CN110237114B

CN110237114B - 去氢双松柏醇在制备抗肝损伤的药物中的应用

Info

Publication number: CN110237114B
Application number: CN201910639526.7A
Authority: CN
Inventors: 陈敏; 廖志华; 魏小东; 马英雄
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: CN110237114A

Abstract

本发明涉及去氢双松柏醇(Dehydrodiconify alcohol)或以去氢双松柏醇为主要有效成分的波棱瓜子乙酸乙酯提取物的制备方法及在预防或治疗肝损伤保护的药物中的应用。其提取方法如下：波棱瓜子粉碎后用乙醇提取，将提取液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩成浸膏。本发明通过实验发现去氢双松柏醇可显著逆转ANIT诱导的胆汁淤积SD大鼠血清中ALT和AST等肝功能水平升高、胆汁流量降低、肝脏病变，具有显著肝损伤保护作用；且主要是基于激活FXR靶点调节其下游基因表达而发挥作用。这种发明拓宽了去氢双松柏醇及波棱瓜子乙酸乙酯提取物的应用范围，对于开发FXR激动药物或肝损伤保护药物具有重要的应用价值和经济效益。

Description

去氢双松柏醇在制备抗肝损伤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药单体化合物，具体涉及去氢双松柏醇或主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物在制备抗肝损伤的药物中的应用。

背景技术

现代医学的胆汁淤积(Cholestasis)是指各种原因造成肝内胆汁形成、分泌和(或)排泄障碍，导致胆汁不能正常流入十二指肠从而反流入血液循环中的病理状态。临床可表现为瘙痒、乏力、尿色加深和黄疸等，还可以引起血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、胆红素等指标急剧升高且肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)及过氧化氢酶(CAT)等指标也显著升高。肝内胆汁淤积简称淤胆性肝炎是肝病临床中最常见的，有多种原因引起，如化学药物、病毒、自身免疫和妊娠等引起肝细胞和(或)毛细胆管内胆汁形成、分泌和排泄障碍而导致该病的发生。为了深入研究肝内胆汁淤积作用机制，利用α-萘异硫氰酸酯(alpha-naphthyl-isothiocyanate，ANIT)作为可逆的急性肝内胆汁淤积动物模型，操作简便，重复性好且与人在临床的生化和病理改变极为相似，因此成为经典的肝内胆汁淤积动物模型。其中大多数胆汁淤积疾病的发生主要是由于胆汁酸的合成、转运及代谢障碍使肝细胞内胆汁酸过多而引发的肝损伤。当前对于胆汁淤积的治疗尚无特别有效的手段，药物也十分缺乏。临床治疗主要有熊去氧胆酸(UDCA)、糖皮质激素和奥贝胆酸(OCA)等药物，其中UDCA和OCA是当前治疗淤胆疾病公认的药物。UDCA对妊娠性胆汁淤积、出生婴儿黄疸性胆汁淤积及其它类型的胆汁淤积等具有良好的治疗作用。虽然UDCA可较好的保护肝细胞防止胆汁淤积对肝细胞造成损伤。但是，仍约40％的原发性胆汁性胆管炎(PBC)的病人对UDCA应答欠佳或无法耐受。2016批准OCA作为法尼醇X受体的激动剂在多项关于PBC临床治疗的研究中显示出良好的效果，可明显降低患者的AST、ALT、ALP和TBIL等各项肝生化指标水平，而这些研究成果进一步支持FDA批准OCA用于PBC患者的治疗。但是，随着OCA剂量的增加瘙痒症状也随之加重。因此，急需研发高效低毒廉价无副作用的药物治疗。

