧光素酶荧光值和萤火虫荧光素酶活性。每孔酶活性以校正后的相对荧光强度计,相对荧光强度=萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶。以空白组相对荧光强度为基础表达(以1表示),其他待测的相对荧光强度与其相比,以相对荧光强度大小表示FXR活性高低,数值越高则表示对FXR的激活作用越强;其中以 CDCA的相对荧光强度作为阳性对照药物的激活作用。
结果如图1所示,本发明所述不同浓度的Licraside均具有显著FXR的激活作用。
实施例2 Licraside对胆汁淤积小鼠治疗作用
1.实验材料
雄性C57BL/6小鼠,体重18±2g,由甘肃省药品检定研究院提供;在塑料笼具内分笼饲养,自由摄食与饮水7天,使其适应环境并检疫。
2.实验方法
本实验应用异硫氰酸-1-萘酯(ANIT)建立小鼠急性胆汁淤积模型,研究阿Licraside对该模型小鼠的治疗作用。
2.1实验分组
小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、Licraside低剂量组、Licraside中剂量组、Licraside 高剂量组、阳性药物奥贝胆酸(OCA)组,每组8只。
2.2给药方法
Licraside低剂量组、Licraside中剂量组、Licraside高剂量组分别给予阿彼斯基姆素1mg/kg, 5mg/kg,10mg/kg,阳性药组给予OCA 10mg/kg,每天给药1次,连续给药9天,正常对照组和模型对照组给予相应容量的溶剂。给药第7天,Licraside组、阳性药组和模型对照组均灌胃给予ANIT 80mg/kg。给药第9天,小鼠禁食6h后,眼球取血,摘取小鼠胆囊,取左叶肝脏置于10%甲醛溶液中固定备用。
3.实验数据检测与处理
3.1血清指标测定
全自动生化分析仪测定血清总胆红素(TBIL)和总胆汁酸(TBA)含量,谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷酰转移酶(GGT)活性。
3.2胆汁总胆汁酸含量测定
胆汁稀释100倍,全自动生化分析仪测定总胆汁酸(TBA)含量。
3.2肝病理组织学观察
大鼠肝脏用10%中性甲醛固定,石蜡包埋,切片,二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水,常规HE 染色,乙醇脱水,二甲苯透明,树脂封固,使用显微镜观察。
3.3统计学分析
采用Graphpad8.0软件进行数据处理,单因素方差分析。
4.实验结果
4.1生化指标变化
小鼠血清生化指标变化如图2所示,其中ALP、GGT活性升高,TBIL、TBA含量升高是肝内胆汁淤积的血清学标志。AST和ALT活性升高是肝损伤的血清学标志。结果表明,与空白组相比,模型组小鼠血清中ALT、ALP、AST、GGT活性升高,TBIL、TBA含量升高, P值均小于0.05,差异具有统计学意义,表明小鼠急性肝内胆汁淤积模型造模成功;而Licraside 和阳性治疗药物奥贝胆酸(OCA)治疗后,ALT、ALP、AST、GGT活性及TBIL、TBA含量均被显著抑制,可见其可逆转ANIT诱导的胆汁淤积和肝损伤血清标志物的升高,表明本发明所述的Licraside和阳性治疗药物奥贝胆酸具有相同的治疗胆汁淤积的功效;其中,本发明所述的Licraside能够显著抑制总胆汁酸(TBA)含量,效果优于阳性治疗药物奥贝胆酸。
胆汁中的TBA指标变化结果如图3所示,结果表明,与空白组相比,模型组小鼠血清中 TBA含量升高,表明小鼠急性肝内胆汁淤积模型造模成功;而Licraside和阳性治疗药物奥贝胆酸(OCA)治疗后,胆汁中TBA含量较模型组显著下降,P值小于0.05,差异具有统计学意义,可见其可逆转ANIT诱导的胆汁TBA水平的升高,表明本发明所述的licraside和阳性治疗药物奥贝胆酸具有相同的治疗胆汁淤积的功效。
4.2肝病理组织学变化
Licraside对ANIT诱导的胆汁淤积小鼠肝脏病理学变化的影响结果如图4所示,结果发现,ANIT诱导的模型小鼠肝组织中出现肝细胞肿胀、弥漫性空泡化、炎性细胞浸润和肝细胞坏死等病理变化,表明ANIT诱导的胆汁淤积模型小鼠可出现明显的肝细胞损伤;而采用本发明所述的Licraside和阳性治疗药物奥贝胆酸(OCA)治疗后,肝细胞肿胀、弥漫性空泡化、炎性细胞浸润和肝细胞坏死等病理情况均得到显著改善。结果说明,本发明所述的Licraside 和阳性治疗药物奥贝胆酸(OCA)对ANIT诱导胆汁淤积出现的肝细胞损伤具有明显的治疗作用,可用于治疗胆汁淤积导致的肝损伤。
上述结果表明,本发明所述的Licraside能够显著抑制胆汁酸的分泌,抑制胆红素的分泌,具有显著的利胆去黄的效果,能够治疗胆汁淤积及其并发症。
实施例3安全性评价
采用MTT实验评价Licraside的毒性,具体实验操作步骤如下:
HepG2细胞以5000个/孔的浓度接种于96孔板,MEM完全培养基培养24h后,待细胞长至70%左右,分别以20μM、40μM、80μM、100μM浓度的Licraside干预细胞24h和 72h后,加MTT溶液(5mg/mL)10μL干预4h后,吸弃上清,加100μLDMSO,振荡溶解,于490nm处测定吸光度值。
结果如图5所示,以不同浓度的licraside干预HepG2细胞24h和72h后,均未影响HepG2 细胞的生存率,说明未对HepG2细胞显示出明显毒性,结果表明,本发明所述的Licraside 具有良好的安全性。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
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