波棱瓜子为葫芦科(Cucurbitaceae)波棱瓜属植物波棱瓜(Herpetospermumpedunculosum)的干燥成熟种子，是《中国药典》收载的常用中药之一，藏医学著作《月王药诊》中记载具有泻肝火胆热，解毒的功效。《四部医典》记载波棱瓜子味苦，主治赤巴病。《晶珠本草》记载波棱瓜子性凉、锐，治赤巴入肺腑。研究表明波棱瓜子在藏医临床用于治疗“赤巴病”疗效确切。“赤巴病”失调会造成发热、眼睛面色以及小便发黄、上腹胀满、食欲不振、皮肤瘙痒等症状，并认为“赤巴病”是由于胆汁过量失调产生热能、赤巴逃窜流它处、胆汁外溢和胆汁顺脉逃逸等原因引起。我们认为“赤巴病”部分临床可用肝内胆汁淤积进行解释。因此，选取肝内胆汁淤积引起的肝损伤作为“赤巴病”的临床适应症进行研究。据报道，波棱瓜子中化学成分主要为木脂素、香豆素和脂肪酸的提取物具有保肝活性。其，但是有关波棱瓜子中的木脂素去氢双松柏醇(Dehydrodiconify alcohol)保肝活性未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种去氢双松柏醇或主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物在制备抗肝损伤的药物中的应用，为肝损伤的治疗提供了新的治疗药物，同时拓宽了去氢双松柏醇的应用范围。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明的目的之一在于提供去氢双松柏醇或主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物在制备肝损伤保护的药物中的应用。

优选的，所述主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物为波棱瓜子乙酸乙酯部位提取物。

优选的，所述主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物由以下方法制备：用体积分数为95％的乙醇渗漏提取，合并提取液，将提取液用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压浓缩成浸膏。

本发明的目的之二在于提供去氢双松柏醇或主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物在制备提高肝细胞存活率的药物中的应用。

本发明的目的之三为在于提供去氢双松柏醇或主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物在制备下调肝损伤细胞或肝损伤动物肝功能指标的表达量的药物中的应用，所述肝功能指标为AST、ALT、ALP、γ-GT、TBIL、DBIL和TBA。

本发明的目的之四为在于提供去氢双松柏醇或主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物在制备促进肝损伤动物胆汁流量和改善肝脏组织病理状态的药物中的应用。

本发明的目的之五为在于提供去氢双松柏醇或主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物在制备激活法尼酯衍生物X受体的药物中的应用。

本发明的目的之六为在于提供去氢双松柏醇或主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物在制备下调肝损伤细胞或肝损伤动物中FXR下游与胆汁酸合成相关的基因CYP7A1和CYP27A1，或上调肝损伤细胞或肝损伤动物中FXR下游与胆汁酸合成相关的基因SHP和与胆汁酸转运相关的基因BSEP、MRP2、NTCP的药物中的应用。

本发明的目的之七为在于提供去氢双松柏醇或主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物在制备下调肝损伤细胞或肝损伤动物中FXR下游与胆汁酸合成相关的蛋白CYP7A1和CYP27A1，或上调肝损伤细胞或肝损伤动物中FXR下游与胆汁酸合成相关的蛋白SHP和与胆汁酸转运相关的蛋白BSEP、MRP2、NTCP的药物中的应用。

本发明中肝损伤细胞为固甾酮诱导的L-02细胞，肝损伤动物为ANIT诱导的SD大鼠。

本发明的有益效果在于：本发明公开了氢双松柏醇或主要有效成分为去氢双松柏醇的提取物在制备FXR激动药物和肝损伤保护药物中的应用，本发明首次发现了去氢双松柏醇具体基于FXR激动作用的肝损伤保护活性。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1显示了去氢双松柏醇对L-02细胞存活率的测定(A：去氢双松柏醇处理L-02细胞生存曲线；B：不同浓度处理去氢双松柏醇对L-02细胞存活率；C：空白对照观察图；D：去氢双松柏醇处理L-02细胞结果图)。

图2显示了去氢双松柏醇对ANIT诱导大鼠肝损伤模型中大鼠肝功能血清生化指标的影响(A：ALT，B：AST，C：ALP，D：GGT/γ-GT，E：TBIL，F：DBIL，G：TBA。图中Control为空白组，Model为模型组，UDCA为阳性药熊去氧胆酸100mg/kg，Low为去氢双松柏醇低剂量组10mg/kg，Medium为去氢双松柏醇中剂量组20mg/kg，High为去氢双松柏醇高剂量组40mg/kg。与空白组比较：+p<0.05，++p<0.01；与模型组相比*p<0.05，**p<0.01)。

图3显示了去氢双松柏醇治疗后大鼠胆汁流量的变化：图中Control为空白组，Model为模型组，UDCA为阳性药熊去氧胆酸100mg/kg，Low为去氢双松柏醇低剂量10mg/kg，Medium为去氢双松柏醇中剂量组20mg/kg，High为去氢双松柏醇高剂量组40mg/kg。与空白组比较：+p<0.05，++p<0.01；与模型组相比*p<0.05，**p<0.01。

图4显示了去氢双松柏醇治疗后大鼠肝组织病理切片的变化：图中Control为空白组，Model为模型组，UDCA为阳性药熊去氧胆酸100mg/kg，Low为去氢双松柏醇低剂量组10mg/kg，Medium为去氢双松柏醇中剂量组20mg/kg，High为去氢双松柏醇高剂量组40mg/kg。与空白组比较：+p<0.05，++p<0.01；与模型组相比*p<0.05，**p<0.01。

图5显示了去氢双松柏醇对固甾酮诱导L-02细胞损伤模型中胆汁酸合成和转运相关基因的影响(图中Control为空白组，Model为模型组，GW4064为阳性药6μmol/L，Low为去氢双松柏醇低剂量组25μmol/L，Medium为去氢双松柏醇中剂量组50μmol/L，High为去氢双松柏醇高剂量组100μmol/L。与空白组比较：+p<0.05，++p<0.01；与模型组相比*p<0.05，**p<0.01)。

图6显示了去氢双松柏醇给药后L-02细胞中胆汁酸合成、转运及炎症相关蛋白的影响(图中Control为空白组，Model为模型组，GW4064为阳性药6μmol/L，Low为去氢双松柏醇低剂量组25μmol/L，Medium为去氢双松柏醇中剂量组50μmol/L，High为去氢双松柏醇高剂量组100μmol/L。与空白组比较：+p<0.05，++p<0.01；与模型组相比*p<0.05，**p<0.01；A：电泳结果；B：灰度统计)。

图7显示了去氢双松柏醇治疗后大鼠肝组织中胆汁酸合成、转运及炎症相关蛋白的影响(图中Control为空白组，Model为模型组，UDCA为阳性药熊去氧胆酸100mg/kg，Low为去氢双松柏醇低剂量组10mg/kg，Medium为去氢双松柏醇中剂量组20mg/kg，High为去氢双松柏醇高剂量组40mg/kg。与空白组比较：+p<0.05，++p<0.01；与模型组相比*p<0.05，**p<0.01；A：电泳结果；B：灰度统计)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、去氢双松柏醇的制备

去氢双松柏醇的制备方法，具体步骤如下：将波棱瓜子粉碎后用体积分数为95％的乙醇浸泡24小时，采用渗漏提取5～6次，合并提取液，将提取液分别用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇有机溶剂先后萃取，各萃取3次，分别合并依次得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液，减压浓缩成不同提取部位浸膏。取乙酸乙酯萃取物192g，用等重的硅胶(100～200目)拌样，烘干后，干法上样。氯仿：甲醇(20：80)洗脱流分进行硅胶柱层析，用氯仿：丙酮70：30洗脱，洗脱流分中有晶体析出，经过重结晶得到该化合物为去氢双松柏醇。

去氢双松柏醇鉴定：淡黄色针状结晶(氯仿)，HR-ESI-MS推知其分子量为358分子式为C₂₀H₂₂O₆。m.p.129～131℃；UVλmax(CH₃OH)nm：219，278；IR(KBr)cm-1:3312，3050～3000，1649，1618，1598，1323～1031，960，854，815，740；ESI-MS m/z：397.13[M+K]⁺，¹H-NMR(CDCl3,500MHZ)：6.91(1H,s,H-6′)，6.88(4H,m,H-2,H-2′,H-5,H-6)，6.55(1H,d,J＝16.0Hz,H-7′)，6.23(1H,dt,J＝16.0Hz,6.0HZ,H-8′)，5.68(1H,s,-OH)，5.57(1H,d,J＝7.5Hz,H-7)，4.29(2H,d,J＝16.0Hz,H-9′)，3.97(2H,m,H-9)，3.90(3H,s,OCH3)，3.88(3H,s,OCH3)，3.61(1H,m,H-8)。

实施例2、化合物去氢双松柏醇对固甾酮诱导的L-02细胞的保护作用

1、去氢双松柏醇对L-02细胞存活率的测定

将浓度为25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的去氢双松柏醇分别加入到L-02细胞共培养24小时后，加入MTT(20μL，0.5mg/mL)在37℃，5％的CO₂培养箱中孵育4小时后弃去MTT，各孔加入PBS清洗1次后加入100μL DMSO溶解甲臜，放置于酶标仪中震荡10分钟，在570nm波长下测定吸光度，结果如图1所示。以空白组吸光度作为参考，细胞生存率为100％，其它各组吸光度值与空白组吸光度值比较得其生存率。结果显示，去氢双松柏醇能够浓度低于50μmol/L的去氢双松柏醇能提高L-02细胞的存活率。

2.体外去氢双松柏醇对固甾酮诱导的L-02细胞活性筛选

(1)mRNA水平FXR、SHP、CYP7A1、CYP27A1、BSEP、MRP2和NTCP基因表达的测定

1、固甾酮(50μmol/L)与L-02细胞共培养24小时后，分别加入激动剂GW4064 6μmol/L、去氢双松柏醇低剂量25μmol/L、中剂量50μmol/L和高剂量100μmol/L药物再孵育24小时。将培养皿中的L-02细胞用RNA提取试剂盒进行RNA的提取，用荧光定量PCR仪测定FXR、SHP、CYP7A1、CYP27A1、BSEP、MRP2和NTCP 8个基因的表达，结果如图5所示。结果显示，去氢双松柏醇能够上调FXR、SHP、BSEP、MRP2、NTCP、CYP7A1和CYP27A1基因表达，其中随着浓度升高FXR、SHP、BSEP、MRP2、NTCP表达量升高，CYP7A1和CYP27A1基因表达随浓度升高而降低。

(2)FXR、SHP、CYP7A1、CYP27A1、BSEP、MRP2和NTCP蛋白表达的影响

固甾酮(50μmol/L)与L-02细胞共培养24小时后，分别加入激动剂GW4064(6μmol/L)、去氢双松柏醇低剂量(25μmol/L)、中剂量(50μmol/L)和高剂量(100μmol/L)药物再孵育24小时。加入蛋白裂解液裂解30分钟，离心后取上清液得到蛋白。将提取到的蛋白进行BCA蛋白浓度的测定，测定浓度后用4X蛋白上样缓冲液进行各组蛋白定量。其次将各组蛋白加入到10％SDS-PAGE分离胶和5％浓缩胶上分离2小时后，在90mA的恒流作用下转膜90分钟，用5％脱脂牛奶封闭2小时，分别用FXR、SHP、CYP7A1、CYP27A1、BSEP、MRP2和NTCP的一抗和二抗进行特异性反应。最后在ECL显影仪照射下进行曝光，用Image 6软件进行蛋白灰度分析，结果如图6所示。结果显示，去氢双松柏醇能够上调FXR、SHP、BSEP、MRP2、NTCP、CYP7A1和CYP27A1蛋白表达，其中FXR、SHP、BSEP、MRP2、NTCP、上调表达明显。

实施例3、化合物去氢双松柏醇抗ANIT诱导的SD大鼠急性肝损伤作用及机制研究

1、动物分组、造模、给药方法

取SD大鼠48只，按随机分配原则分为6组，每组8只：正常对照组，模型组ANIT(异硫氰酸-A-萘酯，60mg/Kg)，阳性药UDCA组(100mg/kg)，去氢双松柏醇低剂量组(10mg/kg)，去氢双松柏醇中剂量组(20mg/kg)和去氢双松柏醇高剂量组(40mg/kg)，放置于西南大学药学院动物清洁房中适应性饲养7天后灌胃给药。除正常对照组和模型组大鼠每日灌胃等量CMC-Na溶液外，其余各组大鼠按照各自剂量连续灌胃4天。第5天日除正常对照组的大鼠一次性灌胃等量橄榄油外，其余各组大鼠一次性灌胃ANIT橄榄油溶液(60mg/kg)造模，造模前后12h禁食不禁水，以保证造模药充分吸收，造模后继续按照各组相应剂量继续给药，正常对照组和模型组仍然灌胃等量CMC-Na溶液。

收集血清：将大鼠按压在手术操作台面上，固定住大鼠头部，紧握其颈部，使大鼠眼突出，眶后静脉丛充血。之后用毛细管从眼眶后静脉取血，接于EP管中。取血完成后立即除去颈部压力，将毛细管从眼眶中拔出，按压止血。

收集胆汁：用20％乌拉坦溶液对大鼠进行腹腔注射，麻醉后固定于手术台上，行胆管插管引流术，用PE-10插管插入胆管内，见有黄色胆汁顺利流出插管后用手术线固定，稳定15min后用EP管收取胆汁120min，用于计算胆汁流速。

收集肝脏：待胆汁样本收集完毕后，脱椎处死大鼠，并迅速取出肝脏于4℃生理盐水洗净分为两部分，一部分保存于-80℃冰箱用于抗肝损伤作用机制研究，一部分固定于4％多聚甲醛溶液中待肝组织病理切片检查。

2、血清生化指标的测定

将收集得到的SD大鼠血液于室温下放置30min后，台式冷冻离心机4℃5000r/min分离得到上层血清。日立HITACHI 7600-020全自动分化分析仪测定血清中AST、ALT、ALP、γ-GT、TBIL、DBIL和TBA，结果如图2所示。结果显示，去氢双松柏醇能够降低ANIT小鼠AST、ALT、ALP、γ-GT、TBIL、DBIL和TBA的表达量。

3、胆汁流量的测定

将接受胆汁的EP管预先称重并编号，按照规定时间间隔收集胆汁，胆汁量用差重法求得：胆汁量(μL)＝[含胆汁EP管质量(g)-预先称重空白EP管质量(g)]*1000，且根据所得数据计算胆汁流量，结果如表1和图3所示。

表1、不同时间间隔胆汁流量

结果显示，去氢双松柏醇能够提高ANIT小鼠的胆汁流量。

4、肝组织病理切片检查

肝脏组织于4％多聚甲醛固定24～36h后，取出标本并洗去固定液，切取合适大小标本厚度(0.2cm左右)进行包埋。将包埋好的蜡块先放入苏木素染液中染细胞核，其次使用伊红染色，最后使用中性树胶封片，即可在普通显微镜下观察肝组织病理形态并拍照，结果如图4所示。结果显示，去氢双松柏醇能够抗ANIT小鼠的肝损伤。

5、核受体(FXR)与胆汁酸合成相关蛋白通路研究

将保存于-80℃冰箱中的大鼠肝脏组织取出化冻，生理盐水洗净。首先用剪刀剪碎后用置于EP管中称重。其次用组织匀浆机处理后，台式冷冻离心机4℃1000r/min分离得到肝组织匀浆上清液。按照BCA蛋白浓度试剂盒说明书操作，在562nm波长下测定吸光度，最后根据公式计算得出肝脏组织中蛋白的浓度。

将制备好的蛋白样本采用Western Blot检测蛋白FXR、SHP1、SHP2、CYP7A1和CYP27A1的表达，并利用ImageJ软件分析蛋白灰度值，结果如图7所示。结果显示，FXR、SHP1、SHP2较模型小鼠表达量升高，CYP7A1和CYP27A1较模型小鼠表达量降低。

6、核受体(FXR)与胆汁酸转运相关蛋白通路研究

采用Western Blot检测蛋白FXR、BSEP、MRP2和NTCP的表达，并利用ImageJ软件分析蛋白灰度值，结果如图7所示。结果显示，去氢双松柏醇处理ANIT小鼠FXR、BSEP、MRP2和NTCP较模型小鼠表达量升高。

7、核受体(FXR)与炎症信号通路相关研究

采用Western Blot检测蛋白FXR、SIRT1、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的表达，并利用ImageJ软件分析蛋白灰度值，结果如图7所示。结果显示，去氢双松柏醇处理ANIT小鼠FXR、TNF-α、IL-1β和IL-6较模型小鼠表达量降低，IL-10较模型小鼠表达量升高。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.去氢双松柏醇在制备治疗淤胆性肝炎的药物中的应用。